CN103293322B

CN103293322B - 功能肽tps在特异性筛选内皮祖细胞中的应用

Info

Publication number: CN103293322B
Application number: CN201310205659.6A
Authority: CN
Inventors: 牛宝龙; 李文凤; 魏丽乔; 马森源; 高向华
Original assignee: Taiyuan University of Technology
Current assignee: Taiyuan University of Technology
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: CN103293322A

Abstract

一种功能肽TPS在特异性筛选内皮祖细胞中的应用，其内皮祖细胞特异性结合的多肽适配子TPS的氨基酸序列：TPSLEQRTVYAK；疏水蛋白rHFBI的氨基酸序列为：SNGNGNVCPPGLFSNPQCCATQVLGLIGLDCKVPSQNVYDGTDFRNVCAKTGAQPLCCVAPVAGQALLCQTAVGA；本发明提高了单位面积聚集内皮祖细胞的能力，增强了细胞支架对血清中其他因子的排斥能力，以及在有血清存在条件下对内皮祖细胞选择性吸附的能力。

Description

功能肽TPS在特异性筛选内皮祖细胞中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白融合生物技术，特别涉及一种内皮祖细胞特异性结合的功能多肽TPS与真菌疏水蛋白HFBI的融合。

背景技术

诱导人工心血管植入物表面自发地形成类似天然血管的内膜组织（体内内皮化）是解决植入后血栓形成、内膜增生和再狭窄的一个根本措施。捕获循环血液中的内皮祖细胞在人工心血管植入物表面定居生长是目前内皮化诱导研究的新策略。

构建与靶细胞特异性结合的表面以捕获循环血液中内皮祖细胞主要有在材料表面固定靶细胞特异性膜蛋白的抗体、核酸适配子和多肽适配子等3 种方法。TPS(TPSLEQRTVYAK) Veleva是等利用噬菌体展示文库筛选到的可与血液来源的内皮祖细胞特异性结合的功能小肽。传统的诱导人造血管生成的方法是将筛选得到的TPS特异功能性小肽利用化学合成的方法获得并与所研究的血管支架材料共价结合，从而研究目的小肽分子在支架材料上固定特定细胞的能力。但是该方法只适合在培养基中没有血清存在的情况下TPS 对内皮祖细胞具有高度的特异性，当有血清存在的时候，因血清中大量的因子都吸附到了TPS支持物的表面，覆盖了TPS特异性吸附内皮祖细胞的能力，这样就严重的制约了人造血管的再生与其临床上的应用。这就需要找到一种适合TPS 修饰支架的介质，使得TPS 能紧密的排列在支架表面，在增加单位面积捕获内皮祖细胞细胞个数的同时对血清中其他因子也起到了排斥作用，从而提高TPS 修饰的支架对内皮祖细胞的特异性吸附能力。

真菌疏水蛋白是由丝状真菌在生长的特定时期产生的一类具有特殊理化性质的分泌型的小分子量、疏水性蛋白质。它们可以通过自组装在两相界面形成两亲性蛋白膜，改变介质表面的亲水性和疏水性，是已知表面活性最高的蛋白之一，具有很高的理论价值和应用价值。国际上，真菌疏水蛋白的在医学上的应用主要集中在以下几个方面：

蛋白（酶）、核酸和细胞的固定化、生物传感器电极的修饰、生物活性包被材料真菌疏水蛋白具有非常稳定的自我装配特性，而且无细胞毒性，也无强免疫原性，这使得它们在生物材料的表面包被应用中成为热点，例如在外科手术器械包被和内科移植等领域均有广阔的应用前景。真菌疏水蛋白膜可以增加疏水性材料表面的可湿性，从而提高疏水表面的生物适应性；真菌疏水蛋白膜也可以防止体内非特异性的蛋白结合和细菌粘附；另一方面，疏水蛋白被覆层可以增强如纤维原细胞等的粘附，在组织工程方面也有应用前景。

在瑞氏木霉疏水蛋白HFBI研究中，HFBI-EGI的融合蛋白可以高效地固定在硅烷化玻璃或是特富龙等疏水性材料表面，在疏水支持物表面形成紧密结合的刚性表面层。西班牙Palomo博士研究小组将真菌疏水蛋白用于层析柱中，发现真菌疏水蛋白可以作为一种良好的中介，利用蛋白之间的相互作用，将脂肪酶固定于介质表面。但是利用真菌疏水蛋白的自组装成膜固定化能力与其它功能肽融合后将其固定到层析柱或者其它固体支持物表面，要比常规的酶固定化技术使目的蛋白更有效的结合。

