CN114456250A - 一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺，属于蛋白纯化领域。该纯化工艺包括以下步骤：(1)破胞；(2)酸提；(3)加盐除杂：在步骤(2)的浓缩液中加入盐至终浓度为0.20～0.80M，离心，收集上清液，在上清液中加入盐至终浓度为1～3M，离心，收集沉淀；(4)酶催化氧化；(5)离子交换层析。利用本发明的纯化工艺获得了高收率、高纯度、高多巴含量的类贻贝粘蛋白。本发明的纯化工艺步骤简短、成本低廉，在大规模生产类贻贝粘蛋白中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于蛋白纯化领域，具体涉及一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺。
背景技术
贻贝是一种广泛分布于沿海和近海的甲壳类海洋生物，其足丝腺能分泌足丝，并通过足丝形成的足丝盘将贻贝固定在各种基材表面。其足丝的主要成分为贻贝足丝蛋白(Mytilus edulis foot protein，MFP)，也称为贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein，MAP)，该蛋白具有高强度、高韧性和防水性。贻贝粘蛋白还具有耐腐蚀性强、生物相容性良好、不会产生免疫反应等特点，在海洋工程、生物医学及表面化学等领域具有广泛的应用前景。
大量的研究表明，贻贝粘蛋白能粘附于几乎所有的固体材料表面的关键在于其结构中所富含的3，4-二羟基苯丙氨酸(简称DOPA，又称多巴)功能元。多巴是一种侧基为儿茶酚(邻苯二酚)官能团的氨基酸，其中的苯酚基团具有很强的金属螯合能力，能在材料表面形成不可逆的有机金属络合物，还能与蛋白质等极性聚合物形成很强的氢键，多巴对贻贝粘蛋白的防水性黏合及内聚力起关键作用。因此，大规模生产高纯度、高多巴含量的贻贝粘蛋白具有重要意义。
申请号为200710179492.5的中国专利申请公开了一种以羧甲基离子交换色谱结合凝胶过滤色谱为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，该方法采用强酸提取贻贝足丝，以脱盐柱去除小分子化合物，利用琼脂糖基质的羧甲基离子交换介质结合凝胶过滤介质分离纯化贻贝粘蛋白，得到了纯度98％～99％的天然贻贝粘蛋白。但是，该方法采用羧甲基离子交换层析法纯化贻贝粘蛋白时，用0.5～1.2M高浓度的氯化钠梯度洗脱，由于贻贝粘蛋白较高的粘性，存在难以洗脱、洗脱慢、收率低的问题，收率低至30％～40％。
另一方面，尽管贻贝粘蛋白具有优良的性质，但天然贻贝粘蛋白主要由贻贝足丝分泌，其含量较少，应用受到了极大限制。为了克服天然贻贝粘蛋白资源短缺的问题，研究者们开始利用基因工程技术人工合成类贻贝粘蛋白。在人工合成类贻贝粘蛋白时，为了得到高粘度的类贻贝粘蛋白，需要将重组蛋白中的酪氨酸残基转化为多巴。上述申请号为200710179492.5的中国专利申请公开的方法是一种纯化天然贻贝粘蛋白的方法，不适用于纯化类贻贝粘蛋白。
文献(重组贻贝黏蛋白Mgfp-5的表达及功能评价，吕亚维等，基因组学与应用生物学，2017年，第36卷，第10期，第4108～4115页)公开了一种制备类贻贝粘蛋白Mgfp-5的方法，该方法将大肠杆菌中表达的重组Mgfp-5蛋白通过镍(Ni2+)柱亲和层析进行纯化，然后将纯化后的蛋白溶解于含有10mmol/L抗坏血酸和20mmol/L的硼酸钠的0.1mol/L PBS(pH 7)中，加入10U的酪氨酸酶，室温下轻柔不定期震荡2h，将重组Mgfp-5蛋白的酪氨酸残基修饰为多巴，超滤收集重组Mgfp-5蛋白并透析于5％的醋酸溶液中。利用该方法制备得到了纯度为96.92％的重组Mgfp-5蛋白。但是，该方法在将酪氨酸残基修饰为多巴时，存在反应速度慢，氧化率低的问题，经酪氨酸酶氧化后的重组Mgfp-5蛋白中多巴的含量仅9.6pmol/g。
因此，亟需开发出一种纯化类贻贝粘蛋白工艺，获得高收率、高纯度、高多巴含量的类贻贝粘蛋白。
发明内容
为解决现有工艺存在的上述问题，本发明提供了一种步骤简短、成本低廉的类贻贝粘蛋白纯化工艺，利用该纯化工艺获得的类贻贝粘蛋白收率高、纯度高、多巴含量高。
本发明提供了一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺，包括以下步骤：
(1)破胞：表达类贻贝粘蛋白的工程菌发酵培养后，收集发酵液，破胞，离心，收集沉淀；
(2)酸提：在步骤(1)的沉淀中加入酸，搅拌，离心，收集上清液，超滤浓缩，得到浓缩液；
(3)加盐除杂：在步骤(2)的浓缩液中加入盐至终浓度为0.20～0.80M，离心，收集上清液，在上清液中加入盐至终浓度为1～3M，离心，收集沉淀；
(4)酶催化氧化：将步骤(3)的沉淀在酪氨酸酶的作用下进行酶催化氧化反应，反应结束后收集反应产物；
(5)离子交换层析：将步骤(4)的反应产物利用离子交换层析法提纯。
进一步地，步骤(1)中，所述破胞的方法为：在发酵液中加入非离子型表面活性剂，搅拌破胞；搅拌破胞的温度为75～90℃，时间为10～25min；所述离心的速度为10000×g～16000×g；
步骤(2)中，所述沉淀与酸的质量比为1：(0.1～0.6)，所述酸为有机酸；所述搅拌的时间为12～20h；离心前还在搅拌后的液体中加入了1～9倍体积的水；所述离心的速度为10000×g～16000×g；所述超滤浓缩时采用的超滤膜的截留分子量为3～10KD，浓缩倍数为5～20倍；所述浓液中酸的质量分数为0.5％～5％。
