CN103520712B

CN103520712B - 基于组织因子的肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103520712B
Application number: CN201310406005.XA
Authority: CN
Inventors: 刘文涛; 吴雪丰; 徐礼友; 杨政
Original assignee: Nanjing Hai Zhi Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: JIANGSU HIGH-WIT BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2033-09-09
Also published as: CN103520712A

Abstract

本发明公开了一种基于组织因子的肿瘤多肽疫苗，为将人源TF基因中的包含表位靶点的序列片段表达后形成的AnsB-TF融合蛋白。还公开了该肿瘤多肽疫苗的制备方法和应用。该本发明通过基因工程手段将包含表位靶点的TF多肽片段与AnsB载体相连，获得了一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗。该疫苗通过对TF表位靶点的主动免疫获得对肿瘤的预防和治疗作用。这种主动免疫不但能完全阻断TF在肿瘤表面的效应，还避免了多次给药的麻烦。

Description

基于组织因子的肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽疫苗、制备方法及其应用，尤其是一种肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

组织因子(tissue factor, TF) 的凝血功能众所周知，它与活化凝血因子Ⅶ(activated factor Ⅶ, F Ⅶa) 结合后，形成TFPF Ⅶa复合物，启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子Ⅺ，启动内源性凝血系统。它是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用。然而，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋白，是否具有受体特性并具备非凝血功能，逐渐成为众多学者关注的焦点。近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。

以组织因子作为靶点来治疗肿瘤是现在肿瘤研究中的一个热点。最直接的优点就是靶向性好。正常的生理条件下，TF一般不外露，只有在肿瘤血管内皮和肿瘤细胞中才特异性表达升高。这就为肿瘤的靶向免疫治疗提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能带来全身性的凝血功能障碍。

国外学者以组织因子为靶点，进行免疫治疗，最有成就的进展是HU和Garen将免疫球蛋白G1（IgG1）的Fab段换作凝血因子VII（FVII），即TF的天然配基，同时突变FVII的341密码子：从赖氨酸AAG突变为丙氨酸GCC，使二者结合以后的促凝活性部分丧失。结果发现具有良好的抗肿瘤作用。但是，他们以TF全蛋白作为靶点，用抗体或FVII进行治疗，存在着蛋白质结构复杂、工艺难度大、易引发机体过敏反应等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于组织因子的肿瘤多肽疫苗，其活性成分为将人源TF基因中的包含表位靶点的DNA序列片段表达后形成的门冬酰胺酶（AnsB）-TF表位靶点融合蛋白，其中包含的TF表位靶点多肽片段为位于TF蛋白表面的易引起免疫反应的多肽片段。

进一步的，所述TF表位靶点多肽片段的序列为：GDWKSKCFYTTDTECDLTDE（SEQ ID NO：1）。

进一步的，所述疫苗在AnsB的C端加入一个25肽的破伤风毒素T细胞辅助表位TTP作为支臂，在TTP之后又加了一个3肽的柔性接头Ser-Gly-Thr，TF表位靶点多肽片段接于柔性接头后，形成AnsB-TTP -TF的结构，其序列见SEQ ID NO：2。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗的制备方法，其步骤包括：将人源包含TF表位靶点的DNA序列片段插入AnsB下游，获得相应的重组基因工程菌；重组基因工程菌经发酵后在大肠杆菌中表达出AnsB-TF表位靶点融合蛋白，经纯化后得到基于组织因子的肿瘤多肽疫苗。

进一步的，其步骤包括：

（1）用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后加入人源TF基因中的包含表位靶点的DNA序列，获得AnsB-TTP-TF序列；

（2）构建重组质粒pET28-ansB-TTP-TF；

（3）将重组质粒pET28-ansB-TTP-TF转化到感受态的大肠杆菌中，经筛选后的阳性菌活化培养；

（4）裂解菌体后分离提纯，得到AnsB-TF表位靶点融合蛋白。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗在制备预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌药物中的应用。

