CN113151221A - 一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及涉及生物技术和分子生物学领域，更具体地，涉及一种α‑半乳糖苷酶及克隆表达方法。该方法包括利用解淀粉乳杆菌L6获取α‑半乳糖苷酶基因；将所述α‑半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；将所述转化后的重组质粒进行筛选；利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。本申请首次对来自解淀粉乳杆菌的α‑Gal在大肠杆菌BL21中进行克隆表达，通过亲和层析的方法可以大量制备比较纯的酶液，具有较强的水解α‑半乳糖苷键的活性。

Description

一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达

技术领域

本发明涉及生物技术和分子生物学领域，更具体地，涉及一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-GLA)属于外切糖苷酶，能够专一的水解不同化合物分子非还原端的α-半乳糖苷键，该酶存在于各种生物体内如细菌、真菌、植物、动物当中。该酶在食品、饲料、造纸、医药等行业具有广泛的应用价值，可以去除豆粕、豆制品中的胀气因子，缓解胀气反应，水解甘露糖主链上的α-半乳糖，提高凝胶能力进而改善纸浆的品质，水解神经酰胺三己糖苷末端的α-半乳糖基治疗法布里病，还可以用于血型的转换等。

但是现有技术中，半乳糖苷酶基因的来源还比较单一，鲜有介绍来自于解淀粉乳杆菌L6的半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21中进行克隆表达的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种α-半乳糖苷酶及克隆表达方法。

一方面，提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，

利用解淀粉乳杆菌L6获取α-半乳糖苷酶基因；

将所述α-半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；

将所述转化后的重组质粒进行筛选；

利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。

所述的解淀粉乳杆菌L6为中国专利CN201410277246.3中所记载的解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L6。

进一步地，所述利用解淀粉乳杆菌获取α-半乳糖苷酶基因包括：

提取解淀粉乳杆菌L6中的α-半乳糖苷酶基因组DNA；

以所述α-半乳糖苷酶基因组DNA为模板，以GLA-F和GLA-R作为引物，利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列。

进一步地，所述利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列的反应程序包括：

98℃预变性30s；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，扩增30个循环，72℃总延伸10min。

进一步地，所述连接中所述表达载体与所述α-半乳糖苷酶DNA的摩尔比为1.0:6.5。

进一步地，所述诱导α-半乳糖苷酶基因的表达后还包括：分离及纯化所述α-半乳糖苷酶；所述纯化方法为亲和层析。

另一方面，本发明提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

再一方面，本申请提供一种由上述的方法制备的α-半乳糖苷酶。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶的最佳反应温度为37℃，最佳反应pH为 5.0。

进一步地，铜离子及锌离子对所述α-半乳糖苷酶具有抑制作用。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶具有转糖基活性并合成低聚糖的能力。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖及五糖。

本发明的α-半乳糖苷酶及其克隆表达方法具有以下优点：

1、寻找α-半乳糖苷酶的新来源；

2、利用解淀粉乳杆菌L6得到的α-半乳糖苷酶具有不同于其他α-半乳糖苷酶的性质；

3、具有转糖基活性并合成低聚糖的能力，且能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖及五糖，这是其他α-半乳糖苷酶所不具备的性质。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1是本发明一个实施例制备α-半乳糖苷酶的工艺流程；

图2是本发明α-半乳糖苷酶降解pNPG的最适宜温度及α-半乳糖苷酶在不同温度下的热稳定性；

图3本发明α-半乳糖苷酶降解pNPG的最适宜pH及α-半乳糖苷酶在不同pH下的热稳定性；

图4是金属离子对α-半乳糖苷酶活力的影响；

图5是α-半乳糖苷酶催化蜜二糖合成低聚糖的液相分析图；

图6是α-半乳糖苷酶催化蜜二糖合成低聚糖的LC-MS图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

解淀粉乳杆菌L6为在申请号CN201410277246.3的中国专利中所记载的解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L6。

