CN117844787A - 一种重组果胶裂解酶PelA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组果胶裂解酶PelA及其应用，属于生物工程技术领域；本发明通过DNA重组技术将密码子优化后的性能优良的果胶裂解酶基因异源表达到载体上，并转入遗传背景清晰、生长周期快的大肠杆菌中扩增和表达，从而制备出重组果胶裂解酶PelA；所述重组果胶裂解酶PelA在pH 10、70℃具有较高的果胶裂解酶活性；所述重组果胶裂解酶PelA的制备方法具有操作简单、制备快速、纯度高等突出优点，在纺织工业、食品加工、制浆加工、油酯提取和工业废水处理等领域具有很好的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组果胶裂解酶PelA及其应用。
背景技术
果胶裂解酶(Pectate lyase，简称PL)是一类通过β-反式消除作用切割α-1,4-糖苷键，降解去甲酯化果胶产生寡聚糖的酶类，其在食品、造纸、纺织和生物能源等行业应用广泛。PL广泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生动物和昆虫中也有发现，由于微生物分布广泛且生长周期短等特点，使其成为PL生产的理想媒介。目前研究人员已经从环境微生物(细菌、放线菌、酵母和霉菌)获取PL，但所得PL很难满足工业化上的高温高碱环境，这限制了PL的应用。因此，需要开发一种适合工业条件中使用的耐高温耐高碱的果胶裂解酶。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组果胶裂解酶PelA及其应用；本发明通过DNA重组技术将密码子优化后的性能优良的果胶裂解酶基因异源表达到载体上，并转入遗传背景清晰、生长周期快的大肠杆菌中扩增和表达，从而制备出重组果胶裂解酶PelA；所述重组果胶裂解酶PelA在pH 10、70℃具有较高的果胶裂解酶活性；所述重组果胶裂解酶PelA的制备方法具有操作简单、制备快速、纯度高等突出优点，在纺织工业、食品加工、制浆加工、油酯提取和工业废水处理等领域具有很好的应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用以下技术手段：
本发明首先提供了一种重组果胶裂解酶PelA，所述重组果胶裂解酶PelA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述重组果胶裂解酶PelA的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述重组果胶裂解酶PelA的编码基因。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述重组果胶裂解酶PelA、或上述重组果胶裂解酶PelA的编码基因、或上述重组载体。
优选地，所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌。
本发明还提供了上述重组菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)将pET28a质粒线性化处理得到线性化pET28a质粒，然后将线性化pET28a质粒与重组果胶裂解酶PelA的编码基因通过无缝克隆连接，热激法转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR和Sanger测序后得到重组载体；
(2)将重组载体转入宿主菌中，得到所重组菌。
优选地，所述宿主菌包括大肠杆菌。
本发明还提供了上述重组菌在生产重组果胶裂解酶PelA中的应用。
本发明还提供了上述重组果胶裂解酶PelA、上述重组菌生产的重组果胶裂解酶PelA在果汁澄清、麻的脱胶、工业废水、香料油和类胡萝卜素医用原料的提取、咖啡和茶的发酵、含有果胶质废水的处理、原油的提取、植物病毒的纯化、纸浆漂白和纺织品的生物精炼中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本方法通过DNA重组技术将密码子优化后的性能优良的果胶裂解酶基因异源表达到载体上，并转入遗传背景清晰、生长周期快的大肠杆菌中扩增和表达，实现了果胶裂解酶的快速制备。并且，所述方法分离纯化简便，20小时后便可快速大量收集重组果胶裂解酶PelA。该重组果胶裂解酶PelA能够在高温高碱下具有较高的果胶裂解酶活性，具有操作简单、制备快速、纯度高等突出优点。
与其他果胶酶相比，本发明所述重组果胶裂解酶PelA在pH 10，70℃具有较高的果胶裂解酶活性，酶活能够达到108.6±0.6U/mg。本发明所制备重组果胶裂解酶PelA能够在纺织工业、食品加工、制浆加工、油酯提取和工业废水处理等领域应用。在果汁澄清、麻的脱胶、工业废水、香料油和类胡萝卜素医用原料的提取、咖啡和茶的发酵、含有果胶质废水的处理、原油的提取、植物病毒的纯化、纸浆漂白和纺织品的生物精炼中具有很好的应用。
