CN114853863B - 一种重组类贻贝粘蛋白纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组类贻贝粘蛋白纯化方法，涉及蛋白纯化方法技术领域。本发明提供的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，该法首次采用大肠杆菌工程菌发酵诱导表达的重组类贻贝粘蛋白发酵液作为原料，采用破胞除杂质、酶催化氧化、层析纯化、层析除内毒素的方法，提供一种每升发酵液纯品产率可达0.7g/L、纯度大于95％、L‑3,4二羟基苯丙氨酸(L‑DOPA)含量大于0.7％且内毒素含量小于20EU/mg的重组类贻贝粘蛋白(Mlfp‑151，理论分子量22.61KD)纯化方法，纯化工艺过程简单，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组类贻贝粘蛋白纯化方法技术领域，具体的涉及一种分离纯化大肠杆菌发酵诱导表达重组类贻贝粘蛋白Mlfp-151的方法。
背景技术
贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein，MAP)是贻贝足部分泌腺分泌出的一种蛋白复合物，近年来因其具有高强度，高韧性，防水性和可降解性等优点受到了广泛的关注，在生物医药方面得到了大力的推广和应用。
贻贝粘蛋白具有L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶对酪氨酸残基的作用形成。L-DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致了贻贝和特殊表面纤维内强而持久的胶接。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，在医药方面的应用前景非常广泛。
现有技术中，贻贝粘蛋白的获取途径主要为海洋紫贻贝足部提取，受原材料及提取工艺的限制，获取贻贝粘蛋白纯品的效率及产量较低，极大的限制了贻贝粘蛋白的应用。利用生物技术手段进行重组类贻贝粘蛋白的发酵生产成为现下技术突破的一个重要方向，本发明所涉及一种将生物技术获取的大肠杆菌工程菌发酵表达的料液进行纯化获得高产率、高纯度、与天然贻贝粘蛋白同样具有L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)且内毒素含量较低的重组类贻贝粘蛋白Mlfp-151(理论分子量22.61KD)的纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于解决大肠杆菌工程菌发酵表达重组类贻贝粘蛋白的纯化产率低，获取的重组类贻贝粘蛋白不含L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)或含量低，产品内毒素含量高影响应用的问题。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
提供一种重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵结束后，向大肠杆菌工程菌发酵诱导表达的重组类贻贝粘蛋白发酵液中加入乳糖和表面活性剂并搅拌；
(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀，沉淀加至含EDTA的pH为6.0-7.5的低渗缓冲液中，搅拌8-16h；
(3)将步骤(2)处理后的料液经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀，沉淀加至pH为3.0-4.0的缓冲液中溶解；
(4)将步骤(3)处理后的料液经高速离心机固液分离，去除沉淀收集上清液；
(5)向步骤(4)处理后的料液中加入氯化钠盐析0.5-1h，然后经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀；
(6)将步骤(5)处理后的沉淀溶于pH为4.0-5.0的缓冲液中，加入硫酸铜及酪氨酸酶进行酶促反应；
(7)向步骤(6)处理后的料液中加入酸溶液调节料液pH至3.0-4.0，经用流动相A平衡好的阳离子交换层析柱层析纯化，洗脱过程采用流动相B1洗脱杂质，流动相B2洗脱重组类贻贝粘蛋白；流动相A为pH3.0-4.0的酸溶液，流动相B1为含氯化钠的pH3.0-4.0的酸溶液，流动相B2为含尿素及氯化钠的pH3.0-4.0的酸溶液；所述酸溶液选自盐酸溶液、冰乙酸溶液、柠檬酸溶液中的一种；
(8)将步骤(7)处理后的重组类贻贝粘蛋白洗脱液超滤至电导率小于0.6mS/cm；
(9)将步骤(8)处理后的料液调pH至8.5-9，然后用氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡好的阴离子交换层析柱上样收集流穿料液，料液冷冻干燥即可获得重组类贻贝粘蛋白冻干粉。
进一步的，所述的步骤(1)中，重组类贻贝粘蛋白发酵液为Mlfp-151大肠杆菌工程菌发酵诱导表达所得。发酵方法如下：挑取Mlfp-151大肠杆菌工程菌，单菌落接种至装有50ml LB培养基试管中(添加卡那抗生素)，37℃培养过夜；过夜培养的种子液以1％的接种量转接入100ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD值在2-3左右时，按照2-5％的接种量移入发酵罐培养(LB培养基)，温度37℃，pH控制6.8，压力0.05MP,通过转速及通气量来调节溶氧≥30％，通过流加碳源/氮源/无机盐来维持营养，当湿重≥50g/L时，添加终浓度为10mmol/L的乳糖进行诱导，诱导6h获取发酵液。
优选的，所述的步骤(1)中，加入的乳糖在发酵液中的浓度为150-300g/L，加入的表面活性剂为Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)或SDS(十二烷基硫酸钠)，所述表面活性剂在发酵液中的体积浓度为1-2％，搅拌时间0.5-1h。更优选为，加入的乳糖在发酵液中的浓度为200g/L，加入的Triton X-100在发酵液中的体积浓度为1％，搅拌时间1h。
优选的，步骤(2)中，所述的沉淀与低渗缓冲液的质量体积比1g:(8-12)mL；所述的低渗缓冲液为8-12mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，低渗缓冲液中EDTA的浓度为0.8-1.5mmol/L。更优选为，沉淀与低渗缓冲液的质量体积比1g:10mL；所述的低渗缓冲液为10mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为6.3-6.9；低渗缓冲液中EDTA的浓度为1mmol/L。