进一步地，步骤(1)中，所述搅拌破胞的温度为85℃，时间为15min；所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Triton X-114，所述非离子型表面活性剂的质量终浓度为0.2％～1％；
步骤(2)中，所述沉淀与酸的质量比为1：(0.3～0.4)，所述有机酸为醋酸和/或柠檬酸。
进一步地，步骤(3)中，所述盐为氯化钠，在浓缩液中加入氯化钠至终浓度为0.30～0.35M，在上清液中加入的氯化钠的终浓度为1.50～1.75M；
收集上清液前离心的速度为10000×g～16000×g；
收集沉淀前离心的速度为3000×g～8000×g。
进一步地，步骤(4)中，所述进行酶催化氧化反应的操作为：将步骤(3)的沉淀加酸溶解，然后加入硼酸、pH稳定剂、抗坏血酸、酪氨酸酶和二价铜离子，得到反应液，向反应液中通入空气维持溶氧量，反应5～15h，收集反应产物；
反应液中，抗坏血酸的终浓度为5～35mM，酪氨酸酶的终浓度为20～100U/ml，二价铜离子的终浓度为5～30μM，硼酸的终浓度为5～35mM，pH稳定剂的终浓度为5～35mM，反应液的pH值为6.5～7.5。
进一步地，步骤(4)中，所述沉淀与酸的质量体积比为5～25g/L，优选为15g/L；
所述pH稳定剂为磷酸盐；
所述反应的时间为5～10h；
所述酸为有机酸，所述酸的质量浓度为0.1％～1％；所述有机酸优选为醋酸和/或柠檬酸；
反应液中，抗坏血酸的终浓度为25mM，酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，硼酸的终浓度为20mM，磷酸盐的终浓度为20mM，反应液的pH值为6.8～7.2。
进一步地，步骤(5)中提纯时，先用平衡液冲洗平衡，上样完成后，用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱，收集洗脱液；
其中，平衡液中含1％～7％质量浓度的醋酸和0.05～0.50M氯化钠，pH为2～6；洗杂流动相中含1％～7％质量浓度的醋酸和0.5～2M氯化钠，pH为2～6；洗脱流动相中含1％～7％质量浓度的醋酸，0.5～2M氯化钠，3～9M尿素，pH为2～6；
所述离子交换层析法的层析介质为琼脂糖凝胶。
进一步地，所述平衡液中含2％～6％质量浓度的醋酸和0.30～0.40M氯化钠，pH为2.5～3.5；洗杂流动相中含2％～6％质量浓度的醋酸和1.0～2M氯化钠，pH为2.5～3.5；洗脱流动相中含2％～6％质量浓度的醋酸，1～2M氯化钠，3～7M尿素，pH为2.5～3.5。
进一步地，所述平衡液中含5％质量浓度的醋酸和0.35M氯化钠，pH为3；洗杂流动相中含5％质量浓度的醋酸和1.5M氯化钠，pH为3；洗脱流动相中含5％质量浓度的醋酸，2M氯化钠，6M尿素，pH为3。
进一步地，所述琼脂糖凝胶为SP Sepharose。
进一步地，所述方法还包括以下步骤：(6)浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，即得。
进一步地，所述类贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明纯化工艺的有益效果为：
1、本发明采用恰当的高温破胞，不仅克服了现有技术中匀浆法、超声法耗能耗时的问题，同时避免了过高温度对类贻贝粘蛋白纯度的影响；
2、本发明在除杂过程中，先加入低浓度盐析出杂质，再加入高浓度盐得到蛋白沉淀，简化了除杂方法，提高了除杂效率；同时，本发明在除杂过程中采用的盐浓度恰当，避免了对类贻贝粘蛋白纯度的影响；
3、本发明在利用酪氨酸酶催化氧化的过程中，向体系中加入适当浓度的二价铜离子，保持溶液的溶氧量，提高了催化反应速度及酪氨酸氧化率，提高了类贻贝粘蛋白中的多巴含量；
4、本发明离子交换层析方法中，选用SP Sepharose作为离子交换的吸附介质，并且在洗脱液中加入尿素，提高了洗脱速度和工艺收率。
综上，利用本发明纯化工艺获得的类贻贝粘蛋白同时具有收率高、纯度高和多巴含量高的优点，具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1的纯化工艺得到类贻贝粘蛋白的凝胶电泳图。
图2为实施例1的纯化工艺得到类贻贝粘蛋白的反相色谱检测图。
图3为实施例2的纯化工艺得到类贻贝粘蛋白的凝胶电泳图。
图4为实施例2的纯化工艺得到类贻贝粘蛋白的反相色谱检测图。
图5为对照例1的纯化工艺得到类贻贝粘蛋白的反相色谱检测图。
图6为实施例1类贻贝粘蛋白氧化前的质谱图。
图7为实施例1类贻贝粘蛋白氧化后的质谱图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1～2、对照例1～4采用的发酵液是按照以下方法制得的：
将表达类贻贝粘蛋白中间体的工程菌E.coli Rosseta2(DE3)/pET28a-mlp151保存于-80℃。表达类贻贝粘蛋白核苷酸片段的序列为：
