JP2008504016A - イガイ接着蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図22
Description
本発明の接着剤の適用例は以下に限定されるわけではないが、(1)水(水または塩分のある水)中にある基質間の接着;(2)骨、靭帯、筋、半月(meniscus)及び筋肉の治療及び人工材料移植のような整形外科的治療;(3)穿孔、裂傷、切開などの治療並びに角膜移植、人工角膜挿入のような眼科的接合;(4)補正装置、架橋義歯、歯冠装着、緩んだ歯の固定、壊れた歯の治療及び充填剤固定のような歯科的接合;(5)血管接合、細胞組織接合、人工材料移植、傷縫合のような外科的治療;(6)植物の移植片接合、傷治癒のような植物での接合;(7)薬品、ホルモン、生物学的因子、医薬物、生理的または代謝的観察装置、抗生剤及び細胞の移植のような用途がある(参照:米国特許第5,015,677号)。
以下では、MGFP−5遺伝子をクローニングするためのイガイとしてムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)を用いた。
MGFP−5をクローニングするために、配列番号1のプライマー(5'−ggcctgcagcagttctgaagaatacaaggg−3)と配列番号2のプライマー(gtagatctatacgccggaccagtgaacag)をそれぞれ合成した。イガイcDNAライブラリーを鋳型としてPCRを30回実施して、243bp大きさのPCR産物を収得した(図1)。前記PCR産物はpGEM−Tベクター(プロメガ)にクローニングした。
pGEM−Tベクターに入っているMGFP−5 cDNAをPstIとEcoRI制限酵素サイト(restriction enzyme site)を利用して分離した後、PstIとEcoRI制限酵素で切られたpTrcHisAベクター(Invitrogen、米国)に挿入してpMDG05(4630bp)を製造した(図2)。pMDG05は大韓民国大田市儒城区魚隱洞に所在している韓国生命工学研究院(KCTC )に2002年6月20日付で寄託して寄託番号KCTC10291BPを受けた。
FP−1(Genbank No.Q27409又はS23760)のアミノ酸配列から、配列番号25と記載されるAKPSYPPTYKからなるペプチドが6回反復して連結されたFP−1変異体(以下、6xAKPSYPPTYKと言う)を製造した。
以下、MGFP−5はMGFP−05と記載し、MGFP−5のN−末端に実施例3の6xAKPSYPPTYKが結合された組合体はMGFP−150と記載して、MGFP−5のC−末端に6xAKPSYPPTYKが結合された組合体はMGFP−051と記載し、MGFP−5のN−末端及びC−末端全てに6xAKPSYPPTYKが結合された組合体はMGFP−151と記載する(前記表1参照)。
クローニング用E.coliTop10(F−mcrA(mrr−hsdRMS−mcrBC)Φ801acZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara−leu)7697 galU galK rpsL(Strr)endA1 nup、Invitrogen)及び蛋白質発現用として使用されたE.coli BL21(F−ompT hsdSB(rB−mB−)galdc)はそれぞれCaCl2バッファーを使用してコムペテント(competent)細胞を製造した。前記コムペテント細胞それぞれに実施例4のpMDG05、pMDG051、pMDG150及びpMDG151ベクターそれぞれを熱衝撃(42℃で2分間放置)方法によって形質導入した。その後、アンピシリン(ampicillin、Sigma)を利用した選別過程を通じて、それぞれの形質転換体、E.coliTop10/pMDG05、E.coliTop10/pMDG051、E.coliTop10/pMDG150、E.coliTop10/pMDG151、E.coli BL21/pMDG05、E.coli BL21/pMDG051、E.coli BL21/pMDG150及びE.coli BL21/pMDG151を収得した。
[6−1.E.coli BL21/pMDG05培養]
E.coli BL21/pMDG05はLB培地(5g/liter yeast extract、10g/liter Tryptone及び10g/liter NaCl)に培養し、培養液の吸光度が600nmで0.7〜0.8程度になった時にIPTGを最終濃度1mMで添加して組換え接着蛋白質であるMGFP−5の発現を誘導した。この時、50ml容の滅菌されたチューブに10mlのLB培地を入れて(500μgのアンピシリン添加)、12時間培養した培養液を100mlのLB培地が入っている500mlフラスコに入れて接種した。E.coli BL21/pMDG05培養液は13,000rpm、4〜10分間遠心分離して細胞ペレットを収得し、これを−80℃に保管した。
