TW201341797A - 使用多模式色譜純化貽貝粘蛋白之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種使用多模式色譜分離純化貽貝粘蛋白之方法。本發明採用一多模式色譜，即離子交換、氫鍵吸附、疏水吸附三種原理之色譜，提供一種高選擇性、高收率的貽貝粘蛋白分離純化方法，克服使用習知方法分離純化貽貝粘蛋白收率低之問題。採用強酸提取，利用耐高鹽的弱陽離子交換凝膠複合具有疏水及氫鍵吸附作用配基介質分離純化貽貝粘蛋白，採用十二烷基磺酸钠-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，透過四氮唑藍特異性顯色鑒別貽貝粘蛋白。在一種分離介質上利用三種原理分離貽貝粘蛋白，形成了高選擇性，簡化了純化製程，降低了生產成本。

Description

使用多模式色譜純化貽貝粘蛋白之方法

本發明係關於一種分離純化貽貝粘蛋白之方法。特別地，本發明係關於一種使用多模式色譜從貽貝中分離純化貽貝粘蛋白之方法。

貽貝俗稱「海紅」、「淡菜」，屬寒溫帶、廣鹽性種類，在全球各海域均有不同種類存在，中國約有50種。分佈在熱帶和亞熱帶的翡翠貽貝(Perna viridis)、分佈在寒帶和溫帶的紫貽貝(Mytilus edulis)和厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是世界各國重要的養殖和捕撈對象。

貽貝粘蛋白(Mussel adhesive protein,MAP)是一種多元酚鹼性蛋白，最初在紫貽貝中發現，故而也稱作紫貽貝足絲蛋白(Mytilus edulis foot protein,Mefp)，後來發現其廣泛存在於多種貽貝中。貽貝具有耐受近海波浪影響的能力，它在特殊腺體內生成並儲存一種蛋白膠，透過足絲將蛋白膠釋放到岩石之類的固體表面上，形成抗水的結合，進而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，用於足絲附著之基材表面被含有一些酚腺分泌物和粘液的分散體所覆蓋，分散體覆蓋基材表面，由漿液纖毛塗布成50納米厚的膜，有很強的抗張強度(10⁶-10⁷牛頓．米^-2)，進一步對膜內物質的分析顯示其包含有貽貝粘蛋白MAP。

在酸性條件下，貽貝粘蛋白MAP表面帶正電荷，可採用離子交換方法進行分離。貽貝粘蛋白含有L-3,4-二羥基苯丙氨酸 (L-DOPA)，L-DOPA由酪氨酸酶對酪氨酸殘基的作用形成，L-DOPA殘基由於氧化反應而相互交聯，交聯反應導致貽貝與特殊表面強而持久的膠接，其生物粘附的機理很有趣。貽貝粘蛋白粘附對人類沒有毒性和免疫原性，結合能力和壽命不受水的影響，因而在作為醫用手術膠，尤其是眼科手術膠方面的應用已經引起了注意。

全世界每年進行約1100萬例白內障手術，我國白內障的發病率非常高，50歲以上人群中的白內障發病率為29.64%，70歲以上人群發病率高達60%。隨著社會老齡化的加劇，這一數字還會上升。目前主要採用兩種閉合方式結束眼科手術：使傷口自行癒合或是利用尼龍綫縫合切口，這兩種閉合方法會存在自愈感染和眼內液體洩露以及縫合後感染發炎及血管發育異常的危險。而貽貝粘蛋白能在低濃度下交聯，並形成可注射到不規則形狀部位的低粘性液體，這種溶液可凝固而填充到指定空間，在幾分鐘內可封閉切口，比縫合所需時間短。貽貝粘蛋白還可形成一個不可破壞的封條，在大於正常人眼壓12倍的壓力下，眼內液體也不會發生洩露。此外，貽貝粘蛋白具有與眼角膜近似的折射率，不會幹擾光綫到達視網膜。