CATATGGCAAAACCGAGCTATCCGCCTACCTATAAAGCAAAACCGTCATATCCTCCGACGTACAAAGCCAAACCTAGTTATCCACCGACATATAAAGCGAAGCCATCTTATCCGCCAACTTACAAGGCGAAACCTAGCTACCCTCCAACGTATAAGGCCAAGCCATCATACCCACCAACCTATAAAAGCAGCGAAGAATACAAAGGTGGTTACTATCCGGGTAACACCTATCATTATCATAGCGGTGGTAGCTATCATGGTAGCGGTTATCATGGTGGTTATAAAGGTAAATACTACGGCAAAGCCAAGAAATACTACTACAAGTATAAAAACAGCGGCAAATACAAATATCTGAAAAAAGCCCGTAAATACCACCGCAAGGGCTACAAAAAATACTATGGTGGTGGTAGCAGCGCGAAACCGTCTTACCCTCCTACCTACAAGGCTAAGCCGAGTTATCCTCCGACTTATAAGGCTAAACCTTCATATCCGCCAACATATAAGGCAAAGCCAAGCTATCCACCAACATACAAAGCTAAACCCTCGTATCCACCTACTTACAAAGCAAAGCCGAGCTACCCACCGACCTATAAGTAAAAGCTT(SEQ ID NO.1)。
将甘油菌以1％的接种量接种于含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，250rpm过夜扩增。将新鲜制得的种子液以1％接种量接种于5L含卡那霉素的LB培养基中，10L发酵罐，37℃，250rpm培养。当培养液OD600达到0.2～0.5时，加入终浓度为1mM的异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)开始诱导mlp151表达，继续培养4h，收集发酵液。
上述工程菌表达的类贻贝粘蛋白的氨基酸序列为：AKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKSSEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGGSSAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYK(SEQ ID NO.2)。
实施例1、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液中加入0.2％质量终浓度的Triton X-100，搅拌均匀，在搅拌条件下升温至85℃，维持15min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入1倍发酵液体积的水，并加入0.2％质量终浓度的Triton X-114，清洗，继续采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入0.3倍沉淀质量的醋酸，搅拌12h；加水至原体积的5倍，采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量10KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.35M，搅拌均匀后，以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.75M，搅拌均匀后，以8000×g离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白终浓度为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸和终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。通过向反应体系通入空气维持溶氧量，反应10h后，加入终质量浓度为1％的醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，采用SPSepharose作为离子交换的吸附介质，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％的质量浓度醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、6M尿素、pH为3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜(截留分子量10KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
以下对所得类贻贝粘蛋白的分子量、纯度、总收率和酪氨酸氧化率进行测试。
(1)类贻贝粘蛋白样品分子量分析：
采用15％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，染色液采用考马斯亮蓝，20℃染色1h。
结果如图1所示。
(2)采用C8反相键合色谱柱分析类贻贝粘蛋白纯度：
C8色谱柱4.6×250mm,5μm,
流动相A相是含0.1％三氟乙酸水溶液，B相是含0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度洗脱条件：在8min内从10％B升到20％B(0～8min)；然后在12min内从20％B升到45％B(8～20min)；继续在5min内从45％B升到55％B(20～25min)；在0.1min从55％B降到10％B(25～25.1min)；并维持6min(25.1～31min)。检测波长为220&280nm。