因此，通过蛋白融合技术将疏水蛋白HFBI与TPS融合，一方面利用疏水蛋白的高效自组装成膜能力，有效地提高单位面积TPS 分布；另一方面，利用HFBI在接近中性条件下带有大量负电荷，进而阻止血清中其它因子的吸附，使得在有血清存在的情况下提高TPS 对人内皮祖细胞的特异吸附能力。

发明内容

发明目的：构建表达一种融合蛋白，用于改善细胞培养支架的生物相容性和内皮祖细胞的特异性筛选能力。并提供一种功能肽TPS在特异性筛选内皮祖细胞中的应用。

本发明的技术方案如下：

内皮祖细胞特异性结合多肽适配子TPS的氨基酸序列：

TPSLEQRTVYAK

内皮祖细胞特异性结合的多肽适配子TPS的基因序列：

ACTCCATCTTTAGAACAAAGAACTGTTTACGCTAAG

疏水蛋白HFBI的基因序列为：

AGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCCCGGCCTCTTCAGCAACCCCCAGTGCTGTGCCACCCAAGTCCTTGGCCTCATCGGCCTTGACTGCAAAGTCCCCTCCCAGAACGTTTACGACGGCACCGACTTCCGCAACGTCTGCGCCAAAACCGGCGCCCAGCCTCTCTGCTGCGTGGCCCCCGTTGCCGGCCAGGCTCTTCTGTGCCAGACCGCCGTCGGTGCT

疏水蛋白HFBI的氨基酸序列为：

SNGNGNVCPPGLFSNPQCCATQVLGLIGLDCKVPSQNVYDGTDFRNVCAKTGAQPLCCVAPVAGQALLCQTAVGA

柔性肽段的氨基酸序列

GGGGSGGGGS

柔性肽段的基因序列

GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT

本发明技术方案利用蛋白融合技术将TPS融合到了HFBI的N端，同时为了保证两部分多肽都能很好的保持各自的生物学功能，在进行蛋白融合的时候引进一个柔性肽段连接到了两部分之间。在构建融合载体时，TPS和柔性肽段基因序列设计到了引物中，HFBI序列通过逆转录从瑞氏木霉发酵菌丝体cDNA 文库中克隆得到；通过分子生物学手段将构建的融合蛋白在毕赤酵母中进行了表达和分离纯化。原子力显微镜和接触角测定实验表明：融合蛋白很好地保持了两亲性和自组装成膜能力，以及在有血清存在条件下特异性黏附内皮祖细胞的能力。

本发明的有益效果在于利用疏水蛋白HFBI改善细胞培养支架的血液相容性和生物相容性。利用疏水蛋白HFBI高效成膜固定化能力和在中性环境中对蛋白因子的排阻效应，提高单位面积聚集内皮祖细胞的能力，增强细胞支架对血清中其他因子的排斥能力，提高其在有血清存在条件下对内皮祖细胞选择性吸附的能力，使得内皮祖细胞在组织工程中的应用得到提高。

附图说明

图1 是含有融合蛋白TPS-HFBI基因的pPIC9K毕赤酵母表达载体示意图。

图 2 是融合蛋白TPS-HFBI的蛋白免疫印迹图。

图 3 是融合蛋白TPS-HFBI原子力显微镜检测图。

图 4 是融合白蛋TPS-HGFI结构形貌原子力显微镜检测图。

图 5 是未修饰的聚乙内酯表面水接触角测定图。

图 6 是融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面水接触角测定图。

图 7 是未修饰的云母表面水接触角测定图。

图 8 是融合蛋白TPS-HFBI修饰的云母表面水接触角测定图。

图 9 是内皮祖细胞在融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面吸附生长测定图。

图 10 是成纤维细胞在融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面吸附生长测定图。

图 11 是人脐静脉内皮细胞在融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面吸附生长测定图。

图 12 是间叶系干细胞在融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面吸附生长测定图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式做进一步的说明。

实施例1

瑞氏木霉疏水蛋白HFBI基因的克隆

1、总RNA提取

用EASYspin 酵母RNA 快速提取试剂盒从瑞氏木霉疏液体培养菌丝体提取总RNA；

2、cDNA第一链的合成

以上述提取的总RNA为模板，带Oligo(dT)₁₂Primer为引物，用逆转录试剂盒（M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit）在反转录酶M-MLV Rtase作用下转录出cDNA第一链；