优选的，步骤(3)中，所述的沉淀与缓冲液的质量体积比1g:(5-10)mL；所述的缓冲液为8-12mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。更优选为，所述的沉淀与缓冲液的质量体积比1g:8mL；所述的缓冲液为10mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
优选的，步骤(5)中，所述料液中氯化钠的浓度为1.6-2.0mol/L。更优选为，料液中氯化钠的浓度为1.7-1.8mol/L，盐析0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min。
优选的，步骤(6)中，所述的沉淀溶于pH为4.0-5.0的缓冲液，具体为，将沉淀溶于pH为4.0-5.0的浓度8-12mmol/L柠檬酸-柠檬酸酸钠缓冲液中，沉淀与缓冲液质量体积比1g:(3-8)ml；更优选的，沉淀与缓冲液质量体积比为1g:5ml，L柠檬酸-柠檬酸酸钠缓冲液浓度为10mmol/L。
优选的，步骤(6)中，根据步骤(5)处理后的沉淀的重量按15-25EU/g加入酪氨酸酶；所述硫酸铜的加入量为0.05-0.08g/L；所述酶促反应的方法为：搅拌溶解后，用磷酸氢二钠调pH至7.2-7.8搅拌2-4h进行酶促反应。
优选的，步骤(7)中，所述的阳离子交换层析柱为SPFF层析柱。
优选的，步骤(7)中，所述流动相B1中氯化钠的浓度≥1.9mol/L，更优选为2mol/L氯化钠；所述的流动相B2中尿素的浓度≥6mol/L(更优选为6mol/L)，氯化钠的浓度为0.8-1.2mol/L(更优选为1mol/L)。
优选的，步骤(7)中，所述酸溶液为冰乙酸溶液。
优选的，步骤(8)中，所述的超滤采用6KD卷式滤膜超滤。
优选的，步骤(9)中，将步骤(8)处理后料液调pH至8.5-9，再经用氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换层析柱上样收集流穿料液。步骤(9)在上样之前，先调节料液pH至8.5-9，在该pH范围内可以将内毒素物质高度吸附、从而降低终产品的内毒素；阴离子交换层析柱为QFF层析柱，在重组类贻贝粘蛋白料液流穿的同时，结合去除溶液中的内毒素物质。
一种重组类贻贝粘蛋白，采用上述纯化方法制得；该重组类贻贝粘蛋白的纯度大于95％、L-3,4二羟基苯丙氨酸含量大于0.7％，且内毒素含量小于20EU/mg。
本发明步骤(1)中，乳糖及表面活性剂为渗透压破胞高渗环境组分，其中乳糖为发酵过程中使用的成分，破胞过程采用乳糖替代常规高渗溶液组分，避免其他物质的引入，TritonX-100或SDS为表面活性剂，在高渗溶液作用的同时破坏细胞膜结构，提高低渗溶液破胞效率。步骤(2)中，含EDTA的pH为6.0-7.5的低渗缓冲液，在破胞的同时可溶解杂质及部分内毒素。步骤(7)中，洗脱过程采用流动相B1洗脱杂质，在洗脱杂质的同时可去除大量残留内毒素，能够控制初始内毒素，利于将最终内毒素控制在理想范围内；采用流动相B2洗脱，流动相B2中添加尿素，能够将目标蛋白成功洗脱，解决常规高盐缓冲液难以将目标蛋白从基质上洗脱的问题，洗脱收集的目标蛋白溶液内毒素含量低于100EU/mg。步骤(9)中，通过对步骤(8)获得的料液pH调节至8.5-9，经QFF层析柱后，内毒素物质能够被QFF高度吸附，降低内毒素，可实现将终产品的内毒素含量控制在小于20EU/mg的范围。
本发明提供的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，该法首次采用大肠杆菌工程菌发酵诱导表达的重组类贻贝粘蛋白发酵液作为原料，采用破胞除杂质、酶催化氧化、层析纯化、层析除内毒素的方法，提供一种每升发酵液纯品产率可达0.7g/L、纯度大于95％、L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量大于0.7％且内毒素含量小于20EU/mg的重组类贻贝粘蛋白(Mlfp-151，理论分子量22.61KD)纯化方法，纯化工艺过程简单，适合工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1获取的重组类贻贝粘蛋白冻干粉配置的2mg/mL样品SDS-PAGE电泳检测图：其中，泳道1：蛋白Marker，泳道2：重组类贻贝粘蛋白点样量1ul，泳道3：重组类贻贝粘蛋白点样量1ul，泳道4：重组类贻贝粘蛋白点样量3ul，泳道5：重组类贻贝粘蛋白点样量3ul，泳道6：重组类贻贝粘蛋白点样量6ul，泳道7：重组类贻贝粘蛋白点样量6ul。(重组类贻贝粘蛋白电泳分子量27KD，与理论分子量相比，电泳表征误差导致电泳图中分子量偏高)
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例/对比例中的发酵液制备方法如下：
挑取Mlfp-151大肠杆菌工程菌单菌落接种至装有50ml LB培养基试管中(添加卡那抗生素)，37℃培养过夜。过夜培养的种子液以1％的接种量转接入100ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD值在2-3左右时，按照2-5％的接种量移入发酵罐培养(LB培养基)，温度37℃，pH控制6.8，压力0.05MP,通过转速及通气量来调节溶氧≥30％，通过流加碳源/氮源/无机盐来维持营养，当湿重≥50g/L时，添加终浓度为10mM(mmol/L)的乳糖进行诱导，诱导6h获取发酵液。
实施例1
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积60L，向发酵液中加入12000g乳糖和600mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8kg，向沉淀中加入80L含1mM EDTA的pH为6.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7kg，向沉淀中加入56L pH为3.7的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液58.5L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为1.75mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重220g。
6)将沉淀溶于1.1LpH为4.4的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.22g，加入硫酸铜0.066g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.5，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.2，经用pH3.1的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含2mol/L氯化钠的pH3.2的乙酸溶液洗脱杂质，再用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.53mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.6，后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，放置于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉43.5g。