貽貝粘蛋白的純化通常組合應用以下技術：提取、鹽析、示差沉澱、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜、親和色譜和分子排阻色譜，但活性蛋白質的收率低，僅為15%。此外，習知的提取純化技術製程複雜，規模製備成本高、週期長、對pH值和鹽濃度敏感而導致穩定性難以控制，因而有必要研究新的色 譜方法來獲取高純度、高活性的貽貝粘蛋白。

離子交換色譜法是蛋白質分離中最常用的方法之一，它具有處理量大、效率高等優點，缺點是對於具有相似電離特性的蛋白分辨率差，因此，採用離子交換色譜法通常可以從樣品中製備一組具有相似特性的蛋白質。

多模式色譜介質是利用離子交換介質基質上的基團及鍵合的功能基團與貽貝粘蛋白分子所具有的多種表面基團作用，可表現出多種相互作用，如離子作用、疏水作用、氫鍵作用等以提高介質對樣品的選擇性分離能力。貽貝粘蛋白中富含多酚基團，其酚羥基是氫鍵供體，可使用包含適當氫鍵受體的吸附劑的氫鍵色譜進行分離；其苯環結構可形成疏水鍵，可利用疏水相互作用進行分離。因此，可利用貽貝粘蛋白結構中的這些特點，採用離子交換複合氫鍵吸附及疏水作用原理進行分離。

在蛋白分離介質中，常用的基質材料包含瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和矽膠等。瓊脂糖介質是目前生物醫藥研發和生產中最普遍使用的規模製備用分離介質，瓊脂糖基質具有高孔度(90-96%)，即使在高濃度下也能保持高的孔度；具有連接纖維的開放的結構；高連通性有效保證了分子內的物質傳遞；大比表面積可提供很高的吸附能力，易製備成不同瓊脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領域的需求；在氫氧化鈉中穩定，可滿足苛刻的在位清洗步驟；非特異性吸附低使得應用面較廣；具有彈性及非脆性(較易實現柱子的再裝填)又可透過足夠的交聯步驟使介質具有剛性(有較高的耐壓性能)；可利用不同的活化步驟進 行共價交聯而活化，可被大量配基取代而應用於多種吸附色譜技術。

中國發明專利申請No.200710179491.0揭露了一種以介質Superose 12、Superose 12 pg為核心的混合吸附色譜法純化貽貝粘蛋白的方法，其在混合吸附色譜前採用了凝膠過濾色譜去除部分雜質。在中國發明專利申請200710179491.0中，Superose 12、Superose 12 pg分離貽貝粘蛋白採用了含氯化鈉的流動相，因此，靜電相互作用在一定程度上受到抑制，沒能充分發揮多位點吸附的能力。

中國發明專利申請No.200710179492.5揭露了一種基於介質CM Sepharose FF或CM Sepharose HP的羧甲基離子交換色譜純化貽貝粘蛋白的方法，其組合使用了兩種凝膠過濾色譜，此純化方法主要包含3個步驟。在中國發明專利申請200710179492.5中，CM Sepharose FF和CM Sepharose HP介質的工作酸鹼度是pH 3-6，在這個範圍內，上述兩種介質主要發揮離子交換作用，當pH值降低到pH 1-3時，羧甲基基本離解減少，表面電荷載量迅速下降，主要透過氫鍵相互作用和靜電相互作用分離多酚蛋白質-貽貝粘蛋白。

上述兩篇專利申請所涉及的方法分離純化步驟多，導致貽貝粘蛋白收率低，僅大約30-40%，易失活。

因此，需要研究出新的分離純化貽貝粘蛋白的方法，以克服習知方法純化貽貝粘蛋白步驟多、收率低、活性損失大的問題。

為了克服使用習知方法純化貽貝粘蛋白時分辨率低、純度低、收率低、活性損失大的問題，本發明旨在提供一種高選擇性、高收率、高純度的貽貝粘蛋白分離純化方法，其係採用一多模式色譜，即離子交換、氫鍵吸附、疏水吸附三種原理的一吸附色譜，以簡化製程，降低成本。

本發明之目的提供一種採用一Capto^TM MMC介質或一CM Sepharose Fast Flow介質分離純化貽貝粘蛋白之方法，可以簡單高效地製備高收率、高純度的貽貝粘蛋白。