細胞ペレットはSDS−PAGE用緩衝液(0.5MTris−HCl、pH6.8、10%glycerol、5%SDS、5%β−mercaptoethanol、0.25%bromophenol blue)100μlに希釈して、100℃で5分間沸騰して変成させた。SDS−PAGEの場合、試料を15%のSDS−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、クマシブルー(Coomasie blue)染色またはシルバー染色(Bio−Rad、米国)を利用して蛋白質バンドを検出した。ウェスタンブロットの場合は試料を15%のSDS−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、ニトロセルロース膜に15V電圧下で移動させた。蛋白質が移動したニトロセルロース膜をモノクロナルヒスチジン親和性リガンド抗体(R&D Systems、米国)を利用してMGFP−5蛋白質を発色反応後検出した。
E.coli BL21/pMDG05で水溶性形状に発現する組換えMGFP−5を分離精製するために、pMDG05ベクターに入っているヒスチジン親和性リガンドを利用して親和性クロマトグラフィを行った。
MALDI−TOF(Matrix−assisted laser desorption ionization with time-of-flight)質量スペクトロスコーピー分析をPerSeptive Voyager DE instrument(Perkin−Elmer)を利用して実施した。
図12は精製したMGFP−5組換え蛋白質の質量分析結果である。
実施例6と同様な方法でE.coli BL21/pMDG051を培養し、細胞ペレットを収得した後、非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はSDS−PAGE及びウェスタンブロットを実施した。
実施例6と同様な方法でE.coli BL21/pMDG150を培養し、細胞ペレットを収得した後、非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はSDS−PAGE及びウェスタンブロットを実施した。
[9−1.MGFP−151の発現]
実施例6と同様な方法でE.coli BL21/pMDG151を培養し、細胞ペレットを収得した後非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はSDS−PAGE及びウェスタンブロットを実施した。
細胞ペレットに1g当り5mlの溶解分離緩衝液(lysis buffer、10mM Tris−Cl、100mM sodium phosphate、pH8.0)を加えて懸濁した後、20,000PSI(Constant systems、Low March、UK)で細胞を破砕した。細胞破砕物は18,000g、4℃で20分間遠心分離して細胞副産物は収得した。細胞副産物に5、10、15、20、25、30、22、24、26及び28(v/v)%の酢酸をそれぞれ1g当り20mlを加えて希釈した後、同一条件で遠心分離した。上層液はクロマトグラフィー用試料にした。
細胞ペレットに1g当り5mlの溶解分離緩衝液(lysisbuffer、10mM Tris−Cl、100mMsodium phosphate、pH8.0)を加えて懸濁した後、20,000PSI(Constant systems、Low March、UK)で細胞を破砕した。細胞破砕物は18,000g、4℃で20分間遠心分離して細胞副産物は収得した。細胞副産物に25%の酢酸溶液を1g当り20mlを加えて懸濁させ、同一条件で遠心分離した。上層液は凍結乾燥した後、5%酢酸溶液2mlに溶解してクロマトグラフィー用試料を製造した。
実施例6〜9で精製したMGFP−05、MGFP−051、MGFP150及びMGFP−151接着蛋白質それぞれは25mMのアスコルビン酸を含む5%の酢酸緩衝液に1.44mg/mlで溶解した後、50μg/mlのチロシナーゼを添加した後、25℃で6時間振盪した。前記過程を通じて接着蛋白質のチロシン残基をDOPAに変更(modified)した。また、BSA(Bovine serum albumin)は陰性対照群として利用し、イガイ接着蛋白質FP−1及びfp−2からなる商品名Cell−Tak(登録商標)(BD Bioscience、TwoOak Park、Belford、MA、USA)は陽性対照群として使用した。
MGFP−05組換え蛋白質及びMGFP−151組換え蛋白質のスライドガラス、ポリメチルメタクリレート板及びアルミニウム板の上でのコーティング能力を測定した。それぞれの表面は水で何回も洗った後、窒素ガスで乾燥した。1.44mg/mLの蛋白質溶液5μLをそれぞれの表面に点滴した後、25℃で12時間の間保管した。乾燥後、各板は二重蒸溜水で2時間振盪しながら洗い、各表面に残っている水は真空ポンプを利用して蒸発させた。乾燥後、表面にコーティングされた蛋白質はコマシブルー染色で目で見えるようにした。その結果は図18に示した。
使用した水晶結晶(Quartz Crystal、SeikoEG&G)は直径が5mmであり、基本振動数が9MHzである金でコーティングされたAT−cut水晶である。蛋白質の濃度が1.44mg/mLである蛋白質(BSA、Cell−Tak、MGFP−01組換え蛋白質及びMGFP−151組換え蛋白質)溶液5μLをそれぞれ水晶結晶の金表面上に置いた後、25℃の恒温水槽で12時間保管した。その後、恒温水槽から取り出して乾燥した後、二重蒸溜水で1時間の間振盪しながら洗い、水晶結晶に残っている水は真空ポンプを利用して蒸発させた。乾燥された水晶結晶はEQCMコントローラー(QCA917;Seiko EG&G)に連結し、共鳴振動数の変化を測定した。水晶結晶の振動数の減少は表面に吸着した質量と比例するので(G.Sauerbrey、1959、Z.Phys、155、206)、共鳴振動数の変化を数式1に代入して質量増加分を計算した(M.Thomson、1991、Analyst、116、881−889)。