以上纯化方法，每升发酵液的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.725g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.9％，电泳检测冻干粉样品纯度96.2％，经鲎试剂检测内毒素含量限度小于20EU/mg。
实施例2
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积60.5L，向发酵液中加入10000g乳糖和1200mLSDS并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8.4kg，向沉淀中加入96L含1.5mM EDTA的pH为6.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7.2kg，向沉淀中加入72L pH为3.7的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液69L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为2mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重223g。
6)将沉淀溶于1.7LpH为4.4的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.19g，加入硫酸铜0.12g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.5，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.2，经用pH3.1的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含2mol/L氯化钠的pH 3.2的乙酸溶液洗脱杂质，再用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.51mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.8，后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，放置于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉44.2g。
以上纯化方法，每升发酵液的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.73g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.93％，电泳检测冻干粉样品纯度96.4％，经鲎试剂检测内毒素含量限度小于20EU/mg。
实施例3
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积59L，向发酵液中加入9000g乳糖和600mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8.1kg，向沉淀中加入90L含1mM EDTA的pH为6.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重6.8kg，向沉淀中加入36L pH为3.7的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液34L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为1.6mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重216g。
6)将沉淀溶于0.8LpH为4.4的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.20g，加入硫酸铜0.04g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.5，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.2，经用pH3.1的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含2mol/L氯化钠的pH3.2的乙酸溶液洗脱杂质，再用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.49mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至9.0，后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，放置于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉42.6g。
以上纯化方法，每升发酵液的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.722g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.91％，电泳检测冻干粉样品纯度95.3％，经鲎试剂检测内毒素含量限度小于20EU/mg。
对比例1
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积59L，向发酵液中加入10000g乳糖和590mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7.9kg，向沉淀中加入79L含1mMEDTA的pH为6.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重6.8kg，向沉淀中加入54.4L pH为3.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液58L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为1.75mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重210g。