為了獲得本發明的這些目的和其他特徵，依照本發明之一方面，本發明之實施例係提供了一種利用多模式色譜從貽貝中分離純化貽貝粘蛋白之方法，包含以下步驟：1)自一天然來源的貽貝採取一貽貝足絲並破碎；2)將破碎得到的貽貝足絲均勻懸浮於一提取溶劑中進行浸提，得到一浸提液；3)離心或過濾此浸提液，保留上清；4)採用一瓊脂糖基質的一多模式弱陽離子交換樹脂進行分離，獲得一目標貽貝粘蛋白；以及5)脫鹽，以得到一高純度的貽貝粘蛋白。

依照本發明之實施例，天然來源的貽貝包含一紫貽貝、一翡翠貽貝、一厚殼貽貝、一斑馬貽貝，但不限於此。

依照本發明之實施例，貽貝足絲與提取溶劑的比例是任意的，然而為了提高提取效率並降低成本，較佳地，貽貝足絲與提取溶劑的重量體積比為1：1-1：10。

依照本發明之實施例，提取溶劑優選為酸性的；更佳地，pH 值為1.0-4.6。

依照本發明之實施例，提取溶劑包含一乙酸-乙酸鈉緩衝液、一乙酸、一檸檬酸、一高氯酸等，但不限於此。

依照本發明之實施例，提取溶劑包含pH值為1.0-4.6的一乙酸-乙酸鈉緩衝液、1%-10%的一乙酸、0.5-5%的一檸檬酸、0.1-5%的一高氯酸等，但不限於此。

依照本發明之實施例，提取時間是任意的，較佳地，5-30 min。

依照本發明之實施例，較佳地，浸提在0-25℃進行。

依照本發明之實施例之利用多模式色譜從貽貝中分離純化貽貝粘蛋白之方法可使用的介質包含一Capto^TM MMC(GE Healthcare)、一CM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)，其中，CaptoTM MMC本身是一種多模分離介質，兼具了離子交換、疏水和氫鍵三種作用，CM Sepharose Fast Flow是一種多模式分離介質。

依照本發明之實施例，在採用Capto^TM MMC的多模式色譜從貽貝中分離純化貽貝粘蛋白之方法的實施方式中，一平衡液的pH值通常在2-6之間，一洗脫液通常是此平衡緩衝液中加入一定濃度的鹽。特別地，此平衡液為一弱酸-弱酸鹽，例如為一乙酸-乙酸鈉緩衝液、一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、一檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液等，此洗脫液可以例如為一甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、一乙酸-乙酸鈉緩衝液添加一氯化鈉、一檸檬酸-檸檬酸鈉、一檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液添加一氯化鈉等。

依照一較佳的實例，平衡液可以例如，為一乙酸-乙酸鈉(pH 3.6-5.8)溶液，洗脫液可以例如，為一甘氨酸-氫氧化鈉(pH 8.5-10.5)。依照另一較佳的實例，平衡液可以例如，為一乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH 2.6-5.2)，洗脫液可以例如，為一乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH 2.6-5.2)添加一0.2-1.2 M氯化鈉溶液。依照再一較佳的實例，平衡液可以例如，為一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0-6.6)，洗脫液可以例如，為一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0-6.6)添加一0.2-1.2 M氯化鈉溶液。

依照本發明之實施例，在採用CM Sepharose Fast Flow的多模式色譜從貽貝中分離純化貽貝粘蛋白之方法的實施方式中，平衡液的pH值通常在2-6之間，洗脫液通常是在緩衝液中添加鹽或者是一鹼性溶液。特別地，平衡液可以例如為一乙酸-乙酸鈉緩衝液、一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液等，洗脫液可以例如為一甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、一乙酸-乙酸鈉緩衝液添加一氯化鈉、一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液添加一氯化鈉等。

依照一較佳的實例，平衡液可以例如，為一乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH 2.6-5.0)，洗脫液可以例如，為一乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH 2.6-5.0)添加一0.2-1.2M氯化鈉溶液。依照另一較佳的實例，平衡液可以例如，為一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0-5.0)，洗脫液可以例如，為一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0-5.0)添加一0.2-1.2M氯化鈉溶液。