结果如图2所示，本实施例所得类贻贝粘蛋白的纯度为93％。
(3)计算类贻贝粘蛋白的总收率：
总收率＝纯化后获得类贻贝粘蛋白的质量/发酵总产量，发酵总产量用液相色谱法测定。
本实施例所得类贻贝粘蛋白的总收率为58％。
(4)计算类贻贝粘蛋白酪氨酸氧化率：
将纯化后类贻贝粘蛋白样品溶液取100μl用0.5M盐酸稀释5倍，稀释后样品取120ul，加入120ul显色剂溶液(含亚硝酸钠和钼酸钠各100g/L)，混匀后(混合液变黄色)，再加入160ul 1M NaOH溶液(混匀后混合液变红色)；取上述混合溶液200μl到酶标板，测定500nm波长下的吸光度值，并根据多巴的标准曲线，计算多巴含量，根据多巴含量计算酪氨酸氧化率。
本实施例所得类贻贝粘蛋白的酪氨酸氧化率为18％。
实施例2、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液中加入0.2％质量终浓度的Triton X-100，搅拌均匀后，在搅拌条件下升温至85℃，维持15min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入1倍发酵液体积的水，并加入0.2％质量终浓度的Triton X-114，清洗，以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入2％柠檬酸溶液(其中沉淀与2％柠檬酸溶液的质量比为1:20)，搅拌12h；采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.35M，搅拌均匀后，以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.75M，搅拌均匀后，以8000×g离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白终浓度为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸和终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。通过向反应体系通入空气维持溶氧量，反应10h后，加入质量分数1％的醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，采用SPSepharose作为离子交换的吸附介质，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％质量浓度的醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、6M尿素、pH＝3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜(截留分子量5KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
以下对所得类贻贝粘蛋白的分子量、纯度、总收率和酪氨酸氧化率进行测试，测试方法同实施例1。
分子量测试结果见图3。
纯度测试结果见图4。本实施例所得类贻贝粘蛋白的纯度为92％。
本实施例所得类贻贝粘蛋白的总收率为55％。
本实施例所得类贻贝粘蛋白的酪氨酸氧化率为18％。
以下为纯化类贻贝粘蛋白的对照工艺。
对照例1、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液中加入水至原体积的2倍，加入质量终浓度0.5％的Triton X-100，搅拌均匀后，在搅拌条件下升温至95℃，维持25min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入0.75倍发酵液体积的水，并加入0.5％质量终浓度的Triton X-114，清洗，继续采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入0.3倍沉淀质量的醋酸，搅拌12h；加水至原体积的5倍，采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量10KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.35M，搅拌均匀后，以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.5M，搅拌均匀后，以8000×g，离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白浓度终为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸和终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。通过向反应体系中通气来维持体系的溶氧量，反应10h后，加入质量分数1％的醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，采用SPSepharose作为离子交换的吸附介质，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％质量浓度的醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、6M尿素、pH＝3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