通常，多肽疫苗免疫原性较弱，本发明通过基因工程手段将包含表位靶点的TF多肽片段与AnsB载体相连，获得了一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤多肽疫苗。该疫苗通过对TF表位靶点的主动免疫获得对肿瘤的预防和治疗作用。这种主动免疫不但能完全阻断TF在肿瘤表面的效应，还避免了多次给药的麻烦。

为获得有酶活性的融合蛋白，本发明将TF表位靶点多肽片段融合于AnsB的C端而非N端。为增强TF表位的免疫原性，在AnsB和TF之间加入了一个25肽的破伤风毒素T细胞辅助表位TTP作为支臂。为保持连接于TTP之后的TF在结构上的柔韧性，在TTP之后又加了一个3肽的柔性接头Ser-Gly-Thr，TF接于其后。这些优化设计有利于AnsB-TF融合蛋白在大肠杆菌的周质中形成可溶性表达且具有催化活性的嵌合酶分子。

附图说明

图1 ：基于组织因子的肿瘤多肽疫苗重组质粒pET28-ansB-TTP-TF的构建过程。

图2： SDS-PAGE电泳图，显示AnsB-TTP-TF的融合表达。其中1 泳道为marker，2-8 泳道为不同时间点（0, 2, 4, 5, 6, 7, 8 小时）AnsB-TTP-TF融合蛋白的表达情况。

图3：AnsB-TTP-TF融合蛋白沉淀、梯度洗脱后的纯化图谱。

图4： ELISA测定结果图，显示AnsB-TTP-TF融合蛋白能诱发小鼠产生抗TF抗体。

图5： AnsB-TTP-TF融合蛋白对小鼠黑色素瘤瘤重的抑制效果图。

图6 ：病理组织切片图，显示AnsB-TTP-TF融合蛋白对小鼠黑色素瘤的抑制作用。

具体实施方式

实施例一：载体构建

1.1 AnsB-TTP-TF基因的克隆

AnsB-TTP序列来自于本实验室已有的质粒载体。用加端PCR的方法在AnsB-TTP序列后分两步加入TF基因，就可获取AnsB-TTP-TF序列：

设计共同的上游引物为:

A1：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TA - 3’ （SEQ ID NO：3）

下游引物为：

TF-down

第一步下游引物TF-1：5’- T GTC AGT AGT GTA GAA GCA TTT GGA TTT CCA GTC ACC GGT ACC AGA AGA GAT TAC AGA C-3’ （SEQ ID NO：4）

第二步下游引物TF-2：5’- AAA AAGC TTA ACC GGT TTC GTC AGT CAA GTC GTA TTC AGT GTC AGT AGT GTA GAA GCA T-3’ （SEQ ID NO：5）

上游引物下游含有限制性核酸内切酶NcoI位点，第二步下游引物含有限制性核酸内切酶HindⅢ位点。

上、下游引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR反应体系：

TF cDNA 2 μl

10×PFU PCR buffer 10 μl

上游引物 8 μl

下游引物 8 μl

dNTP 8 μl

PFU DNA Polymerase 1 μl

ddH₂O 63 μl

总计 100 μl

设定PCR反应条件：

Group 1: 94 ⁰C 2 min

Group 2: 94 ⁰C 30 sec

60 ⁰C 30 sec

72 ⁰C 2 min

Group2进行30个循环后进入Group3

Group3: 72 ⁰C 10 min

Group4: 4 ⁰C 10 min

第一步PCR反应，加入上游引物A1和第一步下游引物TF-1。

得到第一步产物AnsB-TTP-TF－STEP-1。然后用得到的第一部产物为模板，加入上游引物A1和各自的第二步下游引物TF-2。进行第二步PCR反应PCR产物再次进行纯化回收。就可获取AnsB-TTP-TF序列：