（1）在微量离心管中配置下表中反应液，总量20 μL，轻轻搅拌混匀。

总RNA 2μg；

5×1^st Strand Synthesis Buffer 4μL；

dNTP Mixture 1μL；

RNase Inhibitor 1μL；

Oligo (dT)₁₂ 2μL；

M-MLV Rtase 1μL；

RNase free H₂O up to 20μL。

（2）室温放置10分钟后，移至42℃水浴锅中水浴1小时；

（3）孵育结束后置于冰中2分钟；

3、 hfbIPCR 扩增

（1）将200μL PCR 薄壁管放置在冰上，按以下顺序分别加入各组份配制成50μL；

反应体系：

无菌水 37.75μL；

10×Buffer 5μL；

dNTP 4μL；

P1 1μL；

P2 1μL；

cDNA第一模板 1μL；

DNA Polymerase（5u/μL）0.25μL。

（2）在PCR 热循环仪上建立如下反应程序：

预变性 94℃ 4 min；

变性 94℃ 30 s；

退火 60℃ 30 s；

延伸 72℃ 45 s；

循环重复步骤2-4 30 次；

总延伸 72℃ 10 min；

停止 4℃ Pause；

得到HFBI基因片段T1，所述引物序列为：

P1-5' AGCAACGGCAACGGCAATGTTTG 3'；

P2-5' TCAAGCACCGACGGCGGTCTGGCA3'。

实施例2

融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建

1）以T1为模板，以P3和P4

P3-5'GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAGCAACGGCAACGGCAATGT3'

P4-5' CCGTGCGGCCGCTCAAGCACCGACGGCGGTCTGGCA 3'（NotI）

为引物得到PCR产物T2；

2）以P5和P6

P5-5'GCGGAATTCAAAAGAACTCCATCTTTAGAACAAAGAACTGTTTACGCTAAG3' (EcoRI)

P6-5'AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTTAGCGTAAACAGTTCTTTG3'

为引物得到PCR产物T3；

3）以T2，T3为模板，以P5和P4

为上下引物得到321bp融合蛋白TPS-HFBI基因；

4）在毕赤酵母中高效表达融合蛋白过程中，与表达TPS-HGFI不同，为了便于高拷贝转化子的筛选，未选用pPIC9表达载体，而采用了含有高拷贝菌株筛选标记-卡那霉素抗性基因的pPIC9K毕赤酵母表达载体，这样可以通过利用添加遗传霉素的方法来获得高拷贝菌株，而避免了在使用pPIC9载体的过程中通过大量随机挑取转化子的方法来获得高拷贝菌株时带来的随机性和操作繁琐等问题。具体构建过程是通过用EcoRI和NotI将得到的TPS-HFBI融合基因片段和pPIC9K载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶对酶切的PCR片段和载体进行连接得到毕赤酵母表达载体pPIC9K+tps-hfbI，如图1。

实施例3

融合蛋白TPS-HFBI的分离纯化

1）利用Invitrogen 公司提供的毕赤酵母表达系统操作手册对实施例2中构建成功的融合蛋白毕赤酵母表达载体在毕赤酵母中高效诱导表达。

2）离心收集经诱导表达的酵母上清液，用中空纤维超滤法分离浓缩表达产物。采用的中空纤维超滤膜型号为 UEOc1，参数如下：

膜材料聚砜

外型尺寸(φ×mm) 50×386

截留分子量(K) 4

纤维内外径(mm) 0.25/0.4

膜面积(m²) 1.5

产水量(L/H) 15-20

pH 2-13

操作压力(Mpa) ≤ 0.15

在超滤过程中通过条件优化，超滤温度控制在4℃，压力控制在0.04 MPa，超滤时间5小时，为融合蛋白的最佳纯化条件。与纯化TPS-HGFI时在室温下，超滤压力0.06 MPa，超滤时间3小时相比，大大减少了蛋白在纤维滤膜上的吸附；同时，通过低温、低压力、延长超滤时间的方法，得到的超滤产物更纯，得到的冻干粉颜色更白，克服了在纯化TPS-HGFI过程中超滤产物中带有大量色素而使得产物颜色发黄现象的产生。