力−距離曲線はAFM(SPA400;Seiko Instruments)を利用して求め、AFMのカンチレバーはducker et al.方法によって実施した(W.Ducker,Nature,1991,353,239−241、図20)。
ショウジョウバエ(Drosophila)S2細胞(Invitrogen)を利用した。
S2細胞は27℃の培養器で10%のIMS(insect medium supplement)、1%のAntibiotic−Antimycotic(Invitrogen)、ヒグロマイシン3μL/mLを含むM3培地(Shields and Sang M3 insect medium;Sigma)で培養した。滅菌されたスライドガラス(20mmx20mm、Marienfeld、German)に実施例10で準備したチロシナーゼ処理されたMGFP−5組換え蛋白質、MGFP−151組換え蛋白質、Cell−Tak及びBSAをそれぞれ10μL滴下した後、ラミナーフローフード(Laminar flow hood)で25℃で30分間放置した後、PBSで2回洗浄した。前記スライドガラスは95%の生存率を示す4x106cells/mLのS2細胞がある100−mm細胞培養皿に浸漬した。27℃の培養器で1時間〜7日間放置した後、付着されていない細胞はPBSで洗浄して除去し、トリパンブルー染色をして細胞生存率及び付着位置を確認した。
MGFP−5組換え蛋白質及びMGFP−151組換え蛋白質はガラスにそれぞれ点滴して、比較群としてCell−Takも点滴した。乾燥後、これを5%の酢酸、25%のメタノール及び70%の水からなる溶媒に浸して、20分間85℃で加熱した。その結果、ガラスまたはアクリル板にコーティングさせた接着蛋白質は溶媒条件で高温に放置する場合、MGFP−5は剥落するが、MGFP−151は継続して付着していることが分かった。
配列番号1〜4はプライマー配列である。
配列番号5はムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)から分離したMGFP−5蛋白質のcDNAである。
配列番号6はムラサキイガイ(Mytilus galloprovincialis)から分離したMGFP−5蛋白質配列である。
配列番号7はヨーロッパイガイ(Mytilus edulis)から分離したMEFP−5蛋白質の一部配列が6回反復連続したヌクレオチド配列である。
配列番号8はヨーロッパイガイ(Mytilus edulis)から分離したMEFP−5蛋白質の一部配列が6回反復連続したアミノ酸配列である。
配列番号9はFP−1とMGFP−5を組み合わせて製造したMGFP−150接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号11はFP−1とMGFP−5を組み合わせて製造したMGFP−015接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号12はFP−1とMGFP−5を組み合わせて製造したMGFP−015接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号13はFP−1とMGFP−5を組み合わせて製造したMGFP−151接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号14はFP−1とMGFP−5を組み合わせて製造したMGFP−151接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号15はMGFP−5の発現のためにpMDG05ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号16はMGFP−5の発現のためにpMDG05ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号17はMGFP−150の発現のためにpMDG150ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号18はMGFP−150の発現のためにpMDG150ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号19はMGFP−015の発現のためにpMDG015ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号21はMGFP−151の発現のためにpMDG151ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号22はMGFP−151の発現のためにpMDG151ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号23及び24はプライマー配列である。