PCR产物的双酶切：

Buffer Y+ （Takara） 5 μl

AnsB-TTP-TF 30 μl

HindⅢ（Takara） 1 μl

Nco I （Takara） 1 μl

ddH₂O 14 μl

总计 50 μl

37 ⁰C反应4h。

酶切反应结束后，其产物进行1%琼脂糖电泳，切下1200 bp左右位置处的琼脂胶，用上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒进行DNA回收，按试剂盒的纯化操作手册上的步骤进行。

的酶切

Buffer Y^＋ 10 μl

BSA 10 μl

pET28ansB-TTP-CETP质粒 40 μl

Hind Ⅲ（Takara） 2 μl

Nco I （Takara） 2 μl

ddH₂O 36 μl

总计 100 μl

37 ⁰C反应4h。

酶切后切胶回收大片段载体部分，即得到Hind Ⅲ 和NcoⅠ酶切好的pET28载体。

连接

连接体系为：

10×T4 ligase Buffer 2 μl

AnsB-TTP-TF 5 μl

pET28 5 μl

T4 ligase（Takara） 1 μl

ddH₂O 7 μl

Total 20 μl

4℃，连接过夜。

载体构建示意图如附图1所示。

实施例二：转化和筛选

2.1 感受态转化

取上述5 μl的连接液转化感受态的大肠杆菌BL21（DE3）（制备方法参照《分子克隆实验指南第三版》）后，卡那霉素初筛阳性菌再经由酶活力测定筛选，阳性克隆提取质粒作为模板，以T7启动子作为上游引物，以TF-2作为下游引物，表达载体pET28ansB-TTP-TF，PCR条件同实施例一1.1；两种筛选方法皆是阳性的克隆最后由DNA序列测定来确证AnsB-TTP基因的正确插入。

门冬酰氨酶酶活定性检测

门冬酰氨酶酶活定性检测方法选用萘氏法：（硼酸缓冲液：H₂BO₃ 0.682g，Na₂B₄O₇.10H₂O 0.855g，加蒸馏水至100 ml，pH8.4；萘氏试剂：KI 10 g，HgI2 13.5 g，加蒸馏水至100 ml，临用前用25% NaOH等量混合；底物溶液：0.4 M L-天门冬酰氨；终止试剂：15%三氯乙酸（TCA）溶液）。96孔酶标板，每孔加入50 μl pH8.4硼酸缓冲液和50 μl 0.4 M的L-天门冬酰氨反应液，用灭菌后的枪头吸取20-30 μl的菌液（或门冬酰氨酶溶液），然后移于反应液中，37℃反应20 min，，接着每孔加入50 μl的萘氏试剂显色。阴性对照不加菌液（或门冬酰氨酶溶液）。中等活性显橙色，高活性显砖红色。分别以含有质粒pET28-ansB和pKA的菌株为阳性和阴性对照。

挑取阳性重组子的对应单菌落于液体LB培养基，37 ⁰C摇床培养7-10 h。培养物甘油管保存（方法参见：J.萨姆布鲁克等. 分子克隆实验指南（第三版）科学出版社），送上海博亚生物技术有限公司进一步测序验证。

实施例三：融合蛋白的表达和纯化

3.1 pET28ansB-TTP-TF的工程菌扩增

将筛选后得到的阳性工程菌分别活化，取一环菌，30℃振荡培养过夜，按1%的接种量接种到新鲜的含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养。转接后培养3.5小时，加入培养体积1%的0.5 M乳糖溶液诱导，使培养液中乳糖的终浓度达到5mM，再继续28℃培养4 h后，于5000 rpm离心10 min，收集菌体。

菌体的裂解

裂解缓冲液：10 mM 磷酸缓冲液（PB，pH8.0），1 mM EDTA。每克菌按5 ml加裂解缓冲液，另加入80 μl溶菌酶（10 mg/ml），20 μl DNAase I（1 mg/ml），，于37℃裂解1 h。4⁰C ，10000 rpm，15 min，上清和沉淀分别取样，共得上清液350 ml。12%SDS-PAGE电泳检测结果表明有20%左右的嵌合酶以可溶性方式存在于上清液中，同时酶活定性检测显示上清液活力很高。

