WO2013143077A1

WO2013143077A1 - 使用多模式色谱纯化贻贝粘蛋白的方法

Info

Publication number: WO2013143077A1
Application number: PCT/CN2012/073167
Authority: WO
Inventors: 高敏; 杨森•杨克里斯特
Original assignee: 江阴贝瑞森生化技术有限公司
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2013-10-03

Abstract

本发明提供了一种多模式色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，该方法采用强酸提取，利用耐高盐的弱阳离子交换凝胶复合具有疏水及氢键吸附作用配基介质分离纯化贻贝粘蛋白。本发明的方法在一种分离介质上利用离子交换、氢键吸附、疏水吸附三种原理分离贻贝粘蛋白，形成了高选择性，简化了纯化工艺，降低了生产成本。

Description

使用多模式色谱纯化贻贝粘蛋白的方法技术领域

本发明涉及一种分离纯化贻贝粘蛋白的方法。特别地，本发明涉及一种使用多模式色谱从贻贝中分离纯化贻贝粘蛋白的方法。背景技术

贻贝俗称"海红"、 "淡菜"，属寒温带、广盐性种类，在全球各海域均有不同种类存在，中国约有 50种。分布在热带和亚热带的翡翠贻贝 (Perna viridis ) , 分布在寒带和温带的紫贻贝 Mytilus edulis) 和厚壳贻贝 iMytilus coruscus) 是世界各国重要的养殖和捕捞对象。

贻贝粘蛋白（Mussel adhesive protein, MAP) 是一种多元酚碱性蛋白，最初在紫贻贝中发现，故而也称作紫贻贝足丝蛋白（Mytilus edulis foot protein, Με ) , 后来发现其广泛存在于多种贻贝中。贻贝具有耐受近海波浪影响的能力，它在特殊腺体内生成并储存一种蛋白胶，通过足丝将该蛋白胶释放到岩石之类的固体表面上，形成抗水的结合，从而将自己固定。在玻璃上的研究显示，用于足丝附着的基材表面被含有一些酚腺分泌物和粘液的分散体所覆盖，该分散体覆盖基材表面，由浆液纤毛涂布成 50纳米厚的膜，有很强的抗张强度（10⁶ - 10⁷ newton-meter"² ) , 进一歩对膜内物质的分析显示其包含有贻贝粘蛋白在酸性条件下，贻贝粘蛋白 MAP表面带正电荷，可采用离子交换方法进行分离。贻贝粘蛋白含有 L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA) , L-DOPA由酪氨酸酶对酪氨酸残基的作用形成， L-DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致贻贝与特殊表面强而持久的胶接，其生物粘附的机理很有趣。贻贝粘蛋白粘附对人类没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，因而在作为医用手术胶，尤其是眼科手术胶方面的应用已经引起了注意。

全世界每年进行约 1100万例白内障手术，我国白内障的发病率非常高， 50岁以上人群中的白内障发病率为 29.64%， 70岁以上人群发病率高达 60%。随着社会老龄化的加剧，这一数字还会上升。目前主要采用两种闭合方式结束眼科手术：使伤口自行愈合或是利用尼龙线缝合切口，这两种闭合方法会存在自愈感染和眼内液体泄露以及缝合后感染发炎及血管发育异常的危险。而贻贝粘蛋白能在低浓度下交联，并形成可注射到不规则形状部位的低粘性液体，这种溶液可凝固而填充到指定空间，在几分钟内可封闭切口，比缝合所需时间短。贻贝粘蛋白还可形成一个不可破坏的封条，在大于正常人眼压 12倍的压力下，眼内液体也不会发生泄露。此外，贻贝粘蛋白具有与眼角膜近似的折射率，不会干扰光线到达视网膜。