附图说明
图1为重组果胶裂解酶PelA的编码基因的电泳图谱。
图2为重组载体pET28a-PelA的图谱。
图3为重组大肠杆菌JJ2摇瓶发酵后表达产物的SDS-PAGE图谱。
图4为重组果胶裂解酶PelA在不同pH(A)和温度(B)下的活性情况。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均与首次表明的来源相同；所涉及的试剂、材料等无特殊说明，均为商业用途获。
以下实施例中，pET28a质粒、JM109感受态细胞均为本领域通用材料，故不再赘述；以下实施例中所述LB培养基成分包括：1％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+1％ NaCl+8g/L葡萄糖+50μg/mL硫酸卡那霉素。
实施例1：果胶裂解酶A的编码基因的获得
从NCBI检索Bacillus clausii的果胶裂解酶氨基酸序列(Genbank accessionno.KR819891.1)，将此序列根据大肠杆菌BL21(DE3)进行密码子优化，密码子优化后的序列如SEQ ID NO.2所示，将其提交至苏州金唯智生物科技有限公司进行重组果胶裂解酶PelA基因片段的合成。
以合成的重组果胶裂解酶PelA基因片段为模板，通过引物F1、R1进行PCR扩增，其中：
SEQ ID NO.1：
MVVFLLAFGAFSMPAYGQEGAEAANVNFSMQGFATLNGGTTGGAGGDVVTVSTGDQLIAALKNKKANTPLTIYIDGTITPANTSASKIDIKDVNDVSLLGVGTNGELNGIGIKVWRANNVIIRNLKIHHVNTGDKDAISIEGPSKNIWVDHNELYNSLDVHKDYYDGLFDVKRDADYITFSWNYVHDSWKSMLMGSSDSDSYGRKITFHNNYFENLNSRVPSVRFGEAHIFSNYYADIRETGINSRMGAQVRIEENYFERANNPIVSRDSKEIGYWHLVNNRYVSSTGEQPTVSTTTYNPPYSYQATPVNQVKDVVRANAGVGVISP
SEQ ID NO.2：
ATGGTTGTTTTTCTGCTGGCCTTCGGTGCGTTCTCCATGCCTGCTTACGGCCAAGAAGGCGCGGAAGCTGCCAACGTTAACTTCTCCATGCAGGGTTTCGCTACTCTGAACGGCGGCACTACCGGCGGTGCTGGTGGTGATGTTGTAACCGTTTCTACGGGTGACCAGCTGATTGCTGCGCTGAAAAATAAGAAAGCCAACACCCCGCTGACCATCTATATCGACGGTACTATCACCCCGGCGAATACGTCTGCATCCAAAATTGACATCAAAGACGTCAACGACGTTAGCCTGCTGGGTGTAGGTACTAACGGTGAACTGAACGGCATTGGTATCAAAGTGTGGCGTGCAAACAACGTTATCATTCGTAACCTGAAGATTCACCACGTTAACACTGGTGACAAAGATGCGATTTCCATCGAAGGTCCGTCCAAAAACATTTGGGTGGACCACAACGAACTGTACAACTCCCTGGATGTACACAAAGACTACTATGACGGCCTGTTCGATGTTAAACGTGACGCCGATTATATCACTTTCTCTTGGAACTACGTGCACGATTCCTGGAAATCCATGCTGATGGGCTCTTCTGACAGCGATTCCTACGGCCGTAAGATTACTTTCCACAACAACTATTTCGAAAACCTGAACAGCCGTGTTCCGTCTGTTCGTTTCGGTGAGGCCCATATCTTCAGCAACTACTACGCCGATATTCGTGAAACCGGCATTAACTCTCGTATGGGTGCTCAAGTTCGCATCGAAGAGAACTACTTTGAACGTGCTAACAACCCTATTGTCAGCCGTGACTCCAAAGAAATTGGTTACTGGCACCTGGTTAACAACCGTTACGTGAGCTCTACCGGTGAGCAGCCAACCGTTTCTACTACTACGTATAACCCGCCTTACTCCTATCAGGCAACTCCGGTTAACCAGGTCAAAGATGTAGTGCGTGCCAACGCTGGTGTTGGCGTCATTTCCCCGTAA。
F1：GACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCATGGTTGTTTTTCTGCTG(SEQ ID NO.3，划线为同源臂)；
R1：GTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTACGGGGAAATGACGCC(SEQ ID NO.4，划线为同源臂)。