裂解上清夜的处理

4⁰C时，进行饱和硫酸铵分级沉淀，上清和沉淀分别留样。12%SDS-PAGE电泳检测结果，探索硫酸铵饱和度。结果发现，用60％饱和度硫酸铵可以去处大部分杂质，再用90％硫酸铵沉淀得到目标蛋白粗品。以蛋白粗品进行SDS-PAGE电泳，结果如附图2所示，随时间增加（0-8小时），转化后的大肠杆菌BL21中产生了越来越多的目标蛋白AnsB-TTP-TF（40 kD左右）。

将90％饱和度硫酸铵沉淀物用100 ml，10 mM，PH=8.0 Tris-Cl缓冲液重新溶解后，置于预先处理过的透析袋（透过蛋白质分子量最大为40 kDa）中，于10 mM，PH=8.0的Tris-Cl缓冲液对其4℃透析，每8 h换一次透析液，共透析48 h。4⁰C，10000 rpm，20 min离心，以去除沉淀。

阴离子交换柱层析

由于AnsB-TTP-TF的理论等电点分别为pH 5.22，缓冲液的pH值为7.4，高于理论等电点，因此选用阴离子交换介质。将处理后的Cellulose-DEAE 52装柱（2.6×20 cm柱体积50 ml）后用20 mM，PH=7.4的Tris-Cl缓冲液平衡备用。将透析后的溶液用蠕动泵加入Cellulose-DEAE 52离子交换柱中，上样流速为1 ml/min，280 nm检测，收集流出液，取样，备15% SDS-PAGE检测。0-300 mM NaCl溶于20 mM的PB（pH7.4）各250 ml用于梯度洗脱，洗脱液流速为1 ml/min，收集各洗脱峰，将各峰对应的收集管中液体合并，并进行酶活检测，弃去无酶活的洗脱峰。

分子筛层析

G-100柱（2.6×100 cm）用5 mM，PH=8.0的Tris-Cl缓冲液（即上样缓冲液）平衡。

上步得到的含酶活洗脱峰经冷冻干燥浓缩后上柱，继而以5 mM，PH=8.0的Tris-Cl缓冲液洗脱，洗脱液流速1ml/min，用自动收集仪收集各洗脱峰，将各峰对应的收集管中液体合并，并进行酶活检测，弃去无酶活的洗脱峰。

酶活洗脱峰经冷冻干燥浓缩后，即得到纯化的嵌合酶。洗脱峰见附图3所示。将不同洗脱成分分别收集鉴定，确定目标蛋白AnsB-TTP-TF。本试验中选用了Sephadex-G-100进行分子筛层析，其分离范围是4000-150000。洗脱液中有酶活的峰有两个，推测先出的酶活峰是四聚体（分子量约160000）或多聚体（>160000），后出的酶活峰是单体（分子量约40000），证明溶液中存在多种聚集状态的酶分子。至此，嵌合酶得到了有效的分离纯化。

纯化后的重组门冬酰胺酶 AnsB-TTP-TF酶活力的定量测定

采用萘氏法测定酶活力，具体操作如下：在96孔酶标板中，每孔加入50 μl硼酸缓冲液，25 μl AnsB-TTP-TF溶液（4 μg/μl）或AnsB溶液（4 μg/μl），25 μl L-Asn溶液（0.4 M），37℃反应15 min，加入50 μl 15%三氯乙酸终止反应。吸取上述反应液12.5 μl，加入87.5 μl双蒸水和25 μl萘氏试剂，于OD₅₀₀测各孔光密度值。

酶活=(OD₅₀₀×952.4/X) × (3+X/1000)