6)将沉淀溶于1.05LpH为4.5的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.2g，加入硫酸铜0.062g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.4，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.3，经用pH3.2的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.48mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.7后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为8.8的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉44.6g。
以上纯化方法，每升发酵液的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.756g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为1％，电泳检测冻干粉样品纯度93.7％，经鲎试剂检测内毒素含量限度大于20EU/mg。
可见，对比例1纯化方法中SPFF层析过程未经洗杂直接洗脱，内毒素结果超标(大于20EU/mg)，纯度低。
对比例2
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积60L，向发酵液中加入12100g乳糖和700mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8kg，向沉淀中加入80L含1mM EDTA的pH为6.4的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7.1kg，向沉淀中加入56.8L pH为3.6的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液58L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为1.75mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重228g。
6)将沉淀溶于1.14LpH为4.3的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.24g，加入硫酸铜0.071g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.4，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.4，经用pH3.2的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含2mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱杂质，再用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.2的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.51mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.0后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为8.9的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉44.6g。
以上纯化方法，每升发酵液的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.743g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.9％，电泳检测冻干粉样品纯度95.5％，经鲎试剂检测内毒素含量限度大于20EU/mg。
可见，对比例2纯化方法中QFF层析上样料液pH控制低于8.5，内毒素结果超标。
对比例3
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积60L，向发酵液中加入10000g乳糖和1200mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8.3kg，向沉淀中加入96L含1mM EDTA的pH为6.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(10h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7.2kg，向沉淀中加入72L pH为3.7的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液69L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为2mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重220g。
6)将沉淀溶于1.7LpH为4.4的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.2g，加入硫酸铜0.12g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.5，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.2，经用pH3.1的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含2mol/L氯化钠的pH 3.2的乙酸溶液洗脱杂质，再用含2mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.51mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.6，后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉20.2g。
以上纯化方法，与实施例对比，降低SPFF层析洗脱液尿素浓度至2mol/L，目标蛋白洗脱不充分损耗严重，最终获取的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.33g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.91％，电泳检测冻干粉样品纯度96.0％，经鲎试剂检测内毒素含量限度小于20EU/mg。
对比例4