3）与纯化TPS-HGFI、rHGFI以及rHFBI不同，在对目的蛋白进行高效液相色谱分离纯化前，先对超滤后的冻干粉进行了超纯水/乙腈=1:1溶解处理。在处理过程中，先加一定量的水，等冻干粉充分溶解后再加乙腈进行混匀。切记不要先加乙腈使得大量蛋白瞬间失活聚集而导致目的蛋白被包裹并被离心除去。然后对经过超纯水/乙腈处理过的上清液进行真空冻干。经过上述处理使得冻干粉中大量杂蛋白在高浓度的有机溶剂中变性失活而被离心除去，而目的蛋白由于具有两亲性和高耐受性而被保留下来，从而大大提高了融合蛋白在冻干粉中的含量，节省了时间且降低了纯化成本。

具体步骤如下:

(1)称取200 mg 超滤后的冻干粉；

(2)加入5 ml 的超纯水充分混匀；

(3)加入5 ml 的乙腈充分混匀；

(4)13000 rpm 离心10分钟；

(5)取上清液进行真空冻干。

4）用高压液相色谱对超纯水/乙腈处理后的融合蛋白冻干粉进一步纯化，对目的蛋白纯化采用的是反相高效液相色谱法。将上述 3）中的冻干粉溶解于含有0.1 %TFA的50 %乙腈中，样品浓度约为15 mg/mL，12000 rpm离心10 min，每次取上清4 mL载入上样环，以含有0.1 % TFA的乙腈洗脱，A相为含有0.1 % TFA的超纯水，B相为含0.1 % TFA的乙腈，洗脱速度4 mL/min，检测波长为215 nm，洗脱程序如下：

(1) 平衡(equilibrate) 10 mL

(2) 清空上样环(empty loop) 15 mL

(3) 清洗层析柱(wash column) 10 mL

(4) 0-20 %含0.1 % TFA 的乙腈 10 mL

(5) 20-60 %含0.1 % TFA 的乙腈 15 mL

(6) 60-100 %含0.1 % TFA 的乙腈 15 mL

(7) 100 %含0.1 % TFA 的乙腈 5 mL

(8) 100 %含0.1 % TFA 的乙腈-0 10 mL

(9) 平衡 5 mL

实施例4

诱导表达融合蛋白的免疫印迹鉴定

组装电泳凝胶制备模具，同时配制16％的分离胶和4％的浓缩胶，脱气，先灌分离胶后立即灌浓缩胶，最后插梳子，室温水品静置2小时以上，使凝胶充分聚合。

取一定量经高效液相分离的目的蛋白溶液，将乙腈蒸发干净后，取50μL，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀后，在沸水中煮沸10 min，12000 rpm离心1 min，取上清30 μL进行Tricine-SDS-PAGE电泳，浓缩胶部分电泳恒流10 mA，分离胶部分电泳恒流20 mA。样品电泳至前沿指示剂到达分离胶底部时，停止电泳。

蛋白免疫印迹操作方法如下：

（1）电泳：电泳分离的操作方法参考上文的操作方法。

（2）转移印迹：

转移前准备----将滤纸，硝酸纤维素膜剪成与胶同样大小，硝酸纤维膜浸入去离子水中10-20 min 后浸入转移buffer中平衡30 min。

凝胶平衡----将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移buffer 中平衡30-60 min。

按照电转仪说明书上的图示操作----逐层铺平海绵垫，滤纸，凝胶，转移膜，滤纸，海绵垫；各层之间勿留有气泡和皱折。

开始转移----连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流0.8 mA/cm，室温下转移1h。

（3）免疫染色

转移后的膜于5% BSA中封闭，4℃过夜；PBST洗膜2-3次，5 min/次；加HFBI蛋白特异的抗体，室温1-2h；PBST洗膜3-5次，5min/次；加酶标二抗，室温1小时；PBST洗6-8次，5min/次。

（4）显色：将膜再转入DAB显色液底物中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。

图2为用HFBI抗体获得的融合蛋白TPS-HFBI的蛋白免疫印迹鉴定图。

在进行后续的融合蛋白TPS-HFBI功能检测的时候，由于TPS-HFBI有很好的水溶性和pH耐受性，在纯水溶液中能均匀分散，能在被修饰物表面高效自组装成膜，消除了在使用融合蛋白TPS-HGFI过程中由于其在水中溶解度小、对pH敏感，极易团聚、难解离的现象；同时也克服TPS-HGFI在进行表面修饰过程中必须使用大量的三氟乙酸来将其解离成单体这一处理方法的弊端，消除了三氟乙酸对后期细胞的培养筛选及安全性方面造成的影响，进而促进了TPS功能多肽在生物医学材中的应用。