配列番号25はFP−1の一部配列である。
配列番号26〜31はFP−1の一部配列であるAKPSYPPTYKをコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号32はT3プロモーターに対するプライマー配列である。
配列番号33はT7プロモーターに対するプライマー配列である。
配列番号34及び35はプライマー配列である。
Claims (49)
- 配列番号6のアミノ酸配列を有する接着蛋白質。
- 前記接着蛋白質はカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドをさらに含む、請求項1に記載の接着蛋白質。
- 前記物理化学的特性は溶解度、接着力、架橋度並びに蛋白質の発現、精製及び回収率増強からなる群より選択される、請求項2に記載の接着蛋白質。
- 前記ペプチドは接着蛋白質由来である、請求項2に記載の接着蛋白質。
- 前記接着蛋白質はイガイ由来の接着蛋白質である、請求項4に記載の接着蛋白質。
- 前記ペプチドは配列番号25に記載されたアミノ酸配列が1〜10回連続して連結されるものである、請求項2に記載の接着蛋白質。
- 前記接着蛋白質は配列番号10に記載されたアミノ酸配列、配列番号12に記載されたアミノ酸配列及び配列番号14に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の接着蛋白質。
- 前記ペプチドは6個のヒスチジン残基を含むものである、請求項2に記載の接着蛋白質。
- 前記接着蛋白質は配列番号16に記載されたアミノ酸配列、配列番号18に記載されたアミノ酸配列、配列番号20に記載されたアミノ酸配列及び配列番号22に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項8に記載の接着蛋白質。
- 請求項1に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号5に記載されたヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号6に記載されたアミノ酸配列で構成された接着蛋白質のカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドを含む請求項2に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 前記ペプチドは配列番号25に記載されたアミノ酸配列が1〜10回連続して連結されるものである、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は配列番号26〜31からなる群より選択されたヌクレオチド配列が1〜10回連続して連結されるものである、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは配列番号9に記載されたヌクレオチド配列、配列番号11に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号13に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号15に記載されたヌクレオチド配列、配列番号17に記載されたヌクレオチド配列、配列番号19に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号21に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項16に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を発現可能に含むベクター。
- 前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号5に記載されたヌクレオチド配列、配列番号9に記載されたヌクレオチド配列、配列番号11に記載されたヌクレオチド配列、配列番号13に記載されたヌクレオチド配列、配列番号15に記載されたヌクレオチド配列、配列番号17に記載されたヌクレオチド配列、配列番号19に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号21に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項18に記載のベクター。
- 前記ベクターはpMDG05(KCTC 10291BP)またはpENG151(KCTC 10766BP)である、請求項18に記載のベクター。
- 請求項18に記載のベクターで形質転換された形質転換体であって、
前記形質転換体は原核生物、真核生物及び真核生物由来細胞からなる群より選択されるものである形質転換体。 - 前記原核生物はE.coliまたはBacillus属菌株である、請求項21に記載の形質転換体。
- 前記真核生物は酵母、昆虫、植物及び動物からなる群より選択されるものである、請求項21に記載の形質転換体。
- 前記真核生物由来細胞は植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群より選択されるものである、請求項21に記載の形質転換体。