大肠杆菌BL21菌种购买于北京百奥莱博科技有限公司，货号：BTN12- 144y。

大肠杆菌DH5α菌种购买于北京百奥莱博科技有限公司，货号：BTN12- 11y。

pET-32购买于上海泽叶生物有限公司，货号：ZY1216。

图1是本发明一个实施例制备具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的工艺流程，如图1所示，提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达方法，利用解淀粉乳杆菌L6获取α-半乳糖苷酶基因；将所述α-半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；将所述转化后的重组质粒进行筛选；利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。

通过研究发现，解淀粉乳杆菌L6具有较高的α-半乳糖苷酶(α-GLA) 活性，本发明利用解淀粉乳杆菌L6获取α-半乳糖苷酶基因是本领域首次发现。

具体地，将4℃冰箱斜面保存的解淀粉乳杆菌L6接种到装有10mL MRS液体培养基的试管中，在37℃恒温培养箱过夜培养，然后用基因组 DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒分别提取解淀粉乳杆菌L6的基因组 DNA和质粒DNA。用1％的琼脂糖凝胶电泳分析提取得到的基因组DNA和质粒DNA，然后以提取得到的基因组DNA和质粒DNA为模板，进行PCR 扩增(聚合酶链式反应)反应。

其中，PCR扩增反应体系包括α-半乳糖苷酶的DNA模板4μL，高保真 DNA聚合酶0.5μL，缓冲液5μL，dNTP Mix 4μL，引物GLA-F(20 μmol/L)2μL，引物GLA-R(20μmol/L)2μL(引物序列参见表1)，无菌超纯水32.5μ。

表1

扩增α-GLA基因的PCR反应条件：98℃预变性30s；94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，扩增30个循环，最后72℃总延伸10 min。配制1％的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测，然后用PCR纯化试剂盒纯化回收PCR产物，去除影响后续反应的物质如模板、引物和缓冲液等，将最后纯化得到的PCR片段用超纯无菌水进行溶解，将该PCR产物进行DNA测序，进一步验证该产物为编码α-GLA的基因序列(如SEQ ID NO:1所示)，将目的片段保存于-20℃冰箱备用。

为了获得质粒载体，将保存的含有pET-32a质粒的大肠杆菌DH5α接种到含有氨苄青霉素(50μg/ml)的营养肉汤中,在37℃，180rpm条件下，恒温摇床培养过夜。然后利用质粒提取试剂盒对表达载体pET-32a进行提取，最后用65℃预热的超纯无菌水溶解质粒载体，于-20℃冰箱保存备用。

本发明的另一实施例中，所述利用解淀粉乳杆菌获取α-半乳糖苷酶基因包括：

提取解淀粉乳杆菌L6中的α-半乳糖苷酶基因组DNA；

以所述α-半乳糖苷酶基因组DNA为模板，利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列，引物采用现有技术中常规的种类及体积即可。

具体地，将纯化回收的目的片段和表达载体，先进行单酶切，单酶切体系如下：EcoR I/Xho I 1μL，10×H Buffer 2μL，PCR回收片段或质粒 DNA 10μL(<1μg)，无菌超纯水7μL。反应温度为37℃，时间4h,取 5μL的单酶切质粒载体进行电泳，如果电泳只有一条条带，说明酶切完全，如果有多条条带，则继续增加酶切时间，接着用PCR纯化试剂盒回收酶切片段；再用EcoRⅠ酶切进行第二次酶切，反应温度为37℃，时间4h,对酶切得到的所有目的片段和质粒进行凝胶电泳，然后进行切胶回收，以保证回收到高质量的目的片段和表达载体，测定DNA浓度。

具体的连接方式如下：

将刚刚完成双酶切的目的片段和表达载体进行连接(线性DNA片段两端在-20℃冰箱储存下会发生降解)，连接反应体系如下：目的片段双酶切产物2μL(约60ng)，pET-32a(+)质粒双酶切产物6μL(约20ng)，T4- DNA 10×Buffer 1μL，T4-DNA连接酶1μL，其中表达载体与DNA片段的摩尔比为1.0:6.5(酶切完成后的摩尔比)，4℃反应过夜。DNA质量与摩尔数的换算公式为Y＝(X×DNA片段长度×650)/10 6,其中Y为DNA 的质量μg,X为DNA的摩尔数pmol，DNA片段长度×650为双链DNA 的分子量。