采用与实施例1相同的方法测试所得类贻贝粘蛋白的纯度，纯度测试结果见图5，本对照例所得类贻贝粘蛋白的纯度为83％。
可以看出，本对照例在95℃的高温条件下破胞，降低了所得类贻贝粘蛋白的纯度。
对照例2、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液加入0.2％质量终浓度的Triton X-100，搅拌均匀后，在搅拌条件下升温至85℃，维持15min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入1倍发酵液体积的水，并加入0.2％质量终浓度的Triton X-114，清洗，继续采用碟式离心机，以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入0.3倍沉淀质量的醋酸，搅拌12h；加水至原体积的5倍，采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量10KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.15M，搅拌均匀后，以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.5M，搅拌均匀后，离心机以8000×g离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白终浓度为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸、终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。通过向反应体系中通入空气维持溶氧量，反应10h后，加入质量终浓度为1％醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％的质量浓度醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、6M尿素、pH为3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
采用与实施例1相同的方法测试所得类贻贝粘蛋白的纯度，本对照例所得类贻贝粘蛋白的纯度为75％。
可以看出，本对照例在氯化钠溶液除杂时，以低浓度的0.15M的氯化钠除杂，降低了所得类贻贝粘蛋白的纯度。
对照例3、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液加入0.2％质量终浓度的Triton X-100，搅拌均匀后，在搅拌条件下升温至85℃，维持15min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入1倍发酵液体积的水，并加入0.2％质量终浓度的Triton X-114，清洗，继续采用碟式离心机，以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入0.3倍沉淀质量的醋酸，搅拌12h；加水至原体积的5倍，采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.35M，搅拌均匀后，离心机以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.75M，搅拌均匀后，离心机以8000×g离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白终浓度为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸、终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。反应10h后，加入质量终浓度为1％醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％的质量浓度醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、6M尿素、pH为3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集洗脱液采用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
采用与实施例1相同的方法测试所得类贻贝粘蛋白的酪氨酸氧化率，本对照例所得类贻贝粘蛋白的酪氨酸氧化率为11％。
可以看出，本对照例在酶催化氧化步骤中没有通过向反应体系中通气来维持体系的溶氧量，降低了所得类贻贝粘蛋白的酪氨酸氧化率。
对照例4、一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
纯化工艺步骤如下：
1.破胞：在发酵液加入0.2％质量终浓度的Triton X-100，搅拌均匀后，在搅拌条件下升温至85℃，维持15min；采用碟式离心机以16000×g离心，收集沉淀；在沉淀中加入1倍发酵液体积的水，并加入0.2％质量终浓度的Triton X-114，清洗，继续采用碟式离心机，以16000×g离心，收集沉淀。
