CN116854798A - 一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组iii型贻贝粘蛋白及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白及其纯化方法，该法首次采用巴斯德毕赤酵母发酵诱导表达的重组III型贻贝粘蛋白发酵液作为原料，采用固液分离、澄清过滤、超滤浓缩、酶促反应、疏水层析、冷冻干燥的方法，提供一种每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量大于0.85 g/L、纯度大于95%、L‑3,4二羟基苯丙氨酸含量大于0.9%、内毒素含量小于1 EU/mg的重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，纯化工艺过程简单，极大地降低工业化生产成本，更适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组贻贝粘蛋白纯化方法技术领域，具体的涉及一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白及其纯化方法。
背景技术
贻贝粘蛋白（mussel adhesive protein, MAP）也称为贻贝足丝蛋白（Mytilusedulis foot protein, Mfp），是贻贝足部分泌腺分泌出的一种蛋白复合物，目前，已经研究并鉴定至少13种贻贝粘蛋白，包括8种粘性蛋白，即Mfp-1、Mfp-2、Mfp-3F、Mfp-3S、Mfp-4、Mfp-5、Mfp-6、Mfp-7，以及5种足丝纤维骨架蛋白，即preCOL-D、preCOL-P、preCOL-NG、PTMP-1、TMP-1。
其中Mfp-3分子量较小，为5~7 kD，多巴基团含量20 mol％~28 mol％，还含有大量的甘氨酸和天冬氨酸的残基，Mfp-3具有搭载高载量正电荷、多巴基团可氧化成膜以及良好疏水性等结构特点，可形成具有抗氧化能力的纳米级网状微观支架，从而抑制炎症并促进多种细胞贴壁和爬行，是一种理想的医用粘合剂以及皮肤修复材料。
但是由于天然贻贝粘蛋白的分泌量很低，大约10000个贻贝才能提取到1 mg的贻贝粘蛋白，因此利用生物技术手段进行重组贻贝粘蛋白的发酵生产成为现下技术突破的一个重要方向，而通过工程菌发酵表达的重组贻贝粘蛋白需要进行纯化及内毒素控制工艺的处理才能进行应用。目前对贻贝粘蛋白的纯化主要采用多种原理的层析介质依次或共同作用来实现蛋白的纯化，但该方法存在对贻贝粘蛋白内毒素含量控制困难、纯化工艺难以应用于放大批量生产等问题，极大的限制了贻贝粘蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，该方法工艺流程简单，易应用于产业化生产中，并可获取纯度大于95%、L-3,4二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）含量大于0.9%、且内毒素含量小于1 EU/mg的重组III型贻贝粘蛋白冻干粉，且每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量在0.85 g/L以上。
本方案公开的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法中所涉及到的巴斯德毕赤酵母工程菌为重组III型贻贝粘蛋白毕赤酵母基因工程菌，该基因工程菌表达的重组III型贻贝粘蛋白的氨基酸残基数量为379个，具体的氨基酸序列参见中国专利CN115819627A中的SEQ ID NO.5。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）发酵结束后，将巴斯德毕赤酵母工程菌发酵放罐表达的重组III型贻贝粘蛋白发酵液经高速离心机固液分离，去除沉淀收集上清液；
（2）将步骤（1）处理后获取的上清液经膜系统过滤澄清，收集滤出液；
（3）将步骤（2）处理后获取的滤出液经超滤浓缩，收集截留液；
（4）将步骤（3）处理后获取的截留液中加入硫酸铜和酪氨酸酶进行酶促反应；
（5）将步骤（4）处理后的料液中加入氯化钠，并用酸溶液调节pH至3.5~4.0，经用流动相A平衡好的疏水层析柱层析纯化，流动相B洗脱重组III型贻贝粘蛋白，所述流动相A为≥120g/L氯化钠的水溶液，所述流动相B为含70~85 g/L氯化钠的水溶液，所述疏水层析填料为苯基疏水填料；
（6）将步骤（5）处理后获取的重组III型贻贝粘蛋白洗脱液经超滤浓缩、冷冻干燥即可获得重组III型贻贝粘蛋白冻干粉。
进一步的，所述步骤（1）中，所述重组III型贻贝粘蛋白发酵液为巴斯德毕赤酵母发酵所得，发酵方法在中国专利CN115819627A中被公开。
优选的，所述步骤（2）中，所述的膜系统为0.45μm中空纤维膜过滤系统。
优选的，所述步骤（3）中，所述超滤浓缩过程使用的为截留率≤10 KD的卷式滤膜超滤系统，加纯化水超滤至透过液电导率小于0.5 mS/cm，截留液浓缩倍数大于30倍。
优选的，所述步骤（4）中，所述硫酸铜加入量为0.03~0.05 g/L，所述酪氨酸酶加入量为2000~2500EU/L，所述酶促反应的方法为：搅拌溶解后，用碱溶液调pH至7.3~7.6，搅拌3~4h进行酶促反应。
优选的，所述步骤（4）中碱溶液选择氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
优选的，所述步骤（5）中，氯化钠的加入量为117~130 g/L，所述酸溶液选自柠檬酸、冰醋酸、盐酸、磷酸中的一种。