具体转化方法如下：

首先接种活化的大肠杆菌到营养肉汤中，培养大肠杆菌菌液OD值到 0.35-0.40，将大肠杆菌进行冰浴后4℃离心，用20mmol的MgCl 2-CaCl 2混合液重悬并离心收集细胞，再用20mmol的氯化钙重悬。取200μL的感受态细胞加入到预冷的1.5mL离心管，同时加入2μL的上述连接反应液，在冰上混合并放置30min。将混合液放入到42℃的水浴锅中热激90s，取出含有混合液的离心管后冰浴1-2min，然后将800μL 37℃预热的营养肉汤加入到混合液中，培养1h后离心去除部分培养基，将重悬菌液涂布在含有50μ g/mL氨苄青霉素的营养琼脂，37℃过夜培养。同时以空质粒pET-32a(+)为阳性对照，无菌水为阴性对照，其他操作步骤同上。

本发明的另一个实施例中，所述将所述转化后的重组质粒进行筛选的方案如下：

在37℃下培养一段时间，抗性平板上生长了大量的大肠杆菌菌落，为了提高重组子鉴定的效率，采用菌落PCR的方法对平板生长的阳性菌进行鉴定。

挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落，接种到含有抗生素的营养肉汤，37℃， 180rpm摇床培养12h,然后收集菌体，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，用 EcoR I和Xho I对质粒进行双酶切鉴定，然后电泳检测。

本发明的另一实施例中，所述利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达的方案具体为，按照前述方法制备大肠杆菌BL21的感受态细胞，将构建好的重组质粒pET-gal转化到用来表达异源蛋白的大肠杆菌BL21中，将重组菌用甘油保存于-80℃冰箱，将保存的重组菌接种含有50μg/mL氨苄青霉素的营养肉汤中，摇床培养过夜。将活化的种子液按照2％的比例接种到含有200mL抗性营养肉汤的500mL锥形瓶中，充分混匀后，在37℃，180rpm下摇床震荡培养。在培养过程中用分光光度计在600nm处检测菌液的OD值(光密度)，当菌液的OD值达到0.5左右时，大肠杆菌的生长正处于对数生长期，然后加入5mL的诱导剂(本领域常规诱导剂即可)使其在培养基中的终浓度达到1mM。将菌液在30℃，180rpm的条件下摇床培养4h，诱导α-GLA基因在大肠杆菌BL21中表达，将含有空质粒载体的大肠杆菌BL21设置为阴性对照。

本发明的另一实施例中，所述诱导α-半乳糖苷酶基因的表达后还包括：分离及纯化所述α-半乳糖苷酶；所述纯化方法为亲和层析。

具体地，对经过诱导的大肠杆菌菌液进行离心收集，提取粗酶液，操作步骤如下：将诱导表达的菌液分装到一次性、提前预冷的50mL离心管中，在 4℃，7000rpm条件下离心5min，弃掉上清液，收集菌体。然后加入25mL 无菌蒸馏水到离心管中，吹打清洗，用上述相同的条件进行离心，此操作重复两次。每100mL的大肠杆菌菌液得到的菌体用10mL预冷的McIlvaine缓冲液(pH＝5.8)重悬，然后在冰浴的条件下对大肠杆菌的细胞进行超声破碎，破碎的参数为55w,2s/2s,10min,超声破碎后取出50mL的离心管，在4℃， 9000rpm条件下离心10min，然后将离心得到的上清液转移到干净的离心管中，该溶液即为含有重组蛋白α-GLA的粗酶液，置于4℃冰箱保存备用。

为了准确表征α-GLA的酶学性质，需要得到较纯的酶液，本研究采用亲和层析的方法对α-GLA进行纯化，具体操作方法如下：

1.配制结合缓冲液：将19mL的200mM NaH₂PO₄溶液和81mL的 200mM Na₂HPO₄溶液混匀，同时称取29.22g的NaCl和1.36g的咪唑，先用700mL的蒸馏水溶解，将pH调至7.4，然后定容至1L；洗脱缓冲液：将19mL的200mM NaH₂PO₄溶液和81mL的200mM Na₂HPO₄溶液混匀，同时称取29.22g的NaCl和34g的咪唑，调节pH值并定容。