2.酸提：在步骤1所得沉淀中加入0.3倍沉淀质量的醋酸，搅拌12h；加水至原体积的5倍，采用碟式离心机以16000×g离心，收集上清；将上清用超滤膜(截留分子量10KD，材质聚醚砜)浓缩至原体积的1/10，加入水循环，清洗醋酸至质量含量为1％。
3.氯化钠溶液除杂：加入氯化钠至终浓度为0.35M，搅拌均匀后，以16000×g离心，收集上清；在上清中加入氯化钠至终浓度为1.75M，搅拌均匀后，以8000×g离心，收集沉淀。
4.酶催化氧化：将沉淀用质量浓度1％的醋酸溶解，使溶液中的蛋白终浓度为15g/L；向溶液加入终浓度20mM的磷酸二氢钠、终浓度25mM的抗坏血酸、终浓度20mM的硼酸后，再加入酶反应液(酶反应液是在0.1M磷酸溶液中加入酪氨酸酶和二价铜离子配制得到的)，使溶液中酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，溶液pH值为6.8～7.2。通过向反应体系中通入空气维持体系溶氧量，反应10h后，加入质量终浓度为1％醋酸终止反应。
5.离子交换提纯：以步骤4反应后的体系作为上样样品进行离子交换层析，先用平衡液平衡柱子，上样完成后用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱出目标蛋白，收集洗脱液。
平衡液为含5％的质量浓度醋酸、0.35M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗杂流动相为含5％质量浓度的醋酸、1.5M氯化钠、pH＝3.0的水溶液；
洗脱流动相为含5％质量浓度的醋酸、2M氯化钠、pH为3.0的水溶液。
6.浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜(截留分子量3KD，材质聚醚砜)浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，得到类贻贝粘蛋白。
采用与实施例1相同的方法测试所得类贻贝粘蛋白的总收率，本对照例所得类贻贝粘蛋白的总收率为36％。
可以看出，本对照例在离子交换提纯步骤采用的洗脱流动相中不含尿素，降低了所得类贻贝粘蛋白的总收率。
综上，本发明提供了一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺。利用本发明的纯化工艺获得了高收率、高纯度、高多巴含量的类贻贝粘蛋白。本发明的纯化工艺步骤简短、成本低廉，在大规模生产类贻贝粘蛋白中具有广阔的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都英普博集生物科技有限公司
<120> 一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺
<130> GYKH1336-2022P0114790CC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catatggcaa aaccgagcta tccgcctacc tataaagcaa aaccgtcata tcctccgacg 60
tacaaagcca aacctagtta tccaccgaca tataaagcga agccatctta tccgccaact 120
tacaaggcga aacctagcta ccctccaacg tataaggcca agccatcata cccaccaacc 180
tataaaagca gcgaagaata caaaggtggt tactatccgg gtaacaccta tcattatcat 240
agcggtggta gctatcatgg tagcggttat catggtggtt ataaaggtaa atactacggc 300
aaagccaaga aatactacta caagtataaa aacagcggca aatacaaata tctgaaaaaa 360
gcccgtaaat accaccgcaa gggctacaaa aaatactatg gtggtggtag cagcgcgaaa 420
ccgtcttacc ctcctaccta caaggctaag ccgagttatc ctccgactta taaggctaaa 480
ccttcatatc cgccaacata taaggcaaag ccaagctatc caccaacata caaagctaaa 540
ccctcgtatc cacctactta caaagcaaag ccgagctacc caccgaccta taagtaaaag 600
ctt 603
<210> 2
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu
50 55 60
Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly
65 70 75 80
Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr
85 90 95
Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys
100 105 110
Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys
195
Claims (10)