优选的，所述的步骤（6）中，所述的超滤浓缩过程使用的为截留率≤10 KD的卷式滤膜超滤系统，加纯化水超滤至透过液电导率小于0.5 mS/cm。
本发明提供的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化生产方法，该法首次采用巴斯德毕赤酵母发酵诱导表达的重组III型贻贝粘蛋白发酵液作为原料，采用固液分离、澄清过滤、超滤浓缩、酶促反应、疏水层析、冷冻干燥的方法，提供一种发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量大于0.85 g/L、纯度大于95%、L-3,4二羟基苯丙氨酸含量大于0.9%、内毒素含量小于1 EU/mg的重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，纯化工艺过程简单，极大地降低工业化生产成本，更适于工业化生产。
本发明提供的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化生产方法，首先将上清液过滤来进行初步的除杂，后通过超滤浓缩，并设定加纯化水超滤至透过液电导率及截留液浓缩倍数，来降低了体系内离子浓度，为后续酶促反应提供有利条件，从而保证纯化得到的终产品中L-3,4二羟基苯丙氨酸含量处于较高的水平。
本发明提供的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化生产方法，在疏水层析纯化过程中，先通过调节料液中氯化钠的添加量及pH值，来确保蛋白能够结合挂柱而不会出现蛋白盐析，再对流动相A氯化钠水溶液浓度的调整，使未挂柱的杂质能够被洗脱下来，最后对流动相B氯化钠水溶液浓度的调整，使得挂柱的目标蛋白能够被洗脱下来，而杂质及内毒素仍附着在层析介质上，从而确保纯化后得到的终产品的纯度较高，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量也处于较高的水平，而终产品中内毒素的含量处于较低的水平。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中重组III型贻贝粘蛋白经酶促反应后料液在疏水层析纯化过程中的样品及最终冻干粉的SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1：酶反应液；泳道2：疏水层析上样流穿样品；泳道3：流动相B洗脱液；泳道4：层析柱清洗液；泳道5：由冻干粉配制的2 mg/mL溶液；泳道6：蛋白Marker，其中泳道1至5点样量为15μL。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中表达载体（含有上述基因序列）的构建、转化，以及阳性重组毕赤酵母（即重组III型贻贝粘蛋白毕赤酵母基因工程菌）的筛选均参考《毕赤酵母表达操作手册》。重组III型贻贝粘蛋白毕赤酵母基因工程菌作为一级种子在发酵罐进行发酵表达所涉及一级种子培养的培养基及具体培养条件、发酵的培养基及具体培养条件均参考《毕赤酵母发酵手册》。
具体的，对筛选获得的重组III型贻贝粘蛋白基因工程菌进行发酵，以无机盐BSM培养基作为底料，控制pH 5.0、温度29.0°C，溶氧控制在30％，当发酵罐(100L)内菌体湿重达180~200 mg/mL时开始甲醇诱导，同时添加100 μM的硫酸铜和10 μM的抗坏血酸发酵诱导40~50小时后将发酵液放罐。
实施例1
1、发酵结束后发酵液体积59 L，经高速离心机以4000 rpm离心15 min，弃去沉淀，收集上清液，上清液体积36 L；
2、将步骤1收集的上清液，经0.45μm中空纤维过滤设备过滤澄清，截留液用30 L纯化水稀释过滤，回收残留目标蛋白，收集滤出液，滤出液体积62 L；
3、将步骤2收集的滤出液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率0.46 mS/cm，收集截留液，截留液体积2 L，浓缩倍数为31；
4、向步骤3收集的截留液中加入0.0455 g/L硫酸铜和2146.5 EU/L的酪氨酸酶，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调pH至7.4，以200 rpm持续搅拌4h进行酶促反应；
5、向步骤4的酶促反应液中加入125 g/L氯化钠，并用柠檬酸调溶液pH至3.8，上样至经含130 g/L氯化钠的水溶液平衡好的苯基疏水层析柱进行纯化，上样并再平衡后，用含80 g/L氯化钠的水溶液进行洗脱，收集洗脱液4.5 L，用0.1摩尔氢氧化钠溶液清洗层析柱，清洗液取样进行电泳检测；
6、将步骤5收集的洗脱液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率88μS/cm，收集截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白52.36 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.887 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.6%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.98%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
实施例2