依照本發明之實施例，脫鹽可採用一透析器或一脫鹽柱進行。

進一步地，依照本發明之實施例，脫鹽可採用一乙酸或一檸檬酸或一磷酸或一鹽酸進行透析，或者可採用一Sephadex脫鹽柱進行脫鹽。

更進一步地，脫鹽可採用0.1-5%的一乙酸或0.1-5%的一檸檬酸或一0.1-1M磷酸或一0.01-1M鹽酸進行透析，或者可採用一Sephadex G-25脫鹽柱進行脫鹽。

本發明提供了使用以多模式色譜為核心的分離純化貽貝粘蛋白之方法，此方法首次將基於一瓊脂糖基質介質的離子交換、氫鍵吸附、疏水吸附三種原理的一多模式色譜用於貽貝粘蛋白這類多酚蛋白質的分離純化，處理量大、選擇性高，製程簡單，蛋白質收率高。

本發明所涉及分離純化的核心技術採用一瓊脂糖基質介質的弱陽離子交換凝膠，透過調整色譜分離流動相等，與貽貝粘蛋白形成多種類型的相互作用，進而提高分離選擇性。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而用作一創面修復材料，例如用於燒傷、燙傷、褥瘡、糖尿病足、慢性潰瘍、皮膚缺損、手術切口、創口、口腔修復、種植牙、骨折、器官移植等的治療。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而用作一創面保護材料，例如用於燒傷、燙傷、皮膚缺損、褥瘡、糖尿病足、慢性潰瘍、手術切口、創口、口腔修復、種植牙等的保護。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而應用於一創口和一切口閉合，例如用作一皮膚組織、一粘膜組織、一神經組織、骨胳、牙齒、指甲、毛髮等的粘接。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式 而應用於一生物製品生產，例如用作一動物細胞、一植物細胞、一微生物細胞、一組織等的培養等。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而應用於一組織工程，例如用作人工皮膚、人工肝、人工腎、人工骨等的構建，人工組織和器官的植入，組織器官修復等。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而用於一醫用設備/器械的塗層，例如用作人工骨、人工關節、種植體、支架(例如：心臟支架)、檢測探頭等的塗層。

利用本發明的方法得到的貽貝粘蛋白可設計成不同規格/形式而應用於一工業領域，例如用作一電子設備、一電子器械、一船體等的塗層，進而抗水、抗海水和鹽霧。

本發明其他的優點、目的和特徵將在如下的說明書中部分地加以闡述，並且本發明其他的優點、目的和特徵對於本領域的普通技術人員來說，可以透過本發明如下的說明得以部分地理解或者可以從本發明的實踐中得出。本發明的目的和其他優點可以透過本發明所記載的說明書和申請專利範圍中特別指明的結構並結合圖式部份，得以實現和獲得。

為了更好地理解本發明的實質，下面以實施例來詳細說明本發明的技術內容，但本發明的內容並不局限於此。

如無特殊說明，本發明所使用的試驗材料、試劑均為市售購買產品。

實施例1、採用Capto ^TM MMC介質多模式色譜從紫貽貝中 分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活紫貽貝打開貝殼，用鑷子夾出足絲，冷凍，使用攪拌器將貽貝足絲以高於120轉/分鐘的速度打碎；2)取200 g貽貝足絲，加入200 ml的一pH 2.6乙酸-乙酸鈉緩衝液作為一提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，4℃浸提10 min，得到一浸提液；3)以一11000 g離心力離心得到的浸提液35 min，保留上清；4)採用一Capto^TM MMC柱(其配基結構如「第1圖」所示)，用一初始緩衝液乙酸-乙酸鈉(pH 5.0)平衡預裝柱5-10個柱體積後，上樣200 ml上清液，洗脫液為甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10.6)。洗脫完畢用1 M氫氧化鈉洗脫5個柱體積，280 nm檢測，洗脫色譜圖如「第2圖」所示，箭頭所指色譜峰為貽貝粘蛋白；以及5)用1%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，15℃硝酸銀染色2h，以高分子量標準蛋白質標記作為參照，如「第3圖」的電泳圖譜所示，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質。

