CN101429508A - 一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，涉及一种生物粘合剂。提供一种通过生物基因工程方法制备具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝－厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的方法。从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA，根据厚壳贻贝的Mcfp－1基因序列设计PCR引物，经PCR扩增，将获得的DNA片段连接到原核表达载体pGEX－4T中构建重组质粒，再转化到大肠杆菌BL21菌株中，最后将表达的多肽产物纯化、修饰。制备方法简单，表达产物为可溶性，易于纯化，成本低，与CELL－TAKTM细胞和组织粘附剂相比有类似或者更好的效果，未发现细胞毒性。符合科研需要，可作为生物医用材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物粘合剂，尤其是涉及一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法。
背景技术
海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝粘胶的主要成分足丝粘附蛋白具有高强度、高韧性和防水性。目前已有美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织粘附剂，该产品已商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAKTM CELL AND TISSUE ADHESIVE，Catalog No.354240，354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强与样品的粘附。但是贻贝分泌粘附蛋白的量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到1mg的粘附蛋白，而且由此获得的粘附蛋白产品如CELL-TAKTM价格也十分昂贵，很难满足需要。
已有文献报道用基因工程手段表达重组的粘附蛋白用作生物粘合剂，他们用原核表达载体pTrcHisA重组紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的Mgfp-3A、Mgfp-5以及Mgfp-5与Mgfp-1的十肽重复序列融合蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有较好的粘附功能(1、Hwang DS，GimY Cha HJ.Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichiacoli[J].Biotechnol Prog，2005，21(3)：965-970；2、Hwang DS，Gim Y，Kang DG，et al.Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial[J].J Biotechnology，2007，127(4)：727-735；3、Hwang DS，Gim Y，Yoo HJ，et al.Practical recombinant hybrid musselbioadhesive fp-151[J].Biomaterials，2007，28(24)：3560-3568)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法。
本发明的具体步骤如下：
1)从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA；
2)根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自Genbank No.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有EcoR I和Sal I酶切位点，引物序列如下：
引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，
引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’：
3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360bp)序列如下：
Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttat
aaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagc
caaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaaccta
agatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg
编码的氨基酸(120aa)序列为：YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPP
TYKPKISYPSTYKAKPSYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTY
KPKPSYASSYKPKIRYPPT
4)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD18-T克隆，再切出连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒；
5)将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导，表达出融合有GST的Mcfp-1第692位到811位氨基酸残基的多肽产物，标记为GST-Mcfp-1-12；