1、发酵结束后发酵液体积59 L，经高速离心机以4000 rpm离心15 min，弃去沉淀，收集上清液，上清液体积35.7 L；
2、将步骤1收集的上清液，经0.45μm中空纤维过滤设备过滤澄清，截留液用30 L纯化水稀释过滤，回收残留目标蛋白，收集滤出液，滤出液体积61 L；
3、将步骤2收集的滤出液，经5KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率0.49mS/cm，收集截留液，截留液体积2 L，浓缩倍数为30.5；
4、向步骤3收集的截留液中加入0.05 g/L硫酸铜和2500 EU/L的酪氨酸酶，搅拌至完全溶解，用氢氧化钾调pH至7.6，以200 rpm搅拌4h进行酶促反应；
5、向步骤4的酶促反应液中加入130 g/L氯化钠并用冰醋酸调溶液pH至4.0，上样至经含170 g/L氯化钠的水溶液平衡好的苯基疏水层析柱进行纯化，上样并再平衡后，用含85 g/L氯化钠的水溶液进行洗脱，收集洗脱液4.4 L；
6、将步骤5收集的洗脱液，经5 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率98μS/cm，收集截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白52.11 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.883 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.9%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.92%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
实施例3
1、发酵结束后发酵液体积59 L，经高速离心机以4000 rpm离心15 min，弃去沉淀，收集上清液，上清液体积35.6 L；
2、将步骤1收集的上清液，经0.45μm中空纤维过滤设备过滤澄清，截留液用30 L纯化水稀释过滤，回收残留目标蛋白，收集滤出液，滤出液体积61.4 L；
3、将步骤2收集的滤出液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率0.43 mS/cm，收集截留液，截留液体积2 L，浓缩倍数为30.7；
4、向步骤3收集的截留液中加入0.03 g/L硫酸铜和2000 EU/L的酪氨酸酶，搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调pH至7.3，以200 rpm搅拌3h进行酶促反应；
5、向步骤4的酶促反应液中加入117 g/L氯化钠并用磷酸调溶液pH至3.5，上样至经含120 g/L氯化钠的水溶液平衡好的苯基疏水层析柱进行纯化，上样并再平衡后，用含70g/L氯化钠的水溶液进行洗脱，收集洗脱液4.3 L；
6、将步骤5收集的洗脱液，经10 KD卷式滤膜超滤系统超滤浓缩至透过液电导率91μS/cm，收集截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白52.23 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.885 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.4%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.93%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
对比例1
纯化过程及纯化条件与上述实施例1相同，区别仅在步骤（3）中浓缩倍数偏低（超滤倍数为25）。
通过对截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白52.36 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.887 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.2%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.75%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
可见，步骤3超滤浓缩倍数偏低，致使酶反应过程中目标蛋白浓度较低，终产品中L-3,4二羟基苯丙氨酸含量偏低。
对比例2
纯化过程及纯化条件与上述实施例1相同，区别仅在步骤（5）酶促反应液中加入的氯化钠量偏低（加入100 g/L氯化钠）。
通过对截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白46.12 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.78 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.3%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.89%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
可见，步骤（5）酶促反应液中加入的氯化钠量偏低，会导致目标蛋白上样挂柱不完全，最终获取的冻干粉总量及每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量偏低。