贻贝粘蛋白的纯化通常组合应用以下技术：提取、盐析、示差沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱和分子排阻色谱，但活性蛋白质的收率低，仅为 15%。此外，现有的提取纯化技术工艺复杂，规模制备成本高、周期长、对 pH值和盐浓度敏感而导致稳定性难以控制，因而有必要研究新的色谱方法来获取高纯度、高活性的贻贝粘蛋白。

离子交换色谱法是蛋白质分离中最常用的方法之一，它具有处理量大、效率高等优点，缺点是对于具有相似电离特性的蛋白分辨率差，因此，采用离子交换色谱法通常可以从样品中制备一组具有相似特性的蛋白质。

多模式色谱介质是利用离子交换介质基质上的基团及键合的功能基团与贻贝粘蛋白分子所具有的多种表面基团作用，可表现出多种相互作用，如离子作用、疏水作用、氢键作用等以提高介质对样品的选择性分离能力。贻贝粘蛋白中富含多酚基团，其酚羟基是氢键供体，可使用包含适当氢键受体的吸附剂的氢键色谱进行分离；其苯环结构可形成疏水键，可利用疏水相互作用进行分离。因此，可利用贻贝粘蛋白结构中的这些特点，采用离子交换复合氢键吸附及疏水作用原理进行分离。

在蛋白分离介质中，常用的基质材料包括琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是目前生物医药研发和生产中最普遍使用的规模制备用分离介质，该琼脂糖基质具有高孔度（90-96%), 即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高连通性有效保证了分子内的物质传递；大比表面积可提供很高的吸附能力，易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定，可满足苛刻的在位清洗歩骤; 非特异性吸附低使得应用面较广；具有弹性及非脆性（较易实现柱子的再装填) 又可通过足够的交联歩骤使介质具有刚性（有较高的耐压性能）；可利用不同的活化歩骤进行共价交联而活化，可被大量配基取代而应用于多种吸附色谱技术。

中国发明专利申请 No. 200710179491.0公开了一种以介质 Superose 12、 Superose 12 pg为核心的混合吸附色谱法纯化贻贝粘蛋白的方法，其在混合吸附色谱前采用了凝胶过滤色谱去除部分杂质。在中国发明专利申请 200710179491.0中， Superose 12、 Superose 12 pg分离贻贝粘蛋白采用了含氯化钠的流动相，因此，静电相互作用在一定程度上受到抑制，没能充分发挥多位点吸附的能力。

中国发明专利申请 No. 200710179492.5 公开了一种基于介质 CM Sepharose FF或 CM Sepharose HP的羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法，其组合使用了两种凝胶过滤色谱，该纯化方法主要包括 3个歩骤。在中国发明专利申请 200710179492.5中， CM Sepharose FF和 CM Sepharose HP介质的工作酸碱度是 pH 3-6,在这个范围内，上述两种介质主要发挥离子交换作用，当 pH值降低到 pH l-3时，羧甲基基本离解减少，表面电荷载量迅速下降，主要通过氢键相互作用和静电相互作用分离多酚蛋白质一贻贝粘蛋白。

上述两篇专利申请所涉及的方法分离纯化歩骤多，导致贻贝粘蛋白收率低，仅大约 30-40%，易失活。

因此，需要研究出新的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，以克服传统方法纯化贻贝粘蛋白歩骤多、收率低、活性损失大的问题。发明内容

为了克服使用传统方法纯化贻贝粘蛋白时分辨率低、纯度低、收率低、活性损失大的问题，本发明采用多模式色谱，即离子交换、氢键吸附、疏水吸附三种原理的吸附色谱，提供一种高选择性、高收率、高纯度的贻贝粘蛋白分离纯化方法，简化工艺，降低成本。

本发明的目的是提供一种采用 Capto^TM MMC或 CM Sepharose Fast Flow 介质分离纯化贻贝粘蛋白的方法，可以简单高效地制备高收率、高纯度的贻贝粘蛋白。