实施例5

融合蛋白自组装成膜的原子力显微镜测定

1）配制100 μg/mL的融合蛋白TPS-HFBI水溶液；

2）吸取上述配置的溶液20 μL滴在干净的云母的表面, 在室温下静置过夜；

3）吸去残余的蛋白溶液，用去离子水洗涤云母表面三次，在用氮气吹干表面。进行原子力显微镜检测。

图3为融合蛋白TPS-HFBI在云母表面自组装成膜后的原子力显微镜检测图。

用同样的条件和方法处理TPS-HGFI，并进行原子力显微镜检测。

图4 为融合白蛋TPS-HGFI在云母表面的原子力结构形貌图。

与TPS-HGFI相比， TPS-HFBI蛋白在水溶液中的溶解性和自组装成膜方面显示出了独特优势。从图中可以看到在不加三氟乙酸的条件下，TPS-HFBI能很好的在水溶液中解离溶解并在云母表面自组装成致密的膜。而融合蛋白TPS-HGFI在不加三氟乙酸的情况下极易聚合而无法成膜，从而限制了其生物学功能的发挥。

实施例6

融合蛋白对表面亲疏水性改变能力检测；

1) 配制100 μg/mL的融合蛋白水溶液；

2) 用移液器取100 μL滴在聚乙内酯表面，室温下静置过夜；

3) 吸去残余的蛋白溶液，用去离子水洗涤三次，用氮气将聚乙内酯表面吹干；

4) 用相同的方法处理新制备云母的表面；

5) 将5 μL的超纯水迅速滴在待测聚乙内酯或云母的表面，进行接触角测量，并快速拍照。

图5、图6、图7、图8依次为未修饰的聚乙内酯、TPS-HFBI修饰的聚乙内酯、未修饰的云母和TPS-HFBI修饰的云母表面水接触角测定图。

实施例7

融合蛋白TPS-HFBI对内皮祖细胞的特异性黏附实验

1）配制100 μg/mL的融合蛋白TPS-HFBI水溶液1 L；

2）将聚乙内酯支架材料浸到配置好的蛋白溶液中吸附过夜；

3）将饰过的聚乙内酯材料取出，并真空抽干；

4）用超纯水洗三次，在真空抽干；

5）在紫外灯下对被修饰过的聚乙内酯材料照射2 h进行灭菌处理后备用；

6）选取四种不同的细胞：人内皮祖细胞、人脐静脉内皮细胞、间叶系干细胞，在经过上述融合蛋白修饰并已灭菌的聚乙内酯材料上进行培养，在细胞培养箱中静置培养2 h后，用PBS洗涤两次。采用PI染色，标记细胞核，并在荧光显微镜观察比较不同细胞在修饰的聚乙内酯材料上的黏附生长情况。

图9、图10、图11、图12 依次为内皮祖细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞和间叶系干细胞在融合蛋白TPS-HFBI修饰的聚乙内酯表面黏附生长的测定图。

Claims

1.一种融合蛋白TPS-HFBI在特异性筛选内皮祖细胞中的应用，其特征在于：内皮祖细胞特异性结合的功能肽TPS的氨基酸序列：

TPSLEQRTVYAK；

内皮祖细胞特异性结合的功能肽TPS的基因序列：

ACTCCATCTTTAGAACAAAGAACTGTTTACGCTAAG；

疏水蛋白HFBI的基因序列为：

AGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCCCGGCCTCTTCAGCAACCCCCAGTGCTGTGCCACCCAAGTCCTTGGCCTCATCGGCCTTGACTGCAAAGTCCCCTCCCAGAACGTTTACGACGGCACCGACTTCCGCAACGTCTGCGCCAAAACCGGCGCCCAGCCTCTCTGCTGCGTGGCCCCCGTTGCCGGCCAGGCTCTTCTGTGCCAGACCGCCGTCGGTGCT；

疏水蛋白HFBI的氨基酸序列为：

SNGNGNVCPPGLFSNPQCCATQVLGLIGLDCKVPSQNVYDGTDFRNVCAKTGAQPLCCVAPVAGQALLCQTAVGA；

柔性肽段的氨基酸序列：

GGGGSGGGGS；

柔性肽段的基因序列：

GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT；

融合蛋白TPS-HFBI氨基酸序列为：

TPSLEQRTVYAKGGGGSGGGGSSNGNGNVCPPGLFSNPQCCATQVLGLIGLDCKVPSQNVYDGTDFRNVCAKTGAQPLCCVAPVAGQALLCQTAVGA。