1)发酵罐发酵结束后，发酵液体积60L，向发酵液中加入11000g乳糖和1200mLTriton X-100并以200rpm继续搅拌1h。
2)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重8.2kg，向沉淀中加入95L含1mM EDTA的pH为6.4的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，以200rpm搅拌过夜(11h)。
3)将料液放出，经高速离心机以4000rpm离心15min，去除上清液收集沉淀，沉淀重7.0kg，向沉淀中加入70L pH为3.7的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以200rpm搅拌溶解。
4)将料液经高速离心机以4000rpm离心15min，去除沉淀收集上清液，上清液69L。
5)向上清液中加入氯化钠，使料液中氯化钠的浓度为2mol/L，200rpm搅拌溶解后静置0.5h，经高速离心机以4000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀重222g。
6)将沉淀溶于1.7LpH为4.4的10mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，加入标示活性为25EU/mg的酪氨酸酶0.19g，加入硫酸铜0.12g，搅拌10min，用磷酸氢二钠调pH至7.5，以200rpm搅拌3h进行酶促反应。
7)向酶促反应液中加入冰乙酸调节料液pH至3.2，经用pH3.2的乙酸溶液平衡好的阳离子交换层析柱(SPFF)层析纯化，然后先用含1.7mol/L氯化钠的pH 3.2的乙酸溶液洗脱杂质，再用含6mol/L尿素及1mol/L氯化钠的pH3.3的乙酸溶液洗脱重组类贻贝粘蛋白，收集洗脱液3L。
8)将洗脱液经6KD卷式滤膜超滤，以0.1％乙酸溶液作为超滤介质，超滤至透过液电导率0.51mS/cm。
9)将超滤截留液用氢氧化钠调pH至8.6，后经用1mol/L氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡至pH为9.0的阴离子交换(QFF)层析柱上样收集流穿料液，于经250℃干热灭菌的冻干盘冷冻干燥，共计收取冻干粉43.2g。
以上纯化方法，与实施例对比，降低SPFF层析洗杂液氯化钠浓度至1.7mol/L，杂质及内毒素去除不充分，最终获取的重组类贻贝粘蛋白冻干粉产率为0.72g/L，经测定，冻干粉样品L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量为0.93％，电泳检测冻干粉样品纯度93.5％，经鲎试剂检测内毒素含量限度大于20EU/mg。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵结束后，向大肠杆菌工程菌发酵诱导表达的重组类贻贝粘蛋白发酵液中加入乳糖和表面活性剂并搅拌；
(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀，沉淀加至含EDTA的pH为6.0-7.5的低渗缓冲液中，搅拌8-16h；
(3)将步骤(2)处理后的料液经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀，沉淀加至pH为3.0-4.0的缓冲液中溶解；
(4)将步骤(3)处理后的料液经高速离心机固液分离，去除沉淀收集上清液；
(5)向步骤(4)处理后的料液中加入氯化钠盐析0.5-1h，然后经高速离心机固液分离，去除上清液收集沉淀；
(6)将步骤(5)处理后的沉淀溶于pH为4.0-5.0的缓冲液中，加入硫酸铜及酪氨酸酶进行酶促反应；
(7)向步骤(6)处理后的料液中加入酸溶液调节料液pH至3.0-4.0，经用流动相A平衡好的阳离子交换层析柱层析纯化，洗脱过程采用流动相B1洗脱杂质，流动相B2洗脱重组类贻贝粘蛋白；流动相A为pH3.0-4.0的酸溶液，流动相B1为含氯化钠的pH3.0-4.0的酸溶液，流动相B2为含尿素及氯化钠的pH3.0-4.0的酸溶液；所述酸溶液选自盐酸溶液、冰乙酸溶液、柠檬酸溶液中的一种；所述的阳离子交换层析柱为SPFF层析柱；
(8)将步骤(7)处理后的重组类贻贝粘蛋白洗脱液超滤至电导率小于0.6mS/cm；
(9)将步骤(8)处理后的料液调pH至8.5-9，然后经用氢氧化钠冲洗并由注射用水平衡好的阴离子交换层析柱上样收集流穿料液，料液冷冻干燥即可获得重组类贻贝粘蛋白冻干粉；所述的阴离子交换层析柱为QFF层析柱；
所述的步骤(1)中，重组类贻贝粘蛋白发酵液为Mlfp-151大肠杆菌工程菌发酵诱导表达所得；
所述的步骤(7)中，所述流动相B1中氯化钠的浓度1.9-2mol/L；所述的流动相B2中尿素的浓度为6mol/L，氯化钠的浓度为0.8-1.2mol/L。
2.根据权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，加入的乳糖在发酵液中的浓度为150-300g/L，加入的表面活性剂为Triton X-100或SDS，所述表面活性剂在发酵液中的体积浓度为1-2％。
3.根据权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的沉淀与低渗缓冲液的质量体积比1g:(8-12)mL；所述的低渗缓冲液为8-12mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，低渗缓冲液中EDTA的浓度为0.8-1.5mmol/L。
4.根据权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的沉淀与缓冲液的质量体积比1g:(5-10)mL；所述的缓冲液为8-12mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
5.根据权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，所述料液中氯化钠的浓度为1.6-2.0mol/L。
6.根据权利要求1所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：步骤(6)中，根据步骤(5)处理后的沉淀的重量按15-25EU/g加入酪氨酸酶；所述硫酸铜的加入量为0.05-0.08g/L；所述酶促反应的方法为：搅拌溶解后，用磷酸氢二钠调pH至7.2-7.8搅拌2-4h进行酶促反应。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的重组类贻贝粘蛋白纯化方法，其特征在于：所述的重组类贻贝粘蛋白冻干粉的纯度大于95％、L-3,4二羟基苯丙氨酸含量大于0.7％，且内毒素含量小于20EU/mg。
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