本发明的目的是提供一种利用多模式色谱从贻贝中分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下歩骤：

1) 自天然来源的贻贝采取贻贝足丝并破碎；

2) 将破碎得到的贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中进行浸提； 3) 离心或过滤，保留上清；

4) 采用琼脂糖基质的多模式弱阳离子交换树脂进行分离，获得目标贻贝粘蛋白；

5) 脱盐，得到高纯度的贻贝粘蛋白。

根据本发明，所述天然来源的贻贝包括紫贻贝、翡翠贻贝、厚壳贻贝、斑马贻贝，但不限于此。

根据本发明，所述贻贝足丝与提取溶剂的比例是任意的，然而为了提高提取效率并降低成本，优选贻贝足丝与提取溶剂的重量体积比为 1 :1-1 :10。

根据本发明，所述提取溶剂优选为酸性的；更优选 pH值为 1.0-4.6。

根据本发明，所述提取溶剂包括乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸、柠檬酸、高氯酸等，但不限于此。

根据本发明，所述提取溶剂包括 pH值为 1.0-4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液、 1%-10%的乙酸、 0.5-5%的柠檬酸、 0.1-5%的高氯酸等，但不限于此。

根据本发明，所述提取时间是任意的，优选 5-30 mm。

根据本发明，所述浸提优选在 0-25 °C进行。

根据本发明的利用多模式色谱从贻贝中分离纯化贻贝粘蛋白的方法可使用的介质包括 Capto^TM MMC (GE Healthcare )、 CM Sepharose Fast Flow ( GE Healthcare) , 其中， Capto^TM MMC本身是一种多模分离介质，兼具了离子交换、疏水和氢键三种作用， CM Sepharose Fast Flow是一种多模式分离介质。

根据本发明，在采用 Capto™ MMC的多模式色谱从贻贝中分离纯化贻贝粘蛋白的方法的实施方式中，平衡液的 pH值通常在 2-6之间，洗脱液通常是平衡缓冲液中加入一定浓度的盐。特别地，平衡液为弱酸-弱酸盐，例如为乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液等，洗脱液可以例如为甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液添加氯化钠、柠檬酸 -柠檬酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液添加氯化钠等。

根据一个优选的实例，平衡液可以例如，为乙酸-乙酸钠（pH 3.6-5.8) 溶液，洗脱液可以例如，为甘氨酸-氢氧化钠（pH 8.5-10.5)。根据另一优选的实例，平衡液可以例如，为乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 2.6-5.2)，洗脱液可以例如，为乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 2.6-5.2 )添加 0.2-1.2 M氯化钠溶液。根据再一优选的实例，平衡液可以例如，为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0-6.6)，洗脱液可以例如，为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0-6.6)添加 0.2-1.2 M氯化钠溶液。根据本发明，在采用 CM Sepharose Fast Flow的多模式色谱从贻贝中分离纯化贻贝粘蛋白的方法的实施方式中，平衡液的 pH值通常在 2-6之间，洗脱液通常是在缓冲液中添加盐或者是碱性溶液。特别地，平衡液可以例如为乙酸 -乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液等，洗脱液可以例如为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液添加氯化钠、柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液添加氯化钠等。

根据一个优选的实例，平衡液可以例如，为乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 2.6-5.0)，洗脱液可以例如，为乙酸-乙酸钠缓冲液 (pH 2.6-5.0)添加 0.2-1.2M 氯化钠溶液。根据另一个优选的实例，平衡液可以例如，为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0-5.0)，洗脱液可以例如，为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0-5.0) 添加 0.2-1.2M氯化钠溶液。

根据本发明，所述脱盐可采用透析器或脱盐柱进行。

进一歩地，根据本发明，所述脱盐可采用乙酸或柠檬酸或磷酸或盐酸进行透析，或者可采用 Sephadex脱盐柱进行脱盐。

更进一歩地，所述脱盐可采用 0.1-5%的乙酸或 0.1-5%的柠檬酸或 0.1-1M 磷酸或 0.01-1M盐酸进行透析，或者可采用 Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐。