对比例3
纯化过程及纯化条件与上述实施例1相同，区别仅在步骤（5）流动相B洗脱液的氯化钠量偏高（96 g/L氯化钠）。
通过对截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白48.74 g，每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量为0.812 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度96.8%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.93%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
可见，步骤（5）流动相B洗脱液的氯化钠量偏高，会导致目标蛋白洗脱不完全，最终获取的冻干粉总量及每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量偏低。
对比例4
纯化过程及纯化条件与上述实施例1相同，区别仅在步骤（5）流动相B洗脱液的氯化钠量偏低（60 g/L氯化钠）。
通过对截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白53.56 g，每升发酵液产量为0.893 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度92.9%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.95%、经鲎试剂检测内毒素含量限度大于1 EU/mg。
可见，步骤（5）流动相B洗脱液的氯化钠量偏低，会导致目标蛋白洗脱过程中杂质及内毒素物质被洗脱，最终获取的冻干粉纯度偏低，内毒素含量大于1 EU/mg。
对比例5
纯化过程及纯化条件与上述实施例1相同，区别仅在步骤（5）苯基疏水层析柱的流动相A平衡液中的氯化钠量偏低（100 g/L氯化钠）。
通过对截留液进行冷冻干燥，获取重组III型贻贝粘蛋白48.5 g，每升发酵液产量为0.808 g/L，电泳检测冻干粉样品纯度97.4%、冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸含量为0.96%、经鲎试剂检测内毒素含量限度小于1 EU/mg。
可见，步骤（5）苯基疏水层析柱的流动相A平衡液中的氯化钠量偏低，会导致目标蛋白上样过程中挂柱不完全，最终获取的冻干粉总量及每升发酵液经纯化后获取冻干粉纯品量偏低。
Claims (8)
1.一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）发酵结束后，将巴斯德毕赤酵母工程菌发酵表达的重组III型贻贝粘蛋白发酵液经高速离心机固液分离，去除沉淀收集上清液；
（2）将步骤（1）处理后获取的上清液经膜系统过滤澄清，收集滤出液；
（3）将步骤（2）处理后获取的滤出液经超滤浓缩，收集截留液；
（4）将步骤（3）处理后获取的截留液中加入硫酸铜和酪氨酸酶进行酶促反应；
（5）将步骤（4）处理后的料液中加入氯化钠，并用酸溶液调节pH至3.5~4.0，经用流动相A平衡好的疏水层析柱层析纯化，流动相B洗脱重组III型贻贝粘蛋白，所述流动相A为含≥120 g/L氯化钠的水溶液，所述流动相B为含70~85 g/L氯化钠的水溶液，所述疏水层析填料为苯基疏水填料；
（6）将步骤（5）处理后获取的重组III型贻贝粘蛋白洗脱液经超滤浓缩、冷冻干燥即可获得重组III型贻贝粘蛋白冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，所述的膜系统为0.45μm中空纤维膜过滤系统。
3.根据权利要求1所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，所述超滤浓缩过程使用截留率≤10 KD的卷式滤膜超滤系统，加纯化水超滤至透过液电导率小于0.5 mS/cm，截留液浓缩倍数大于30倍。
4.根据权利要求1所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，所述硫酸铜加入量为0.03~0.05 g/L，所述酪氨酸酶加入量为2000~2500 EU/L，所述酶促反应的方法为：搅拌溶解后，用碱溶液调pH至7.3~7.6，持续搅拌3~4小时进行酶促反应。
5.根据权利要求4所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，所述碱溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（5）中，氯化钠的加入量为117~130 g/L，所述酸溶液选自柠檬酸、冰醋酸、盐酸、磷酸中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，所述的步骤（6）中，所述的超滤浓缩过程使用截留率≤10 KD的卷式滤膜超滤系统，加纯化水超滤至透过液电导率小于0.5 mS/cm。
8.一种巴斯德毕赤酵母发酵表达重组III型贻贝粘蛋白，其特征在于：采用如权利要求1-8任意一项所述的纯化方法制得；该重组III型贻贝粘蛋白冻干粉的纯度大于95%，L-3,4二羟基苯丙氨酸含量大于0.9%，内毒素含量小于1 EU/mg。
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