四氮唑藍(NBT)特異性染色

採用10 wt%的SDS-PAGE，以四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10.0)作為染色液，15℃染色2h，電泳圖如「第4圖」所示，經直接觀察，可見蛋白被特異性顯色，由此可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

用Source 15反相色譜柱(Source 15 RPC(CV 7.5 mL))，以乙腈-水進行梯度洗脫，即在60 min內運行5%-100%乙腈，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm。

反相色譜結果如「第5圖」所示，貽貝粘蛋白的吸光值可達到0.09V，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為93%。

實施例2、採用Capto ^TM MMC介質多模式色譜從翡翠貽貝中分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活翡翠貽貝打開貝殼，用鑷子取出足絲，冷凍，使用攪拌器將貽貝足絲以高於120轉/分鐘的速度打碎；2)取100 g貽貝足絲，加入300 ml的一pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩衝液作為提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，0℃浸提15 min，得到一浸提液；3)以45 μm濾膜過濾得到的浸提液，去除殘渣，保留上清；4)採用Capto^TM MMC柱，用初始緩衝液乙酸-乙酸鈉(pH 5.0)平衡預裝柱5-10個柱體積後，上樣100 ml上清液，洗脫液為甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10.6)。洗脫完畢用1M氫氧化鈉洗脫5 個柱體積，280 nm檢測；以及5)用3%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，20℃染色2h，以高分子量標準蛋白質標記，經確認，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質(未圖示)。

四氮唑藍(NET)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白

採用7.5 wt%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10)，20℃染色1.5 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色，經直接觀察，可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

Source 15 RPC(CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脫，即在60 min內運行5%-100%乙腈梯度，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm。

反相色譜結果如「第6圖」所示，箭頭所示為貽貝粘蛋白，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為87%。

實施例3、採用Capto ^TM MMC介質多模式色譜從厚殼貽貝中分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活厚殼貽貝打開貝殼，用鑷子取出足絲，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲1000轉/分鐘打碎； 2)取100 g貽貝足絲，加入500 ml的一pH 2.8乙酸-乙酸鈉緩衝液作為提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，4℃浸提12 min，得到一浸提液；3)以一10000 g離心力離心得到的浸提液40 min，保留上清；4)採用Capto^TM MMC柱，用初始緩衝液乙酸-乙酸鈉(pH 5.5)平衡預裝柱10個柱體積後，上樣200 ml上清液，洗脫液為甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10.5)。洗脫完畢用1 M氫氧化鈉洗脫5個柱體積，280 nm檢測；以及5)用1%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，15℃染色2 h，以高分子量標準蛋白質標記，經確認，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質。

四氮唑藍(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白

採用10 wt%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10)，15℃染色2 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色，經直接觀察，可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

Source 15 RPC(CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脫，即在60 min 內運行5%-100%乙腈梯度，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm。

反相色譜結果如「第7圖」所示，箭頭所示為貽貝粘蛋白，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為92%。

實施例4、採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活紫貽貝打開貝殼，用鑷子取出足絲，冷凍，使用攪拌器將貽貝足絲500轉/分鐘打碎；2)取100 g貽貝足絲，加入1000 ml的一pH 2.6乙酸-乙酸鈉緩衝液為提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，4℃浸提10 min，得到一浸提液；3)以一11000 g離心力離心得到的浸提液35 min，保留上清；4)採用CM Sepharose Fast Flow柱，用初始緩衝液乙酸-乙酸鈉(pH 2.6)平衡預裝柱5-10個柱體積後，上樣100 ml上清液，洗脫液為乙酸-乙酸鈉(pH 2.6)添加0.4 M氯化鈉溶液。洗脫完畢用0.5M氫氧化鈉洗脫5個柱體積，280 nm檢測；以及5)用1%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，15℃染色2 h，以高分子量標準蛋白質標 記，經確認，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質。

四氮唑藍(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白

採用10wt%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10)，15℃染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色，經直接觀察，可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