6)用谷胱甘肽一琼脂糖树脂纯化该多肽产物；
7)用凝血酶切除融合的GST，离心得到不溶性Mcfp-1功能肽段产物沉淀；
8)最后用酪氨酸酶对纯化的多肽产物进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂，命名为Mcfp-1-12。
本发明能快速获得粘附蛋白防水生物粘合剂。一旦获得粘附蛋白功能片段的重组质粒，就可以源源不断的由大肠杆菌BL21诱导表达粘附蛋白功能肽段。该多肽产物酶切和修饰方法过程简单，所需原料只是微量凝血酶和酪氨酸酶。酶切过程只是在25℃条件下反应16—20h，即可产生白色可见的不溶性粘附蛋白功能肽段产物沉淀，用PBS洗涤多肽沉淀后用5％的醋酸溶解，然后用酪氨酸酶反应6h即可，操作简单，成本低廉。所制备的粘附蛋白防水生物粘合剂能在潮湿的环境下粘附在玻璃、金属钛、铝和塑料表面并且流水冲洗2h也不掉，能在短时间内粘附细胞，与CELL-TAKTM细胞和组织粘附剂相比有类似或者更好的效果，并且没有发现细胞毒性。在潮湿的环境下，几微克的微量粘附蛋白防水生物粘合剂就能粘接塑料和小鼠股骨。避免为了微量的足丝粘附蛋白而大量捕杀海洋贻贝的资源浪费。所得防水粘合剂不仅符合科研需要，且作为生物医用材料生物粘合剂在临床使用具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1EcoR I和Sal I双酶切检验PCR片段(360bp)插入pMD18-T载体的阳性克隆质粒凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，S为酶切的质粒样品，图左边的3000bp、2250bp、500bp和250bp为相应DNA条带碱基数，图右边2692bp表示pMD-18T载体的碱基数，360bp为插入目的片段的碱基数。
图2为实施例1EcoR I和Sal I双酶切检验从pMD18-T载体切出的目的DNA片段(360bp)插入pGEX-4T载体的阳性克隆质粒凝胶电泳图。M1和M2为DNA分子量标准，S为酶切的质粒样品，图左边4900bp、500bp和250bp为相应DNA条带碱基数，图右边4900bp为pGEX-4T载体碱基数，360bp为插入目的片段DNA碱基数。
图3为pGEX-4T载体通过EcoR I和Sal I位点插入目的片段重组质粒的测序结果图。箭头指向分别为EcoR I和Sal I位点。
图4为实施例2在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12在塑料(A)、玻璃(B)、金属钛(C)和铝(D)材料表面粘附后流水冲洗2小时后考马斯亮兰染色图。其中W/O T表示未经酪氨酸酶修饰，WT表示酪氨酸酶修饰。
图5为实施例3粘合剂Mcfp-1-12在硅金片上吸附量的QCM(Quartz crystal microbalance)图。其中横坐标为测试吸附量的蛋白质，纵坐标为蛋白质在硅金片上吸附量的频率参数—ΔF(Hz)，W/O T表示未经酪氨酸酶修饰，WT表示酪氨酸酶修饰。
图6为实施例4在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12粘接实验室塑料枪头与塑料培养皿示意图。其中A、B、C分别表示粘合剂Mcfp-1-12、未经酪氨酸酶修饰的Mcfp-1-12和BSA。
图7为实施例5在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12粘接小鼠股骨示意图。A和B分别表示用BSA和未经酪氨酸酶修饰的Mcfp-1-12粘合的股骨，C和D为粘合剂Mcfp-1-12粘合的股骨。
图8为实施例6粘合剂Mcfp-1-12在1h内粘附细胞的示意图。左边Mcfp-1-12 coated region表示粘合剂Mcfp-1-12包被的区域，右边uncoated region为未包被的区域。
图9为实施例7粘合剂Mcfp-1-12对293T细胞的安全性分析图。
图10为实施例7粘合剂Mcfp-1-12对Hela细胞的安全性分析图。
在图9和10中，横坐标为时间Time(h)，纵坐标为吸光值Absorbance(490nm)，一定时间内测定样品在490nm波长的吸光值，Uncoated表示没有粘合剂包被的培养皿，Mcfp-1-12表示经Mcfp-1-12粘合剂包被的培养皿，293T表示人胚肾细胞，Hela表示子宫颈癌细胞。○未包被Uncoated ●粘合剂Mcfp-1-12。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂Mcfp-1-12的制备
1.PCR获取目的基因片段，连接到克隆载体：从活的厚壳贻贝M.coruscus上切取其足部，提取总RNA，反转录成cDNA。根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自GenbankNo.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，设计引物时在前向引物和反向引物末端分别加上EcoR I和Sal I酶切位点，引物序列如下：
引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，
引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’；
以上述cDNA为模板，进行PCR扩增反应。
PCR扩增体系(50μl)：
模板cDNA 2.5μl
引物F(0.2μM) 1μl
引物R(0.2μM) 1μl
dNTP(2.5mM) 1μl
10×Pyrobest缓冲液 5μl
ddw 39.2μl
PyrobestTM DNA聚合酶(Takara公司大连分公司)0.3μl
PCR反应循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。