本发明提供了使用以多模式色谱为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，该方法首次将基于琼脂糖基质介质的离子交换、氢键吸附、疏水吸附三种原理的多模式色谱用于贻贝粘蛋白这类多酚蛋白质的分离纯化，处理量大、选择性高，工艺简单，蛋白质收率高。

本发明所涉及分离纯化的核心技术采用琼脂糖基质介质的弱阳离子交换凝胶，通过调整色谱分离流动相等，与贻贝粘蛋白形成多种类型的相互作用，从而提高分离选择性。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而用作创面修复材料，例如用于烧伤、烫伤、褥疮、糖尿病足、慢性溃疡、皮肤缺损、手术切口、创口、口腔修复、种植牙、骨折、器官移植等的治疗。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而用作创面保护材料，例如用于烧伤、烫伤、皮肤缺损、褥疮、糖尿病足、慢性溃疡、手术切口、创口、口腔修复、种植牙等的保护。利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而应用于创口和切口闭合，例如用作皮肤组织、粘膜组织、神经组织、骨骼、牙齿、指甲、毛发等的粘接。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而应用于生物制品生产，例如用作动物细胞、植物细胞、微生物细胞、组织等的培养等。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而应用于组织工程，例如用作人工皮肤、人工肝、人工肾、人工骨等的构建，人工组织和器官的植入，组织器官修复等。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而用于医用设备 /器械的涂层，例如用作人工骨、人工关节、种植体、支架（例如：心脏支架）、检测探头等的涂层。

利用本发明的方法得到的贻贝粘蛋白可设计成不同规格 /形式而应用于工业领域，例如用作电子设备、电子器械、船体等的涂层，从而抗水、抗海水和盐募。附图说明

图 1为 Capto^TM MMC配基结构示意图。

图 2为本发明实施例 1采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。

图 3为本发明实施例 1采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白的电泳检测图。

图 4为本发明实施例 1采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白的特异性染色电泳图； 1 为阴性对照， 2为阳性对照， 3为分离所得的贻贝粘蛋白馏分。

图 5为本发明实施例 1采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白的反相色谱检测图。

图 6为本发明实施例 2采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从翡翠贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。

图 7为本发明实施例 3采用 Capto™ MMC介质多模式色谱从厚壳贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。图 8为本发明实施例 4采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。

图 9为本发明实施例 5采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从翡翠贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。

图 10为本发明实施例 6采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从厚壳贻贝中分离贻贝粘蛋白的色谱图。具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面以实施例来详细说明本发明的技术内容，但本发明的内容并不局限于此。

如无特殊说明，本发明所使用的试验材料、试剂均为市售购买产品。实施例 1、采用 Capto^TM MMC介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白方法：

1) 取活紫贻贝打开贝壳，用镊子夹出足丝，冷冻，使用搅拌器将贻贝足丝以高于 120转 /分钟的速度打碎；

2) 取 200 g贻贝足丝，加入 200 ml的 pH 2.6乙酸-乙酸钠缓冲液作为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 4°C浸提 lO rnin;

3) 以 11000 g离心力离心 35 min，保留上清；

4) 采用 Capto^TM MMC柱，用初始缓冲液乙酸-乙酸钠（pH 5.0) 平衡预装柱 5-10个柱体积后，上样 200 ml上清液，洗脱液为甘氨酸-氢氧化钠（pH 10.6)。洗脱完毕用 1 M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测，洗脱色谱图如图 2所示，箭头所指色谱峰为贻贝粘蛋白；

5) 用 1%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。贻贝粘蛋白的分子量鉴定

采用 15 wt%的十二垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) , 15°C 硝酸银染色 2 h，以高分子量标准蛋白质标记作为参照，如图 3的电泳图谱所示，检测出分子量为 130 kD的目标蛋白质。