X在酶活较低时建议取20以上，酶活高时建议取5-10。纯化后的AnsB-TTP-TF嵌合酶的活力经萘氏法检测可以保持天然酶AnsB 70％以上活力。

实施例四：ELISA测定多肽疫苗AnsB-TTP-TF能诱发小鼠产生抗TF抗体

4.1 材料

动物：C57/BL6纯系小鼠，雌性，6－8周龄，免疫前平均体重为16.8g，购自扬州大学实验动物中心。

实验药物：重组蛋白疫苗AnsB-TTP-TF。

材料及试剂：纯化的重组蛋白 VEGF-TF。

方法

4.2.1 免疫方案

选用C57BL/6J雌性小鼠，随机分组，每组10只，分别为生理盐水对照组，AnsB载体对照组，AnsB-TTP-TF组。生理盐水对照组在每只小鼠两后肢股四头肌处分多点各注射100 μl生理盐水；多肽疫苗溶与灭菌生理盐水配成1μg/μl，与等体积弗氏佐剂混匀后，每只小鼠腹股沟皮下注射100 μl，即每只动物50 μg。初次给药选取弗氏完全佐剂，后续免疫选取弗氏不完全佐剂。

免疫程序为0周、2周和4周各免疫一次，每次免疫时接种方法及剂量相同。自第2周至第8周的10周内每隔2周取血一次，共取血4次，采用眼眶内眦取血，每次血量为0.5-0.8 ml，离心取血清，-20℃冷冻保存备用。

抗体的ELISA检测

96孔酶标板，每孔中加入100 μl VEGF-TF溶液(溶于包被稀释液，1 μg/μl)，4℃包被过夜。弃去包被液，加入5% BSA(pH 7.4 PBS配制)封闭液，4℃满孔封闭过夜。弃去封闭液，每孔加入5%BSA封闭液稀释的、稀释倍数为1：100的小鼠血清100 μl，37℃孵育1 h。弃去血清，每孔用PBST满孔洗涤，每次3 min，共洗涤6次。洗涤后，每孔加入用5% BSA封闭液稀释、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG二抗(武汉博士德公司产品)100 μl，稀释倍数为1：20000，37℃孵育1 h。弃去二抗液，每孔用PBST满孔洗涤，每次3 min，共洗涤6次。洗涤后，每孔加入100 μl底物液(由底物液A和B等体积配置)。37℃反应30 min，加入2 mol/L H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定每孔的A_450nm。

ELISA检测结果判断：标本A_450nm≥0.1，而且标本A_450nm至少为阴性对照A_450nm两倍数值的为阳性，否则为阴性。阴性对照A_450nm低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际A_450nm计算。

检测结果如图4所示，小鼠给予AnsB-TTP-TF后，与生理盐水组和AnsB对照组相比，从第二周就可以在血中检测到抗体，且抗体水平较高。与此相比，对照组ELISA结果始终为阴性，没有检测到特异性的抗TF抗体。这说明TF多肽疫苗免疫后可以诱导小鼠产生常时间的高水平的抗体。

实施例五：重组TF亚单位抗原表位核酸疫苗抗肿瘤作用研究

5.1 肿瘤细胞培养及移植性肿瘤模型制备

5.1.1 材料

B16-F10 购自中科院细胞所，RPMI1640和DMEM培养基购自JIBCOL公司，C57/BL6小鼠购自扬州大学比较医学中心。

细胞培养与移植

B16-F10是C57/BL6背景的高转移性黑色素瘤株，也是贴壁生长的细胞，培养液为含10%小牛血清的DMEM培养基，将其接种于培养瓶中。5%CO₂条件下培养，细胞长成连续单层时，小心倾去培养基，用D-HANKS溶液轻轻荡洗后，倾去D-HANKS溶液，加入0.125%胰酶消化。倾去胰酶，立刻加入10%小牛血清的1640培养基终止消化，用生理盐水轻轻洗净残存培养基，用吸管仔细吹打，完全分散细胞后进行细胞计数。按5×10⁷个/只接种于小鼠背部皮下。整个实验过程从开始消化到接种入C57/BL6小鼠体内，得到荷瘤鼠。为保证细胞活力，从消化细胞到接种入体内，不要超过15 min。10天后，荷瘤鼠的瘤重达到1 g左右，处死动物，无菌条件下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水调整成1:3-1:4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针筒抽吸，混匀后，接种于C57/BL6小鼠右侧腋下，每只动物接种0.2 ml整个试验在20 min内完成。