- (a)請求項1に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチドを発現可能に含むベクターを製造する段階と;
(b)前記ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を製造する段階と;
(c)前記形質転換体を培養して組換え接着蛋白質を生産する段階とを含む接着蛋白質の生産方法。 - 前記接着蛋白質はカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドをさらに含む、請求項25に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記物理化学的特性は溶解度、接着力、架橋度、蛋白質の発現、精製及び回収率増強からなる群より選択される、請求項26に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記ペプチドは接着蛋白質由来である、請求項26に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記接着蛋白質はイガイ接着蛋白質由来である、請求項28に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記ペプチドは配列番号25に記載されたアミノ酸配列が1〜10回連続して連結されるものである、請求項26に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記接着蛋白質は配列番号10に記載されたアミノ酸配列、配列番号12に記載されたアミノ酸配列及び配列番号14に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記ペプチドは6個のヒスチジン残基からなるものである、請求項26に記載の接着蛋白質の生産方法。
- 前記接着蛋白質は配列番号16に記載されたアミノ酸配列、配列番号18に記載されたアミノ酸配列、配列番号20に記載されたアミノ酸配列及び配列番号22に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項32に記載の接着蛋白質の生産方法。
- (a)請求項21に記載の形質転換体を破砕した後、遠心分離して上層液及びペレットをそれぞれ分離する段階と;
(b)前記ペレットに酸性有機溶媒を加えた後、懸濁させて懸濁液を製造する段階と;
(c)前記懸濁液を遠心分離して上層液を分離する段階とを含む接着蛋白質の精製方法。 - 前記酸性有機溶媒はpH3〜6を有する有機溶媒である、請求項34に記載の接着蛋白質の精製方法。
- 前記酸性有機溶媒は酢酸、クエン酸及び乳酸からなる群より1種以上選択されるものである、請求項34に記載の接着蛋白質の精製方法。
- 前記酢酸は5〜30(v/v)%の水溶液で使用される、請求項36に記載の接着蛋白質の精製方法。
- 前記(c)の上層液に対しゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施する、請求項34に記載の接着蛋白質の精製方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の接着蛋白質を有効性分として含む接着剤。
- 前記接着蛋白質を構成するチロシン残基総数の5〜100%が3,4−ジヒドロキシフェニル−L−アラニン(DOPA)に変更されたものである、請求項39に記載の接着剤。
- 前記接着剤はプラスチック、ガラス、金属、真核生物の細胞、原核生物の細胞、植物細胞の細胞壁及び脂質からなる群より選択された基質に接着されるものである、請求項39に記載の接着剤。
- 前記接着剤は生物試料に適用されるものである、請求項39に記載の接着剤。
- 前記接着剤は界面活性剤、酸化剤及び充填剤からなる群より選択された1種以上の物質をさらに含む請求項39に記載の接着剤。
- 前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシルベンゼン硫酸ナトリウムである、請求項43に記載の接着剤。
- 前記酸化剤はチロシナーゼまたはH2O2である、請求項43に記載の接着剤。
- 前記充填剤はコラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイタンスルフェート、エラスチン、ラミニン、カゼイン、ヒドロキシアパタイト及びアルブミン、フィブロネクチン及びヒブリンからなる群より選択される、請求項43に記載の接着剤。
- 前記接着剤は水中環境において使用される基質に適用されるものである、請求項39に記載の接着剤。
- 請求項39に記載の接着剤の接着力の調節方法であって、
酸化剤、充填剤及び界面活性剤からなる群より1種以上選択した物質で処理する段階、または前記接着剤の有効成分である接着蛋白質の濃度を調節する段階を含む接着力の調節方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の接着蛋白質を有効性分として含むコーティング剤。
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