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色采用 10 wt%的 SDS-PAGE, 以四氮唑蓝-氨基乙酸溶液（pH 10.0)作为染色液， 15°C染色 2 h，电泳图如附图 4所示，经直接观察，可见蛋白被特异性显色，由此可知所得蛋白即为贻贝粘蛋白。

贻贝粘蛋白纯度的检测

用 Source 15反相色谱柱（Source 15 RPC (CV 7.5 mL))，以乙腈-水进行梯度洗脱，即在 60 min内运行 5%-100%乙腈，上样量为 500 L，检测波长为 280

反相色谱结果如图 5所示，贻贝粘蛋白的吸光值可达到 0.09V, 进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 93% 实施例 2、采用 Capto^TM MMC介质多模式色谱从翡翠贻贝中分离贻贝粘蛋白方法：

1) 取活翡翠贻贝打开贝壳，用镊子取出足丝，冷冻，使用搅拌器将贻贝足丝以高于 120转 /分钟的速度打碎；

2) 取 100 g贻贝足丝，加入 300 ml的 pH 3.6乙酸-乙酸钠缓冲液作为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 01浸提15 111111_;

3) 以 45 μπι滤膜过滤去除残渣，保留上清；

4) 采用 Capto^TM MMC柱，用初始缓冲液乙酸-乙酸钠（pH 5.0) 平衡预装柱 5-10个柱体积后，上样 100 ml上清液，洗脱液为甘氨酸-氢氧化钠（pH 10.6)。洗脱完毕用 1M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测；

5) 用 3%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。

^Τ 贻贝粘蛋白的分子量鉴定

采用 15 wt%十二垸基磺酸钠（SDS) -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) , 硝酸银染色， 20°C染色 2 h，以高分子量标准蛋白质标记，经确认，检测出分子量为 130 kD的目标蛋白质（未图示）。

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色鉴定贻贝粘蛋白

采用 7.5 wt%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE), 染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液（pH 10)， 20°C染色 1.5 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色，经直接观察，可知所得蛋白即为贻贝粘蛋白。 Source 15 RPC (CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脱，即在 60 min内运行 5%-100%乙腈梯度，上样量为 500 L，检测波长为 280 nm。

反相色谱结果如图 6所示，箭头所示为贻贝粘蛋白，进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 87%。实施例 3、采用 Capto^TM MMC介质多模式色谱从厚壳贻贝中分离贻贝粘蛋白方法：

1) 取活厚壳贻贝打开贝壳，用镊子取出足丝，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝 1000转 /分钟打碎；

2) 取 100 g贻贝足丝，加入 500 ml的 pH 2.8乙酸-乙酸钠缓冲液作为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 41浸提12 111111_;

3) 以 10000 g离心力离心 40 min, 保留上清；

4) 采用 Capto^TM MMC柱，用初始缓冲液乙酸-乙酸钠（pH 5.5) 平衡预装柱 10个柱体积后，上样 200 ml上清液，洗脱液为甘氨酸-氢氧化钠 (pH 10.5)。洗脱完毕用 1 M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测；

5) 用 1%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。贻贝粘蛋白的分子量鉴定

采用 15 wt%十二垸基磺酸钠（SDS) -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) , 硝酸银染色， 15°C染色 2 h，以高分子量标准蛋白质标记，经确认，检测出分子量为 130 kD的目标蛋白质。

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色鉴定贻贝粘蛋白

采用 10 wt%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE), 染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液（pH 10)， 15°C染色 2 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色，经直接观察，可知所得蛋白即为贻贝粘蛋白。

贻贝粘蛋白纯度的检测

Source 15 RPC (CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脱，即在 60 min内运行 5%-100%乙腈梯度，上样量为 500 L，检测波长为 280 nm。

反相色谱结果如图 7所示，箭头所示为贻贝粘蛋白，进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 92%。实施例 4、采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从紫贻贝中分离贻贝粘蛋白