PCR产物跑琼脂糖胶回收后直接连接到pMD18-T载体(购自Takara公司大连分公司)，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素100μg/ml的LB平板培养板，并在37℃恒温培养箱中培养16h。挑取单克隆，37℃液体LB(含氨苄青霉素100μg/ml)摇菌过夜，煮沸法小量提取质粒。EcoR I和Sal I双酶切检验阳性克隆质粒(如图1)，M为DNA分子量标准；S为酶切的质粒样品，其中两条带分别为pMD18-T载体和插入目的片段。
2.GST融合表达载体的构建：
pGEX-4T载体的制备(50μl)：
pGEX-4T 1μg
EcoR I 1μl
SalI 1μl
10×H buffer 5μl
ddw 42μl
37℃温育1h后，在原酶切体系中加入碱性磷酸酶(CIP)1μl，37℃温育45min。反应产物跑琼脂糖胶回收。所用限制性内切酶和CIP酶均购自Takara公司大连分公司(以下同)。
目的DNA片段的制备(50μl)：
上述pMD18-T载体连接的克隆 5μl
EcoR I 1μl
Sal I 1μl
10×H buffer 5μl
ddw 38μl
37℃温育1h后，反应产物跑琼脂糖胶回收。将以上所得载体与目的片段经T4 DNA连接酶(购自美国Invitrogen公司)于16℃连接过夜，连接反应体系如下(15μl体系)：
载体 2μl
片段 8μl
5×连接酶缓冲液 3μl
T4DNA连接酶 1.5μl
将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素100μg/ml的LB平板培养板，并在37℃恒温培养箱中培养16h。挑取单克隆，37℃液体LB(含氨苄青霉素100μg/ml)摇菌过夜，煮沸法小量提取质粒。EcoR I和Sal I双酶切检验阳性克隆质粒，结果见图2，M1和M2为DNA分子量标准；S为酶切的质粒样品，其中两条带分别为载体和插入目的片段。测序鉴定表明插入序列正确(见图3)。
3.融合多肽GST-Mcfp-1-12的诱导表达及纯化：
1)将上述pGEX-4T载体重组的质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素100μg/ml的LB平板培养板，并在37℃恒温培养箱中培养16h；
2)挑取单克隆菌株到含氨卞青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃摇床培养过夜；
3)将培养的菌液用含氨卞青霉素100μg/ml的液体LB培养基按1:100的比例稀释，37℃摇床培养至OD600为0.6—1.0；
4)加入终浓度为1.0mM的IPTG，30℃诱导5h；
5)将诱导的菌液转入离心管中，4℃，8000g离心10min；
6)去上清，将沉淀置于冰上，加入适量PBS(NaCl 140mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 10mM，KH2PO4 1.8mM)洗涤沉淀，8000g离心10min，洗2次；
7)去上清，将沉淀置于冰上，用冰预冷的PBS-T(PBS中加入1％ Triton)重悬浮沉淀；
8)工作频率小于200Hz超声波破碎，每超声5s间隔停止5s，至菌液澄清；
9)将超声波破碎产物置于冰上15min；
10)4℃，12000g离心15min；
11)将上清液转入另一离心管中，加入适量谷光苷肽琼脂糖珠；
12)4℃混匀3h左右后，4℃500g离心5min；
13)去上清，PBS洗涤沉淀3次，每次洗涤后4℃ 500g离心5min，最后一次洗涤后吸净PBS；
14)加入1ml洗脱液(0.154g还原型谷光苷肽溶解在50ml 50mM的Tris-HCl(pH 8.0))，室温下轻摇10min洗脱；
15)4℃，500g离心5min，将洗脱液移入另一管中；同样洗脱3次，合并洗脱液，即为表达纯化的GST-Mcfp-1-12多肽产物。
4.GST-Mcfp-1-12多肽产物的酶切和修饰
1)用凝血酶(Thrombin，Sigma，T4648)按0.5NIH UNIT/nmol多肽将GST-Mcfp-1-12多肽产物在25℃酶切16—20h；然后将酶切体系于4℃ 12000rpm离心60min，去上清，PBS洗涤沉淀两次，离心得到白色沉淀，用5％醋酸溶解，即得到Mcfp-1-12多肽溶液。
2)将Mcfp-1-12多肽溶液稀释至1.44mg/ml，加入酪氨酸酶(Tyrosinase mushroom，Sigma，T3824)至终浓度为10UNIT/ml，25℃反应6h。即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂Mcfp-1-12。
实施例2：在潮湿的环境中粘合剂Mcfp-1-12在不同材料表面的粘附
在清洗干净的塑料、玻璃、金属钛和铝材料表面各滴加10μl浓度为1.44mg/ml的粘合剂Mcfp-1-12，同时滴加相同浓度的小牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)、没有进行凝血酶酶切的融合多肽GST-Mcfp-1-12和CELL-TAK分别做阴性和阳性对照，另外还将该组实验所加蛋白分别进行酪氨酸修饰和未修饰的两组蛋白进行对照。在潮湿的环境，25℃的条件下放置12h，取出干燥后，用蒸馏水流水冲洗2h；然后考马斯亮兰染色，如图4所示，结果表明在玻片A和金属钛C，粘合剂Mcfp-1-12与CELL-TAK的粘附能力类似，而在塑料培养皿D和金属铝B，粘合剂Mcfp-1-12具有比CELL-TAK更强的粘附能力。
实施例3：粘合剂Mcfp-1-12在硅金片上吸附量的测定
将浓度为1.44mg/ml的粘合剂Mcfp-1-125μl滴加到Pico EQCM石英晶片(欧特莱(天津)科学仪器技术有限公司)表面，同时滴加相同浓度的BSA、没有进行凝血酶酶切的融合多肽GST-Mcfp-1-12和CELL-TAK分别做阴性和阳性对照，另外还将该组实验所加蛋白分别进行酪氨酸修饰和未修饰的两组蛋白进行对照。在潮湿的环境，25℃的条件下放置12h，取出干燥后，用蒸馏水流水冲洗2h；真空干燥后，用QCM仪测定其频率变化，得到其粘附量的值。如图5，结果表明粘合剂Mcfp-1-12具有比其它对照组更强的粘附能力。
