WO2016151736A1

WO2016151736A1 - 接着性分子

Info

Publication number: WO2016151736A1
Application number: PCT/JP2015/058771
Authority: WO
Inventors: 司吉崎; 山下　桂司; 神谷　享子; 紘一鈴木; 義雄林
Original assignee: 中国電力株式会社; 株式会社セシルリサーチ
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2016-09-29
Also published as: EP3275890A4; EP3275890A1; JPWO2016151736A1; US20180362817A1; JP6063097B1; US10590320B2

Abstract

【課題】新規な接着性分子を提供することである。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の配列に対して保存的アミノ酸置換、欠失、挿入及び／又は修飾を含むアミノ酸配列を有する、接着性分子とする。

Description

接着性分子

　本発明は、接着性分子に関する。

　水中で使用可能な生物由来の接着性分子として、海洋生物であるフジツボやイガイ由来の接着性タンパク質が開示されている（例えば、特許文献１～３）。しかし、フジツボ由来の接着タンパク質は、実際は接着性を獲得するために６～８種類のタンパク質の混合が必要であるなど、生産方法が煩雑で実用化に至っていない。イガイ由来の接着タンパク質については、３種類の接着性タンパク質を含む細胞接着剤がＣｅｌｌ－Ｔａｋ^ＴＭの名称で市販されているものの、タンパク質の大量生産が難しく、高価である。そのため、新規な接着性分子の発見が望まれていた。

特開平８－２６６２８２号公報特開２０１３－２２６１５８号公報特開２００８－５０４０１６号公報

　本発明は、新規な接着性分子を提供することを目的とする。

　本発明者らは、クダウミヒドラ（Tubularia sp.）のアクチヌラ幼生のセメント腺に特異的に存在するペプチドから、ギャラクシンと３７％の相同性を有するタンパク質を発見した。この新たに発見されたタンパク質の性質について調査したところ、そのＣ末端の１８アミノ酸を一部置換した、配列番号１の配列を有するペプチドが接着性を有することを見出し、本発明に至った。なお、ギャラクシンとは、アザミサンゴ（Galaxea fascicularis）において、サンゴの骨格形成における石灰化機構に関与していると推定されているタンパク質（例えば、Fukudaら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003 Apr 25; 304(1):11-7を参照）であるが、これまで接着性に関する知見は報告されていない。

　本発明の一実施態様は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の配列に対して保存的アミノ酸置換、欠失、挿入及び／又は修飾を含むアミノ酸配列を有する、接着性分子である。前記接着性分子が少なくとも１つのジヒドロキシフェニルアラニンを含んでもよい。

　本発明の他の実施態様は、上記接着性分子を含む接着剤である。

　本発明の更に他の実施態様は、上記接着性分子をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。

　本発明の更に他の実施態様は、上記接着性分子をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターである。

　本発明の更に他の実施態様は、第１の物体を第２の物体に接着させる接着方法であって、上記接着性分子を含む接着剤を、第１の物体表面に付着させることを含む、接着方法である。

　本発明の更に他の実施態様は、上記接着剤を、物体表面に付着させることを含む、物体表面のコーティング方法である。

　本発明の更に他の実施態様は、接着性分子の接着性を増強する方法であって、チロシナーゼと、上記接着性分子と、を反応させることを含む、方法である。

　本発明によって、新規な接着性分子を提供することができるようになった。

本発明の一実施形態に係る、接着性分子を微生物に産生させるために使用するベクターpGEX4T-1のマップである。本発明の一実施形態に係る、大腸菌に産生させたGST－組換えペプチド融合体のSDS-PAGEの結果である。本発明の一実施形態に係る接着性分子の接着性を示す図である。本発明の一実施形態に係る接着性分子の接着性を示す図である。

　以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。

　実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

　本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）本発明の接着性分子
　本発明の接着性分子は、NRVDNYKEVYNKIYNKRN（配列番号１）、又は配列番号１に対して保存的アミノ酸置換、欠失、挿入及び／又は修飾を含む配列を有する。本発明において、「保存的アミノ酸置換、欠失、挿入及び／又は修飾」とは、ペプチドの特性を失わない、つまり接着性分子の接着性を失わない置換、欠失、挿入及び／又は修飾を意味する。本発明において、接着性とは、物体表面に付着し、水洗しても物体表面から脱離しない性質を表し、実施例２に記載の試験で青色部分が確認された場合に、接着性を有すると判断する。この接着性を利用し、接着性のある物質に同時に二つの物体を接着させることによって、二つの物体を接着させ、結合させることができる。

　本発明の保存的アミノ酸置換の例として、アミノ酸残基の嵩高さ、極性、疎水性又は親水性、酸性又は塩基性等によって分類された各アミノ酸群内におけるアミノ酸置換が挙げられる。当業者においては、その分類の例は周知であり、様々な文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)や、Zubay, G., Biochemistry, third edition, Wm. C. Brown Publishers (1993)を参照）。例えば、下記に例示するアミノ酸群に基づいて、保存的アミノ酸置換となるアミノ酸を選択することができる。括弧内の文字は３文字表記されたアミノ酸である。　
疎水性アミノ酸（Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val）
親水性アミノ酸（Arg、Asp、Asn、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Ser、Thr）
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（His、Phe、Tyr、Trp）
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro）
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ser、Thr、Tyr）
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Cys、Met）
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Asp、Asn、Glu、Gln）
酸性アミノ酸（Asp、Glu）
塩基性アミノ酸（Arg、Lys、His）
極性を有するアミノ酸（Gln、Asn）
非極性アミノ酸（Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Trp）
側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）
β分岐側鎖を有するアミノ酸（Thr、Val、Ile）
　あるアミノ酸配列に対する１から数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は修飾を含むアミノ酸配列を有するペプチドが、元のペプチドの性質を失わないことはすでに知られている（例えば、Mark,　D.　F.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1984)　81,　5662-5666、Dalbadie-McFarland,　G.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1982)　79,　6409-6413を参照）。