Source 15 RPC(CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脫，即在60 min內運行5%-100%乙腈梯度，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm；反相色譜結果如「第8圖」所示，箭頭所示為貽貝粘蛋白，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為91%。

實施例5、採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從翡翠貽貝中分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活翡翠貽貝打開貝殼，用鑷子取出足絲，冷凍，使用攪拌器將貽貝足絲以800轉/分鐘轉速打碎；2)取100 g貽貝足絲，加入800 ml的一pH 3.6乙酸-乙酸鈉緩衝液作為提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，0℃浸提15 min，得到一浸提液；3)以45 μm濾膜過濾得到的浸提液，去除殘渣，保留上清；4)採用CM Sepharose Fast Flow柱，用初始緩衝液檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)平衡預裝柱5-10個柱體積後，上樣100 ml上清液，洗脫液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)添加0.8 M 氯化鈉溶液。洗脫完畢用0.5 M氫氧化鈉洗脫5個柱體積，280 nm檢測；以及5)用3%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，20℃染色2 h，以高分子量標準蛋白質標記，經確認，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質。

四氮唑藍(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白

採用7.5wt%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10)，20℃染色1.5 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色，經直接觀察，可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

Source 15 RPC(CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脫，即在60 min內運行5%-100%乙腈梯度，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm。

反相色譜結果如「第9圖」所示，箭頭所示為貽貝粘蛋白，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為90%。

實施例6、採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從厚殼貽貝中分離貽貝粘蛋白 方法：

1)取一活厚殼貽貝打開貝殼，用鑷子取出足絲，冷凍，使 用攪拌器將貽貝足絲600轉/分鐘轉速打碎；2)取100 g貽貝足絲，加入600 ml的一pH 2.8乙酸-乙酸鈉緩衝液為提取溶劑，使貽貝足絲均勻懸浮於提取溶劑中，4℃浸提12 min，得到一浸提液；3)以一10000 g離心力離心得到的浸提液40 min，保留上清；4)採用CM Sepharose Fast Flow柱，用初始緩衝液檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.0)平衡預裝柱5-10個柱體積後，上樣250 ml上清液，洗脫液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.0)添加0.6 M氯化鈉溶液。洗脫完畢用0.5 M氫氧化鈉洗脫5個柱體積，280 nm檢測；以及5)用1%的乙酸4℃透析，4℃保存。

檢測： 貽貝粘蛋白的分子量鑒定

採用15 wt%十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，15℃染色2 h，以高分子量標準蛋白質標記，經確認，檢測出分子量為130 kD的目標蛋白質。

四氮唑藍(NBT)特異性染色鑒定貽貝粘蛋白

採用10 wt%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH 10)，15℃染色2 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色，經直接觀察，可知所得蛋白即為貽貝粘蛋白。

貽貝粘蛋白純度的檢測

Source 15 RPC(CV 7.5 mL)，以乙腈-水梯度洗脫，即在60 min內運行5%-100%乙腈梯度，上樣量為500 μ L，檢測波長為280 nm。

反相色譜結果如「第10圖」所示，箭頭所示為貽貝粘蛋白，進一步依照峰面積百分比計算，貽貝粘蛋白純度為88%。

其它實施例

上述實施例的製備方法是示例性的。本領域技術人員可以依照上述實施例的教導，對本發明揭露的各參數的取值範圍進行組合而得出各技術方案。

上文以具體實施方式的形式示例性地描述了本發明，然而本領域熟練技術人員能夠聯想到那些現有技術中已知的或目前可能無法預見而將來知曉的本領域普遍使用的替代方案、修改、變型、改進和基本上等同的技術方案。因此，本發明的保護範圍意欲涵蓋這些替代方案、修改、改進和基本上等同的技術方案。