2.在提取得到的粗酶液中加入一定量的咪唑和NaCl，使这两种物质的浓度接近结合缓冲液的浓度，提高目标蛋白结合的效率。

3.轻摇溶解在20％乙醇溶液的填料，使其变成均匀的浑浊液，然后吸取 2mL浑浊液体转移到离心管，在离心力为500g条件下离心5min，然后弃掉上清液，用5mL的蒸馏水重悬并离心。

4.将蒸馏水替换成结合缓冲液，然后重复步骤3的操作，接着往填料沉淀中加入4mL的结合缓冲液，重悬使其变为浑浊液。

5.按照4:1的比例将样品与浑浊液混合(填料的平均结合能力为 40mg/ml,也就是1mL的填料浑浊液可以结合20mg组氨酸标记蛋白),在室温下将混合液放置在低速振荡器上，孵育1h。

6.取重力流空柱，先用20％的乙醇清洗过滤器，然后用蒸馏水再次清洗干净，将孵育后的样品加入到流空柱中，不断添加结合缓冲液并用1.5mL的离心管收集滤液，每管1mL，然后用酶标仪在280nm下测定吸光值，当吸光值保持不变时，开始添加洗脱缓冲液。

7.收集滤液并对其酶活力进行测定，对有活性的滤液收集保存，进行浓缩。

采用丙酮沉淀法对亲和层析得到酶液进行浓缩，将在-20℃冰箱预冷的丙酮加入到4℃保存的酶液中，使丙酮的浓度达到70％，混合后冰浴1h，然后在4℃,4500rpm转速下离心5min，弃掉上清液(含有咪唑的洗脱缓冲液)，用McIlvaine缓冲液重悬酶液，测定酶活。将浓缩的酶液与5×加样缓冲液 (1:4，v/v)混合，在100℃条件下水浴10min，然后离心取20μL上清液，将样品加入到浓度为12.5％的SDS-PAGE凝胶中，倒入电极缓冲液，接通电源，将电流调为20mA，电泳结束后取出分离胶，用染色液染色4h，在脱色液中脱色浸泡，每2h换一次脱色液，直到蛋白条带清晰展现。

本发明的另一实施例，提供一种由上述的方法制备的具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶。

本发明的另一实施例中，将亲和层析纯化(也就是上述方法制备)得到的α-GLA的基本酶学性质进行研究，其中对最适反应温度以及热稳定性的测定：将200μL的上述酶反应体系在温度范围为20℃-45℃的条件孵育10min，然后加入200μL 0.5M Na₂CO₃溶液终止反应，在波长为405nm条件下测定OD值，来确定酶反应的最佳温度，每组做3个平行。与此同时，将溶解于McIlvaine缓冲液的酶液放在不同温度下(20℃-45℃)下孵育2h,每隔 20min取一次酶液，然后在最适反应条件下进行反应，利用酶标仪测定OD 值来计算酶活，以最大酶活力为100％来测定酶的热稳定性。

不同温度的反应活力以及热稳定性参见图2所示。由图2可得，α-GLA 降解pNPG的最适反应温度为37℃。当温度超过37℃时，酶活力迅速降低。

本发明的另一实施例中，配制pH值为3.0-8.0的McIlvaine缓冲液来溶解底物pNPG和酶液，将200μL的酶反应体系在37℃的条件下孵育 10min，用Na₂CO₃溶液来终止反应并测定OD值，测得的最大酶活力为 100％来测定酶活的最佳反应pH。同时对α-GLA的pH稳定性进行测定，在不同pH条件下将150μL酶反应体系(未加底物pNPG)在20℃下孵育 2h，然后加入50μL的pNPG并孵育10min，在波长405nm处测定OD值，确定该酶的pH稳定性。