1.一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺，其特征在于：包括以下步骤：
(1)破胞：表达类贻贝粘蛋白的工程菌发酵培养后，收集发酵液，破胞，离心，收集沉淀；
(2)酸提：在步骤(1)的沉淀中加入酸，搅拌，离心，收集上清液，超滤浓缩，得到浓缩液；
(3)加盐除杂：在步骤(2)的浓缩液中加入盐至终浓度为0.20～0.80M，离心，收集上清液，在上清液中加入盐至终浓度为1～3M，离心，收集沉淀；
(4)酶催化氧化：将步骤(3)的沉淀在酪氨酸酶的作用下进行酶催化氧化反应，反应结束后收集反应产物；
(5)离子交换层析：将步骤(4)的反应产物利用离子交换层析法提纯。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(1)中，所述破胞的方法为：在发酵液中加入非离子型表面活性剂，搅拌破胞；搅拌破胞的温度为75～90℃，时间为10～25min；所述离心的速度为10000×g～16000×g；
步骤(2)中，所述沉淀与酸的质量比为1：(0.1～0.6)，所述酸为有机酸；所述搅拌的时间为12～20h；离心前还在搅拌后的液体中加入了1～9倍体积的水；所述离心的速度为10000×g～16000×g；所述超滤浓缩时采用的超滤膜的截留分子量为3～10KD，浓缩倍数为5～20倍；所述浓液中酸的质量分数为0.5％～5％。
3.根据权利要求2所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(1)中，所述搅拌破胞的温度为85℃，时间为15min；所述非离子型表面活性剂为Triton X-100和/或Triton X-114，所述非离子型表面活性剂的质量终浓度为0.2％～1％；
步骤(2)中，所述沉淀与酸的质量比为1：(0.3～0.4)，所述有机酸为醋酸和/或柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(3)中，所述盐为氯化钠，在浓缩液中加入氯化钠至终浓度为0.30～0.35M，在上清液中加入的氯化钠的终浓度为1.50～1.75M；
收集上清液前离心的速度为10000×g～16000×g；
收集沉淀前离心的速度为3000×g～8000×g。
5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(4)中，所述进行酶催化氧化反应的操作为：将步骤(3)的沉淀加酸溶解，然后加入硼酸、pH稳定剂、抗坏血酸、酪氨酸酶和二价铜离子，得到反应液，向反应液中通入空气维持溶氧量，反应5～15h，收集反应产物；
反应液中，抗坏血酸的终浓度为5～35mM，酪氨酸酶的终浓度为20～100U/ml，二价铜离子的终浓度为5～30μM，硼酸的终浓度为5～35mM，pH稳定剂的终浓度为5～35mM，反应液的pH值为6.5～7.5。
6.根据权利要求5所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(4)中，所述沉淀与酸的质量体积比为5～25g/L，优选为15g/L；
所述pH稳定剂为磷酸盐；
所述反应的时间为5～10h；
所述酸为有机酸，所述酸的质量浓度为0.1％～1％；所述有机酸优选为醋酸和/或柠檬酸；
反应液中，抗坏血酸的终浓度为25mM，酪氨酸酶的终浓度为50U/ml，二价铜离子的终浓度为20μM，硼酸的终浓度为20mM，磷酸盐的终浓度为20mM，反应液的pH值为6.8～7.2。
7.根据权利要求1～6任一项所述的纯化工艺，其特征在于：步骤(5)中提纯时，先用平衡液冲洗平衡，上样完成后，用洗杂流动相冲洗除杂，最后用洗脱流动相洗脱，收集洗脱液；
其中，平衡液中含1％～7％质量浓度的醋酸和0.05～0.50M氯化钠，pH为2～6；洗杂流动相中含1％～7％质量浓度的醋酸和0.5～2M氯化钠，pH为2～6；洗脱流动相中含1％～7％质量浓度的醋酸，0.5～2M氯化钠，3～9M尿素，pH为2～6；
所述离子交换层析法的层析介质为琼脂糖凝胶。
8.根据权利要求7所述的纯化工艺，其特征在于：所述琼脂糖凝胶为SP Sepharose。
9.根据权利要求1～8任一项所述的纯化工艺，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：(6)浓缩脱盐：将收集的洗脱液采用超滤膜浓缩脱盐，经0.22μm膜过滤除菌，冻干，即得。
10.根据权利要求1～9任一项所述的纯化工艺，其特征在于：所述类贻贝粘蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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| CN202210326760.6A Active CN114456250B (zh) | 2022-03-30 | 2022-03-30 | 一种类贻贝粘蛋白的纯化工艺 |
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| CN114948788A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-08-30 | 绽妍生物科技有限公司 | 一种舒缓修护三重蛋白组合物及其应用 |
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