1‧‧‧陰性對照

2‧‧‧陽性對照

3‧‧‧分離所得的貽貝粘蛋白餾分

第1圖為Capto^TM MMC配基結構示意圖。

第2圖為本發明實施例1採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖；第3圖為本發明實施例1採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白的電泳檢測圖；第4圖為本發明實施例1採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白的特異性染色電泳圖；1為陰性對照， 2為陽性對照，3為分離所得的貽貝粘蛋白餾分；第5圖為本發明實施例1採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白的反相色譜檢測圖；第6圖為本發明實施例2採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從翡翠貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖；第7圖為本發明實施例3採用Capto^TM MMC介質多模式色譜從厚殼貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖；第8圖為本發明實施例4採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從紫貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖；第9圖為本發明實施例5採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從翡翠貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖；以及第10圖為本發明實施例6採用CM Sepharose Fast Flow介質多模式色譜從厚殼貽貝中分離貽貝粘蛋白的色譜圖。

Claims (24)

1. 一種分離純化貽貝粘蛋白之方法，係採用基於一瓊脂糖基質介質的離子交換、氫鍵吸附、疏水吸附的一多模式色譜分離純化一貽貝粘蛋白。
2. 如請求項第1項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中採用一Capto^TM MMC介質或一CM Sepharose Fast Flow介質分離純化該貽貝粘蛋白。
3. 如請求項第2項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，包含下述步驟：1)自一天然來源的貽貝采一貽貝足絲並破碎；2)將破碎得到的該貽貝足絲均勻懸浮於一提取溶劑中進行浸提，得到一浸提液；3)離心或過濾該浸提液，保留上清；4)採用該Capto^TM MMC介質或該CM Sepharose Fast Flow介質分離一目標蛋白；以及5)脫鹽，以得到一高純度的貽貝粘蛋白。
4. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該天然來源的貽貝包含一紫貽貝、一翡翠貽貝、一厚殼貽貝、一斑馬貽貝。
5. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該提取溶劑為一酸性緩衝液。
6. 如請求項第5項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該提 取溶劑為pH 1.0-4.6的一緩衝液。
7. 如請求項第5項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該提取溶劑包含一乙酸-乙酸鈉緩衝液、一乙酸、一檸檬酸、一高氯酸。
8. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該貽貝與該提取溶劑的重量體積比為1：1-1：10。
9. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該浸提時間為5-30 min。
10. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該浸提在0-25℃進行。
11. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該步驟4)中使用一平衡緩衝液和一洗脫液，該平衡緩衝液的pH值在2-6之間，該洗脫液是該平衡緩衝液中加入一一定濃度的鹽或者是一鹼性溶液。
12. 如請求項第11項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該平衡緩衝液包含一弱酸-弱酸鹽溶液。
13. 如請求項第10項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該平衡緩衝液為一乙酸-乙酸鈉緩衝液、一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、一檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液，該洗脫液包含一甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、一乙酸-乙酸鈉緩衝液添加一氯化鈉、一檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液添加一氯化鈉。
14. 如請求項第3項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該脫鹽採用一透析器或一脫鹽柱進行。
15. 如請求項第14項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該脫鹽採用一乙酸或一檸檬酸或一磷酸或一鹽酸進行透析，或者採用一Sephadex脫鹽柱進行脫鹽。
16. 如請求項第15項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法，其中該脫鹽採用0.1-5%的一乙酸或0.1-5%的一檸檬酸或一0.1-1M磷酸或一0.01-1M鹽酸進行透析，或者採用一Sephadex G-25脫鹽柱進行脫鹽。
17. 一種由上述任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白。
18. 一種依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白，係用作一創面修復材料。
19. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白，係用作一創面保護材料。
20. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白在一創口和一切口閉合中的應用，例如用作一皮膚組織、一粘膜組織、一神經組織、骨骼、牙齒、指甲、毛髮的粘接。
21. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋 白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白在一生物製品生產中的應用，例如用作一動物細胞、一植物細胞、一微生物細胞、一組織的培養。
22. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白在一組織工程中的應用，例如用作人工皮膚、人工肝、人工腎、人工骨等的構建，人工組織和器官的植入，組織器官修復。
23. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白，係用作醫用設備或醫學器械的塗層，例如用作人工骨、人工關節、種植體、支架、檢測探頭的塗層。
24. 依照上述請求項1-16中任一請求項所述之分離純化貽貝粘蛋白之方法製備的高純度貽貝粘蛋白，係用作一電子設備、一電子器械、一船體的塗層。