如图3所示，展示了α-GLA的最适反应pH及不同pH下的稳定性，其中，最佳反应pH为5.0，当pH大于5或者小于5时，相对酶活力均下降。

本发明的另一实施例中，在酶促反应体系中分别加入金属钠离子、亚铁离子、钾离子、锰离子、镁离子、钙离子、铜离子、锌离子，使金属离子终浓度为1.0mmol/L，反应体系总体积为200μL，在37℃条件下孵育10min，然后加入Na₂CO₃溶液终止反应，测定计算酶活力，以未加入金属离子的酶样品溶液做对照，以未加金属离子处理的酶液酶活力为l00％，计算相相对酶活力。

如图4所示，展示了不同金属离子对α-GLA酶活性的影响。由图可得，铜离子及锌离子对所述α-半乳糖苷酶具有抑制作用，抑制率分别为34％和 53％。

本发明的另一实施例中，所述α-半乳糖苷酶具有转糖基活性并合成低聚糖的能力。

具体地，α-GLA的转糖基活性测定的反应体系如下：以终浓度为40％ (w/v)的蜜二糖作为反应底物,α-GLA的终浓度为0.7U/mL,以McIlvaine作为缓冲液(pH＝6.0)，将混合液置于摇床，反应温度37℃，转速150rpm，进行反应，在0h、1h、12h、24h、36h、48h、60h时间点取样350μL，然后95℃高温灭活10min,在-80℃冰箱储存，进行后续测定。

利用高效液相色谱(HPLC)以及液质联用(LC-MS)分析对样品中糖组分进行测定，

参见图5所示，对比0h时反应体系的组分，当酶反应12h后，HPLC测定结果发现蜜二糖(10.5min)含量降低了58.9％；蜜二糖在被水解为葡萄糖 (6.9min)和半乳糖(7.3min)的同时还有部分转化为低聚半乳糖(出峰时间为13.7min和16min).由此可见，来自于解淀粉乳杆菌L6中的α-GLA不仅具有较强的水解能力同时还具有合成低聚糖的能力，这是首次在解淀粉乳杆菌中发现具有合成低聚糖能力的α-GLA。

本发明的另一实施例中，所述α-半乳糖苷酶能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖及五糖。

如图6所示，利用液质联用(LC-MS)对上述12h反应样品组分进行分析，通过分析1号峰的质谱结果，如图6b，可以检测到m/z为527和543的低聚三糖M+23(钠离子)和M+39(钾离子)，相对强度为25.3％；同时也检测到m/z为707的低聚四糖M+39(钾离子)，相对强度为13.0％。与此同时，蜜二糖m/z 365和381，相对强度为93％和100％；单糖m/z 203和319，相对强度分别为31.1％和26.5％。质谱的结果可以确定，α-半乳糖苷酶能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖。