将重组果胶酶PelA的编码基因进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证结果如图1所示。图1为重组果胶裂解酶PelA的编码基因的电泳图谱，从图中可以看出，获得的重组果胶酶PelA的编码基因为1012bp，这是因为无缝克隆的引物比较长，会含有同源臂片段，最终PCR后条带比仅有编码重组果胶酶PelA的基因片段的条带大，其条带大小与编码重组果胶酶PelA的基因片段大小与引物大小之和一致，这说明成功获得了重组果胶裂解酶PelA。
实施例2：重组载体pET28a-PelA及重组菌的构建
(1)重组载体pET28a-PelA的构建：
以pET28a质粒为模板，采用引物F2、R2进行PCR线性化处理，获得线性化质粒片段；然后将线性化质粒片段与PelA的编码基因通过无缝克隆连接，得到重组载体pET28a-PelA。将重组载体热激法转化至JM109感受态细胞中，经过PCR及Sanger测序验证，成功构建了重组载体pET28a-PelA；重组载体pET28a-PelA的图谱如图2所示。
其中，引物F2、R2的序列如下所示：
F2：GGATCCGAATTCGAGCTCC(SEQ ID NO.5)；
R2：GCGACCCATTTGCTGTCC(SEQ ID NO.6)。
(2)重组菌的构建：
将重组载体pET28a-PelA转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，记为重组大肠杆菌JJ2。
实施例3：重组大肠杆菌JJ2摇瓶培养及果胶裂解酶的诱导分泌表达结果分析
本步骤以空载体菌株为对照来考察重组大肠杆菌JJ2摇瓶发酵后表达产物的情况，其中空载体菌株pET28a/BL21(DE3)是将pET28a质粒直接转入大肠杆菌BL21(DE3)中得到。考察步骤具体为：
(1)种子液制备：
分别将甘油保藏的空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50mL的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、220r/min摇瓶过夜，得到过夜培养的空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2种子液。
(2)发酵：
分别将过夜培养的空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2种子液离心，并用LB培养基重悬菌体，接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1。然后在37℃、220r/min培养至OD600为0.6左右时加入1mM IPTG诱导空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2，诱导后调整培养条件为16℃、110r/min并培养24h，得到空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2诱导培养液。
(3)样品处理：
分别取空载体菌株pET28a/BL21(DE3)和重组大肠杆菌JJ2诱导培养液1mL于1.5mL离心管中，经离心机在室温、10000r/min、5min的条件下离心收集菌体，然后加入100μL的PBS缓冲液(pH 7.0)后95℃加热10min，离心(室温，10000r/min，5min)后获得裂解液上清和沉淀，对进裂解液上清和沉淀行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图3所示。
图3为重组大肠杆菌JJ2摇瓶发酵后表达产物的SDS-PAGE图谱，从图中可以看出，重组大肠杆菌JJ2经IPTG诱导后，裂解液上清和沉淀在38.6kD处有一条特异蛋白带，而空载体菌株对照则无此带，这说明PelA基因已经在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了有效的表达。
实施例4：重组果胶裂解酶PelA纯化及酶活测定
本实施例考察了重组大肠杆菌JJ2产重组果胶裂解酶PelA的能力以及所产重组果胶裂解酶PelA的酶活情况，具体步骤如下所示：
(1)粗酶液获得：
将重组大肠杆菌JJ2采用实施例3中步骤(1)和(2)进行处理发酵，然后取重组大肠杆菌JJ2诱导培养液于50mL离心管中，经冷冻离心机(4℃，6000r/min，5min)离心收集，并使用PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，洗涤后使用2mL平衡缓冲液(pH 7.0)重悬菌体，并置于冰上超声破碎15～20min(功率550W，工作时间3s，间隙时间3s)，以菌液是否澄清透亮来判断是否破碎完全。
将破碎完全的菌液低温高速离心收集裂解液上清液和沉淀物，其中上清液并用0.22μm孔径大小的MCE滤膜过滤，得到的滤液即为粗酶液。
(2)纯化：