肿瘤接种后10天后处死动物，分离肿瘤组织块称重，统计相关数据。

重组TF疫苗抗B16-F10黑色素瘤作用研究

雄性C57/BL6小鼠70只，体重14-16 g，随机分为3组：1.NS（im，100 μl/只），2. AnsB（sc，50 μg/只），3. AnsB-TTP-TF组（sc，50 μg/只）。

各组动物按预定免疫方案免疫八周，接种B16-F10肿瘤，14天后处死，称取瘤重，放入10％甲醛固定7天后，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察肿瘤浸润侵袭以及血管生成等情况。

处死动物，分离肿瘤时同样发现：与对照组相比，AnsB-TTP-TF组的肿瘤边缘清楚，包膜完整，而对照组未见到完整包膜。肿瘤重量统计表明，AnsB-TTP-TF免疫后，可以降低B16F10肿瘤的瘤重，抑瘤率为42.5％。如图5所示。

B16-F10病理切片结果：在黑色素B16F10细胞移植瘤模型中，NS和AnsB-TTP-TF组：皮下组织内肿瘤细胞呈巢团状,瘤体内有少许出血坏死，瘤体内血管生长旺盛,肿瘤细胞生长活跃，并明显向肌肉内及周边脂肪组织内浸润，肿瘤与肌肉分界不清。AnsB-TTP-TF组：皮下组织内瘤体中央及周边肿瘤细胞出现明显出血坏死，个别瘤体内肿瘤细胞大量坏死，仅残留血管。肿瘤与肌肉分界清楚，未见肿瘤细胞明显浸润肌肉组织。如图6所示。

<110> 南京海智生物工程有限公司

<120> 基于组织因子的肿瘤多肽疫苗、制备方法及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 20

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

GDWKSKCFYT TDTECDLTDE 20

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

MEFFKKTALA ALVMGFSGAA LALPNITILA TGGTIAGGGD SATKSNYTVG KVGVENLVNA 60

VPQLKDIANV KGEQVVNIGS QDMNDNVWLT LAKKINTDCD KTDGFVITHG TDTMEETAYF 120

LDLTVKCDKP VVMVGAMRPS TSMSADGPFN LYNAVVTAAD KASANRGVLV VMNDTVLDGR 180

DVTKTNTTDV ATFKSVNYGP LGYIHNGKID YQRTPARKHT SDTPFDVSKL NELPKVGIVY 240

NYANASDLPA KALVDAGYDG IVSAGVGNGN LYKSVFDTLA TAAKTGTAVV RSSRVPTGAT 300

TQDAEVDDAK YGFVASGTLN PQKARVLLQL ALTQTKDPQQ IQQIFNQYAD PCQYIKANSK 360

FIGITELIYS YFPSVISSGT TGDWKSKCFY TTDTEYDLTD ETG 403

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<212> DNA

<213> homo sapiens

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taatacgact cactata 17

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<212> DNA

<213> homo sapiens

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aaaaagctta accggtttcg tcagtcaagt cgtattcagt gtcagtagtg tagaagcat 59

Claims

1.一种基于组织因子的肿瘤多肽疫苗，其活性成分为将人源TF基因中的包含表位靶点的DNA序列片段表达后形成的AnsB-TTP -TF表位靶点融合蛋白，其中包含的TF表位靶点多肽片段为位于TF蛋白表面的易引起免疫反应的多肽片段，所述TF表位靶点多肽片段的序列为：GDWKSKCFYTTDTECDLTDE ，所述疫苗在AnsB的C端加入一个25肽的破伤风毒素T细胞辅助表位TTP作为支臂，在TTP之后又加了一个3肽的柔性接头Ser-Gly-Thr，TF表位靶点多肽片段接于柔性接头后，形成的AnsB-TTP -TF结构的序列见SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述的基于组织因子的肿瘤多肽疫苗在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。