方法：

1) 取活紫贻贝打开贝壳，用镊子取出足丝，冷冻，使用搅拌器将贻贝足丝 500转 /分钟打碎；

2) 取 100 g贻贝足丝，加入 1000 ml的 pH 2.6乙酸-乙酸钠缓冲液为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 4°C浸提 lO min;

3) 以 11000 g离心力离心 35 min，保留上清；

4) 采用 CM Sepharose Fast Flow柱，用初始缓冲液乙酸-乙酸钠（pH 2.6) 平衡预装柱 5-10个柱体积后，上样 100 ml上清液，洗脱液为乙酸-乙酸钠（pH 2.6)添加 0.4 M氯化钠溶液。洗脱完毕用 0.5M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测；

5) 用 1%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。

^Τ 贻贝粘蛋白的分子量鉴定

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色鉴定贻贝粘蛋白

采用 10wt%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE), 染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液（pH 10)， 15°C染色 2 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色，经直接观察，可知所得蛋白即为贻贝粘蛋白。

贻贝粘蛋白纯度的检测

Source 15 RPC (CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脱，即在 60 min内运行 5%-100%乙腈梯度，上样量为 500 L，检测波长为 280 nm;

反相色谱结果如图 8所示，箭头所示为贻贝粘蛋白，进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 91%。实施例 5、采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从翡翠贻贝中分离贻贝粘蛋白

方法：

1) 取活翡翠贻贝打开贝壳，用镊子取出足丝，冷冻，使用搅拌器将贻贝足丝以 800转 /分钟转速打碎；

2) 取 100 g贻贝足丝，加入 800 ml的 pH 3.6乙酸-乙酸钠缓冲液作为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 01浸提15 111111_;

3) 以 45 μπι滤膜过滤去除残渣，保留上清；

4) 采用 CM Sepharose Fast Flow柱，用初始缓冲液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0) 平衡预装柱 5-10个柱体积后，上样 100 ml上清液，洗脱液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0)添加 0.8 M氯化钠溶液。洗脱完毕用 0.5 M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测 ·'

5) 用 3%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。贻贝粘蛋白的分子量鉴定

采用 15 wt%十二垸基磺酸钠（SDS) -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) , 硝酸银染色， 20°C染色 2 h，以高分子量标准蛋白质标记，经确认，检测出分子量为 130 kD的目标蛋白质。

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色鉴定贻贝粘蛋白

采用 7.5wt%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) , 染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液（pH 10)， 20°C染色 1.5 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色，经直接观察，可知所得蛋白即为贻贝粘蛋白。

贻贝粘蛋白纯度的检测

反相色谱结果如图 9所示，箭头所示为贻贝粘蛋白，进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 90%。实施例 6、采用 CM Sepharose Fast Flow介质多模式色谱从厚壳贻贝中分离贻贝粘蛋白方法：

1) 取活厚壳贻贝打开贝壳，用镊子取出足丝，冷冻，使用搅拌器将贻贝足丝 600转 /分钟转速打碎；

2) 取 100 g贻贝足丝，加入 600 ml的 pH 2.8乙酸-乙酸钠缓冲液为提取溶剂，使贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中， 4°C浸提 12 min_;

3) 以 10000 g离心力离心 40 min，保留上清；

4) 采用 CM Sepharose Fast Flow柱，用初始缓冲液柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0) 平衡预装柱 5-10个柱体积后，上样 250 ml上清液，洗脱液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0)添加 0.6 M氯化钠溶液。洗脱完毕用 0.5 M氢氧化钠洗脱 5个柱体积， 280 nm检测 ·'

