CN1141395C - 金属硫蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种用蛋白质工程技术高效制备金属硫蛋白的方法。现有技术一直难以得到比较高的产率，虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法，但是仍存在产率低这个不足之处。本发明用基因工程方法构建金属硫蛋白或其突变体基因的表达质粒，转入大肠杆菌工程菌中培养发酵，诱导后加入金属离子，继续培养，收集菌体。菌体超声破菌、离心后用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析柱静态吸附，柱上凝血酶酶切，再经柱层析脱盐，盐梯度洗脱，收集目标蛋白。本发明方法可得纯度达95%以上的目标蛋白。用本发明方法制备的猴金属硫蛋白I的六个突变体蛋白，产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。

Description

金属硫蛋白的制备方法
技术领域
本发明是一种用蛋白质工程高效制备金属硫蛋白的方法。
背景技术
金属硫蛋白(Metallothioneins，简称MTs)
本发明涉及金属硫蛋白(Metallothioneins，MTs)的蛋白质工程制备方法。金属硫蛋白是一类富含巯基(半胱氨酸约占总氨基酸数的1/3)和金属离子(每分子含6-7个Zn2+)的低分子量的蛋白。金属硫蛋白在生物界广泛分布，是一类有许多重要生理功能的蛋白，如调控锌、铜等离子的体内平衡，重金属的解毒，清除体内活性氧自由基等等。为研究金属硫蛋白的结构和功能，开发金属硫蛋白的用途，需要大量得到金属硫蛋白。为此发展了许多表达金属硫蛋白的方法。但由于哺乳动物的金属硫蛋白在大肠杆菌内的不稳定性，脱金属硫蛋白对细胞的毒性以及细胞对金属离子的耐受性差等原因，一直难以获得比较高的产率。融合蛋白表达技术为不稳定蛋白和毒性蛋白的表达提供了一种新技术。Xiong和Cols等于1997年同时发表用谷胱甘肽硫转移酶(GST)和金属硫蛋白形成融合蛋白来表达金属硫蛋白，但由于表达条件及纯化条件的不完善，不合理，所以表达产率仍比较低(约3-5mg/L发酵液)。Hong等于2001年用Intrein融合蛋白技术，表达金属硫蛋白获得了比较高的产率，但只用于野生型蛋白的表达，并且成本比较高。
发明内容
本发明的目的是研究一种操作简单，成本较低，产率高，纯度高，蛋白兼容性好的金属硫蛋白的制备方法。
本发明首先用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白GST融合蛋白或其突变体基因，该方法本领域技术人员均能用现有技术实现。
将上述产物的大肠杆菌工程菌接种于2YT(含100μg/ml氨苄青霉素)培养液，常规温度35～38℃下快速振荡培养7～16小时，再用新鲜2YT按1∶90～100比例稀释后，继续在常规温度下扩大培养3～4小时，当A600＝0.6-1.0时，加入异丙基B-硫代半乳糖甙(ITPG)至终浓度0.001～1.0mM时，加入金属离子，如Cd2+，Zn2+等，至其浓度是0.1～5.0mM时，继续培养3～6小时，离心收集菌体。
上述菌体超声波破菌，离心后，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，吸附效果用谷胱甘肽硫转移酶(GST)反应来检测，用磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗至UVA280的吸收小于0.02时，用缓冲溶液洗去磷酸盐；再用凝血酶酶切缓冲液淋洗，室温下静置酶切，酶切时淋洗液中加入金属离子如Cd2+，Zn2+等，至其浓度为0.1～1.0mM。酶切后经柱层析脱盐，离子交换柱层析柱吸附，盐梯度洗脱等步骤纯化，即可获得目标蛋白。
本发明的表达载体可以是pGEX-4T-2等质粒；工程菌可以是大肠杆菌，如缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21等；用GST的酶反应监测破菌效率和柱结合效率。
本发明常规培养，再经稀释后继续扩大培养的温度是30～35℃。
本发明中酶切时加入的金属离子是两价金属离子如Cd2+，Zn2+等。
本发明用凝血酶酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，在室温下，如15～25℃下静置酶切7～16小时。最后经脱盐，盐梯度洗脱等纯化步骤即可获纯度高达95％以上的目标蛋白。
本发明用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白，亲和柱静态吸附、凝血酶静态酶切方法分离、纯化表达产物，在表达、纯化过程中通过加入金属离子，大大提高了制备效率和产品纯度，成本低，制备蛋白的兼容性好，为高效制备金属硫蛋白提供了有广阔应用应用前景的方法。
具体实施方式
用缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21作为发酵工程菌。
在金属硫蛋白及其突变体基因上，用PCR方法接入BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)两个内切酶位点，然后将其组装在pGEX-4T-2质粒上，构建成表达质粒。
将表达质粒转入BL21中，小规模培养后，与甘油溶液(65％(V/V)甘油，0.1M MgSO4，25mM Tris-HCl，pH 8.0)1∶1混合均匀，制成甘油菌，-70℃长期保存。发酵前，将含表达质粒的BL21从-70℃取出，接入新鲜2YT(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃快速振荡(270-330rpm)培养7-16小时，按1∶100转接后，30～35℃继续扩大培养至A600＝0.6-1.0，加入IPTG至终浓度0.01-1.0mM，继续培养，然后加入金属离子如Cd2+至终浓度为0.1-5.0mM，继续培养3-6小时，4℃离心收集菌体。
菌体沉淀重悬于1×PBS(含10mM巯基乙醇)中，加溶菌酶(1.5mg/g湿菌体)消化约1小时后，超声波破菌，随后高速离心，用CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)作底物的GST的酶反应，监测破菌效率，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，GST的酶反应监测结合效率，用1×PBS溶液淋洗至UV A280吸收小于0.02，用Tris-HCl缓冲溶液淋洗，再用加有Cd2+的酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入2倍柱体积的凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，静置酶切(25℃，10小时)，得含少量凝血酶和目标蛋白的流出液，再经Sephadex G-25柱层析脱盐，经过DEAE-Cellulose DE52离子交换层析柱吸附，用0-1.0M NaCl的缓冲溶液线性盐梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，浓缩，脱盐后，得到纯度达95％以上的目标蛋白。
根据上述事例，制备了猴MT1野生型重组蛋白。
产品经12％ SDS-PAGE电泳，呈现单一条带，分子量经ESI-MS测定为6284.07 Dalton(计算值为6285.27 Da)。其UV、CD光谱与生物体中获得的野生型蛋白的完全相同。
根据本发明，我们制备了猴MT1的六个突变体蛋白。产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。

Claims (3)

1.一种金属硫蛋白的制备方法，其特征是：
(1)用蛋白质工程技术构建出表达金属硫蛋白GST融合蛋白的大肠杆菌工程菌；
(2)将金属硫蛋白GST融合蛋白的大肠杆菌工程菌接种于2YT培养液，常规培养7～16小时，然后用2YT稀释90-100倍后继续扩大培养3～4小时，然后加入IPTG至浓度0.001～1.0mM继续培养，再加入两价金属离子至其浓度是0.1～5.0mM，继续培养3～6小时；
(3)菌体超声波破菌，离心，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态吸附，淋洗液中加入两价金属离子至其浓度是0.1～1.0mM，在亲和柱上凝血酶静置酶切，再经柱层析，脱盐，分离纯化即可。
2.根据权利要求1所述的金属硫蛋白的制备方法，其特征是稀释后扩大培养的温度是30～35℃。
3.根据权利要求1所述的金属硫蛋白的制备方法，其特征是静态酶切是在室温下酶切7-16小时。
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