本发明首次对来自解淀粉乳杆菌的α-Gal在大肠杆菌BL21中进行克隆表达，通过亲和层析的方法可以大量制备比较纯的酶液，具有较强的水解α-半乳糖苷键的活性。

虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

序列表

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达

<141> 2021-05-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2027

<212> DNA

<213> Lactobacillus amylolyticus L6

<400> 1

atgaaccacg aactaatcac ctttgatcaa gagcaaaaag tttttcattt gcataatgac 60

aaaatttcat acttgctagc cattgaagat ggcggtacgc taagtcattt gtattttggt 120

aaacgagtaa aaaactatca tggtcagttg cgttatccaa gaagagatcg cggtttctca 180

ggcaatcttc caggttcact tgatcgaacg ttttcacgtg attctatttt aaaagagtac 240

agtacggccg gtgaaatgga ctatcatacg ccagctgcta ttgttcgcca tccagatggt 300

gcaaatgctt tgtttttaac ctatcaatct tatcggattg aggatggcaa gcctgattta 360

aagggtcttc cacatgcatg ggtcaaaaat aaaaatgaag cgcaaacttt aattatcaga 420

ttggaagaca agaaaagcca acttgatttt gatttgtact acaccattta tcgtgatcgt 480

cccgtagtta cgcgttcagt tcaagtactc aataacgggc aagagactgt ttttcttgaa 540

aaagcagctt caatgcaaat tgattttgcc gatcgcaatt ttgaagtgat tactttgcca 600

ggtgcgcatg ctaatgaacg tcatgttgaa agagaaaaaa ttgggcaggg cattcatgtt 660

tactcaagta ttcgtggtac ctcaagtcac caaatgaatc cgtttttggc tttggtagac 720

ccagagacaa cagagaataa tggtgatgcg tatggtttta gtttggttta ttctggcaac 780

cataagtttg aagttgaacg cgatcaattt aatcaaattc acttaaatat tggtatcaat 840

gattttaatt tcaagtggca gttagcacct aaggctgaat ttcaaactcc ggaagttttg 900

atggtatatt cagctcatgg tttaaatcag atgagtcaaa cattccatcg tttgattcat 960

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gaagcaactt actttgattt tgatgaagat aagctgcgac caattgttga taaggctaaa 1080

gatctcggca ttgaaatgtt tgttttagat gatggctggt ttggtcatcg tgatgatgat 1140

aatagttcac ttggggactg gtatgttgat cataagaagt ttccgaaagg attaggtcat 1200

tttgctgatt acgttcatca tcagggctta aaatttggtc tttggtttga acccgaaatg 1260

atctcttatg attcagatct ttatcgacaa catccggatt atctaatgca tgttcctggt 1320

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tgggatatga atcggcattt gtctgatatt tatgaagcag atttaccagc cgatagacag 1500

ggcgaggcct atcatcgcta tgttttgagc tactatgatt tgctcgatcg cttagttact 1560

agatatccaa atattttatt tgaaggttgt tcaggtggtg gtggccgttt tgatgctggt 1620

caagcttact atacgccgca aatttgggcc agtgataatt cagatgcgat tgctcggcta 1680

gtaattcaat atggtacgag tttagtttat ccgcaatcaa tgatgacttc ccatgtgtca 1740

gtcagcccaa acgaacaaaa tggtcgaatt acgccttttg atacgcgcgg tgcagttgca 1800

atgtggggcg atttaggcta tgaacttgac ttaactaaat taagtgctgc agatagccga 1860

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ttttatcgtc taaagtcacc aatgacgggc aatcagtgtg cctggatgac tgtttcacca 1980

gatcaaagtg aggcagtagt tacagtggtt gatatcatgg cttatgc 2027

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccggaattca tgaaccacga actaatcac 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccgctcgagt taattccgta cactgtttg 29

Claims (10)

1.一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，其特征在于，利用解淀粉乳杆菌L6获取α-半乳糖苷酶基因；

将所述α-半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；

将所述转化后的重组质粒进行筛选；

利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。

2.根据权利要求1所述的具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，其特征在于，所述利用解淀粉乳杆菌获取α-半乳糖苷酶基因包括：

提取解淀粉乳杆菌L6中的α-半乳糖苷酶基因组DNA；

以所述α-半乳糖苷酶基因组DNA为模板，以GLA-F和GLA-R作为引物，利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列。

3.根据权利要求2所述的具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，其特征在于，所述利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列的反应程序包括：

98℃预变性30s；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，扩增30个循环，72℃总延伸10min。

4.根据权利要求1所述的具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，其特征在于，所述连接中所述表达载体与所述α-半乳糖苷酶DNA的摩尔比为1.0:6.5。

5.根据权利要求1所述的具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，其特征在于，所述诱导α-半乳糖苷酶基因的表达后还包括：分离及纯化所述α-半乳糖苷酶；所述纯化方法为亲和层析。

6.一种具有转糖基活性α-半乳糖苷酶，其特征在于，由权利要求1-7任一项权利要求所述的方法制备。

7.根据权利要求6所述的α-半乳糖苷酶，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶的最佳反应温度为37℃，最佳反应pH为5.0。

8.根据权利要求6所述的α-半乳糖苷酶，其特征在于，铜离子及锌离子对所述α-半乳糖苷酶具有抑制作用。

9.根据权利要求6所述的α-半乳糖苷酶，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶具有转糖基活性并合成低聚糖的能力。

10.根据权利要求9所述的α-半乳糖苷酶，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖及五糖。

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