实施例4：粘合剂Mcfp-1-12粘接实验室塑料耗材
在实验室耗材塑料培养皿上滴加1.44μg/μL的粘合剂Mcfp-1-124μl，将白色塑料枪头放置于该多肽点上，同时用BSA和未修饰的Mcfp-1-12多肽作为对照。在潮湿的环境，25℃的条件下放置12h。如图6，结果表明粘合剂Mcfp-1-12将塑料培养皿与枪头粘合在一起，未进行修饰的Mcfp-1-12也能粘合培养皿和枪头，但很易脱落，BSA未能进行该粘合。
实施例5：粘合剂Mcfp-1-12粘接小鼠股骨
取小鼠股骨3根，折断，分别在3根股骨的断面上滴加浓度为1.44μg/μl的粘合剂Mcfp-1-12、未修饰的Mcfp-1-12多肽和BSA各8μl，在潮湿的环境，25℃的条件下放置12h。见图7，结果粘合剂Mcfp-1-12将断开的小鼠股骨粘接在一起，未进行修饰的Mcfp-1-12也能粘接断裂的股骨，但很容易再次断开，BSA未能进行该粘接。
实施例6：粘合剂Mcfp-1-12在短时间内粘附细胞
将玻片洗净，滴加5μl 1.44μg/μl的粘合剂Mcfp-1-12，超净台中干燥，然后用PBS洗两次。将Hela细胞消化打散后低速离心，去上清，用PBS洗两次，然后用无血清的DMEM培养基重悬细胞，计数，将细胞稀释到浓度为5×104个/ml，种入放有上述处理玻片的细胞培养皿里，37℃培养1h后，将玻片取出，用PBS洗涤5遍，在显微镜下观察细胞粘附情况。见图8，结果显示有粘合剂Mcfp-1-12包被的区域吸附了大量细胞，而未经处理的空白玻片上几乎没有粘附细胞。
实施例7：粘合剂Mcfp-1-12的细胞毒性分析
在4个96孔细胞培养板上每孔滴加4μl 1.44μg/μl的粘合剂Mcfp-1-12，超净台中干燥，然后用PBS洗2次，粘合剂包被与空白对照分别用4个孔的重复实验。按实施例6中同样处理Hela细胞和293T细胞，加入细胞的量分别为5×103个/ml和1×104个/ml浓度的100μl细胞液，分别培养12h、24h、36h和48h，加入5mg/ml的MTT 15μl，37℃培养4h，吸去含有MTT的培养基，加入150μl DMSO，室温下避光摇动1h，然后置于酶标仪读取波长为490nm的吸光度值。如图9和10，结果表明粘合剂Mcfp-1-12无细胞毒性。
序列表
引物序列如下：
引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，
引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’；
DNA片段(360bp)序列如下：
编码的氨基酸(120aa)序列为：YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPP
TYKPKISYPSTYKAKPSYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTY
KPKPSYASSYKPKIRYPPT
Claims (1)
1.一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：
1)从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA；
2)根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自Genbank No.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有EcoR I和Sal I酶切位点，引物序列如下：
引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，
引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’；
3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360bp)序列如下：
Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttat
aaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagc
caaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaaccta
agatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg
编码的氨基酸(120aa)序列为：YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPP
TYKPKISYPSTYKAKPSYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTY
KPKPSYASSYKPKIRYPPT
4)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD18-T克隆，再切出连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒；
5)将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导，表达出融合有GST的Mcfp-1第692位到811位氨基酸残基的多肽产物，标记为GST-Mcfp-1-12；
6)用谷胱甘肽—琼脂糖树脂纯化该多肽产物；
7)用凝血酶切除融合的GST，离心得到不溶性Mcfp-1功能肽段产物沉淀；
8)最后用酪氨酸酶对纯化的多肽产物进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂，命名为Mcfp-1-12。
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