5) 用 1%的乙酸 4°C透析， 4°C保存。贻贝粘蛋白的分子量鉴定

四氮唑蓝（NBT) 特异性染色鉴定贻贝粘蛋白

贻贝粘蛋白纯度的检测

反相色谱结果如图 10所示，箭头所示为贻贝粘蛋白，进一歩根据峰面积百分比计算，贻贝粘蛋白纯度为 88%。

其它实施例

上述实施例的制备方法是示例性的。本领域技术人员可以根据上述实施例的教导，对本发明公开的各参数的取值范围进行组合而得出各技术方案。上文以具体实施方式的形式示例性地描述了本发明，然而本领域熟练技术人员能够联想到那些现有技术中已知的或目前可能无法预见而将来知晓的本领域普遍使用的替代方案、修改、变型、改进和基本上等同的技术方案。因此，本发明的保护范围意欲涵盖这些替代方案、修改、改进和基本上等同的技术方案。

Claims

权利要求书

1、一种分离纯化贻贝粘蛋白的方法，其特征在于，采用基于琼脂糖基质介质的离子交换、氢键吸附、疏水吸附的多模式色谱分离纯化贻贝粘蛋白。

2、如权利要求 1所述的方法，其特征在于，采用 Capto™ MMC或 CM Sepharose Fast Flow介质分离纯化贻贝粘蛋白。

3、如权利要求 2所述的方法，包括下述歩骤：

1) 自天然来源的贻贝采贻贝足丝并破碎；

2) 将破碎得到的贻贝足丝均匀悬浮于提取溶剂中进行浸提；

3) 离心或过滤，保留上清；

4) 采用 Capto^TM MMC或 CM Sepharose Fast Flow介质分离目标蛋白；

5) 脱盐，得到高纯度的贻贝粘蛋白。

4、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述天然来源的贻贝包括紫贻贝、翡翠贻贝、厚壳贻贝、斑马贻贝。

5、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为酸性缓冲液。

6、如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为 pH 1.0-4.6 的缓冲液。

7、如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂包括乙酸 -乙酸钠缓冲液、乙酸、柠檬酸、高氯酸。

8、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述贻贝与所述提取溶剂的重量体积比为 1 :1-1 :10。

9、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述浸提时间为 5-30 min。

10、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述浸提在 0-25 °C进行。

11、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述歩骤 4) 中使用平衡缓冲液和洗脱液，所述平衡缓冲液的 pH值在 2-6之间，所述洗脱液是平衡缓冲液中加入一定浓度的盐或者是碱性溶液。

12、如权利要求 11所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液包括弱酸- 弱酸盐溶液。

13、如权利要求 10 所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为乙酸- 乙酸钠缓冲液、柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，所述洗脱液包括甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液添加氯化钠、柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液添加氯化钠。

14、如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述脱盐采用透析器或脱盐柱进行。

15、如权利要求 14所述的方法，其特征在于，所述脱盐采用乙酸或柠檬酸或磷酸或盐酸进行透析，或者采用 Sephadex脱盐柱进行脱盐。

16、如权利要求 15所述的方法，其特征在于，所述脱盐采用 0.1-5%的乙酸或 0.1-5%的柠檬酸或 0.1-1M 磷酸或 0.01-1M 盐酸进行透析，或者采用 Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐。

17、一种由上述任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白。

18、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白，用作创面修复材料。

19、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白，用作创面保护材料。

20、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白在创口和切口闭合中的应用，例如用作皮肤组织、粘膜组织、神经组织、骨骼、牙齿、指甲、毛发的粘接。

21、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白在生物制品生产中的应用，例如用作动物细胞、植物细胞、微生物细胞、组织的培养。

22、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白在组织工程中的应用，例如用作人工皮肤、人工肝、人工肾、人工骨等的构建，人工组织和器官的植入，组织器官修复。

23、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白，用作医用设备或医学器械的涂层，例如用作人工骨、人工关节、种植体、支架、检测探头的涂层。

24、根据上述权利要求 1-16中任一权利要求所述的方法制备的高纯度贻贝粘蛋白，用作电子设备、电子器械、船体的涂层。