将上述所得的粗酶液载入平衡好的Ni2+-NTA亲和层析柱，轻轻颠倒层析柱，使树脂重新悬浮，不断颠倒，保持30～60min，让粗酶液与树脂充分结合。将层析柱垂直静置5～10min，使树脂在重力作用下沉淀下来，排出液体。加入5mL清洗液(pH 8.0)，轻轻颠倒层析柱，使树脂重新悬浮，垂直静置5～10min，使树脂在重力作用下沉淀下来，排出液体，该步骤重复3次。加入1mL洗脱液(pH 8.0)，轻轻颠倒层析柱，使树脂重新悬浮，垂直静置5～10min，使树脂在重力作用下沉淀下来，将洗脱液排入新的离心管，即为可溶性重组蛋白。该步骤重复3次。
将洗脱下来的蛋白用双蒸水透析，去盐粒子即可得到纯化后的重组果胶裂解酶PelA，存放在4度冰箱，备用。分别将纯化后的重组果胶裂解酶PelA以及重组果胶裂解酶PelA稀释10倍后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图3所示。如图3所示，表明pET28a-PelA/BL21(DE3)即JJ2菌株经Ni2+-NTA纯化后，稀释10倍的纯酶和纯酶在38.6kD处有一条特异蛋白带，说明果胶裂解酶PelA纯化成功。
(3)重组果胶裂解酶PelA的酶活测定：
利用BCA蛋白质定量测定蛋白质含量，果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰，测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。
具体测定步骤为：取稀释10倍的酶液20μL，加入到2mL含0.2％聚半乳糖醛酸的缓冲液中启动酶促反应，在设定的条件下反应15min，用3mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。空白对照为相同量的热灭活稀释酶液。以每分钟生成1mol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量作为1个酶活力单位(U)，实验设三次重复。
采用上述步骤分别测试了重组果胶裂解酶PelA在不同pH和不同温度下的活性情况，测试结果如图4所示。从图4中可以看出，在温度70℃下PelA的酶活力在pH为6.5-12时呈现活力先增加后减少的趋势，并在pH为10时活性最大，为101.9±3.6U/mg。此外，在pH为10的条件下PelA的酶活力在40-80℃范围内呈现活力先增加后减少趋于平缓的趋势，并在70℃时活性最大，为108.6±0.6U/mg。相比其他果胶裂解酶的最适反应温度和pH值为35-65℃和pH 3.0-5.5；本发明所述重组果胶裂解酶PelA更加耐热耐碱。
综上所述，本发明通过DNA重组技术将密码子优化后的性能优良的果胶裂解酶基因异源表达到载体上，并转入遗传背景清晰、生长周期快的大肠杆菌中扩增和表达，从而制备出重组果胶裂解酶PelA；所述重组果胶裂解酶PelA在pH 10、70℃具有较高的果胶裂解酶活性；所述重组果胶裂解酶PelA的制备方法具有操作简单、制备快速、纯度高等突出优点，在纺织工业、食品加工、制浆加工、油酯提取和工业废水处理等领域具有很好的应用。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种重组果胶裂解酶PelA，其特征在于，所述重组果胶裂解酶PelA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的重组果胶裂解酶PelA的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求2所述的重组果胶裂解酶PelA的编码基因。
4.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求1所述的重组果胶裂解酶PelA、或权利要求2所述的重组果胶裂解酶PelA的编码基因、或权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌。
6.权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括：
(1)将pET28a质粒线性化处理得到线性化pET28a质粒，然后将线性化pET28a质粒与权利要求2所述的重组果胶裂解酶PelA的编码基因通过无缝克隆连接，热激法转化至大肠杆菌感受态细胞，经PCR和Sanger测序后得到重组载体；
(2)将重组载体转入宿主菌中，得到所重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌。
8.权利要求6或7所述的重组菌在生产重组果胶裂解酶PelA中的应用。
9.权利要求1所述的重组果胶裂解酶PelA、或权利要求6所述的重组菌生产的重组果胶裂解酶PelA在果汁澄清、麻的脱胶、工业废水、香料油和类胡萝卜素医用原料的提取、咖啡和茶的发酵、含有果胶质废水的处理、原油的提取、植物病毒的纯化、纸浆漂白和纺织品的生物精炼中的应用。
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