　保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、修飾の数は、接着性分子の接着性が失われない範囲であれば特に限定されず、それぞれ１以上の任意の数でよい。好ましくはそれぞれ４つ以下、より好ましくはそれぞれ３つ以下、更に好ましくはそれぞれ２つ以下、最も好ましくはそれぞれ１つ以下である。

　好ましくは、本発明の接着性分子の配列は、NRVDNYKEVYNKIYNKRN（配列番号１）の配列からなる。

　また、好ましくは、本発明の接着性分子は、チロシン残基の少なくとも１つが修飾されジヒドロキシフェニルアラニン（以下DOPAと称する）となっている。DOPAとは、チロシン残基のベンゼン環の３位の水素が水酸基で置換されたものである。本発明の接着性分子が含むDOPAの数は、より好ましくは２つ、更に好ましくは３つである。チロシン残基をDOPAにする方法は特に限定されず、例えば、水酸基への置換作用、酸素添加作用、酸化作用のある分子を用いてよい。好ましくは、チロシナーゼである。
（２）本発明の接着性分子の製造方法
　本発明の接着性分子の製造方法は特に限定されないが、化学合成法や、細胞に産生させる方法が例として挙げられる。

　化学合成法の例として、Boc法、Fmoc法等のペプチド固相合成法や、液相合成法が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、ペプチドの長さがある程度短い方が合成は容易であると認識されており、本発明の接着性分子の長さは合成が容易に可能なものである。

　また、細胞に産生させる方法については、本発明の接着性分子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、その接着性分子を発現することができる発現ベクターを構築し、細胞に導入して形質転換体を作製し、その形質転換体に本発明の接着性分子を産生させればよい。発現ベクターの構築、細胞への導入、及び細胞に産生させる方法は、当業者にはよく知られるところであり、入手可能な任意の方法で行ってよい。細胞は限定されず、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、微生物等が例として挙げられ、一般的には、大腸菌がよく用いられる。細胞に産生させた本発明の接着性分子は、細胞から、又は細胞を培養した培地から、当業者に知られる任意の方法で回収し、精製すればよい。精製された本発明の接着性分子は、そのまま凍結したり、凍結乾燥したりして、任意の方法で保存することができる。

　更に、本発明の接着性分子の製造において、チロシン残基をDOPAにする反応の反応条件、例えばチロシン残基とチロシナーゼとを反応させて、本発明の接着性分子の接着性を増強してもよい。所望の接着性を得るため、チロシナーゼとの反応時間を適宜調整してもよく、反応時間は特に限定されないが、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上、更に好ましくは６０分以上である。
（３）本発明の接着性分子の用途
　本発明の接着性分子は、物体同士を接着する接着剤の有効成分として用いることができる。接着する物体は特に限定されないが、ガラス、プラスチックや樹脂等の高分子化合物、金属、木材、生体試料が例として挙げられる。接着する物体は、異なる物体を接着しても、同じ物体を接着してもよい。

　また、本発明の接着性分子を含有する接着剤に含有される他の成分は、接着剤に所望の接着力を付与したり、使用環境に適した性質を付与したりするために適宜選択されてもよい。代表的な例としては、賦形剤が挙げられる。賦形剤の例としては、公知の界面活性剤、酸化剤、充填剤が挙げられる。また別例として、既に知られている接着性分子を含有してもよい。

　接着剤における本発明の接着性分子の濃度は特に限定されず、例えば、１～９９％（w/v）、５～９５％（w/v）、１０～９０％（w/v）、２０～８０％（w/v）、３０～７０％（w/v）、４０～６０％（w/v）の中から適宜選択されてもよい。好ましくは、本発明接着性分子の濃度は、０．００１％（w/v）以上、より好ましくは０．０１％（w/v）以上である。接着剤の形態は特に限定されず、液体であっても固体であってもよい。例として、液状、霧状又はゲル状の接着剤や、テープ状の接着剤が挙げられる。

　本発明の接着分子及びそれを用いた接着剤の使用環境は、特に限定されず、例えば、水中（淡水中又は塩水中）や生体内が使用環境の例として挙げられる。例えば、土木建築分野における水中での接着剤としての使用、医療分野における、歯科用接着剤（接着性レジンセメントともいう）や止血剤等体内における使用、再生医療用試薬又はそれらの成分としての使用、等が挙げられる。

　また、本発明の接着性分子は、物体表面に付着する性質を利用しコーティング剤として用いることもできる。このコーティング剤によって、物体表面が接着性を有するようになるため、移動するもの（例えば、微粒子、微生物、大小生物など）をトラップすることができる。なお、本発明の接着性分子は水洗しても脱離しないため、水中で物体をコーティングすることで、海洋生物などのトラップとして利用することができる。
（４）本発明の接着性分子を用いた接着方法及びコーティング方法
　本発明の接着分子を含む接着剤を用いて、物体同士を接着することができる。例えば、本発明の接着剤を、物体表面に任意の方法、例えば滴下や塗布等によって付着させ、その上に別の物体を配置し、乾燥させると、それら物体同士を接着することができる。接着に用いる接着剤の量は目的に応じて任意に設定してよい。

　本発明の接着分子を含む接着剤を用いて、物体表面をコーティングする方法としては、例えば、本発明の接着性分子を任意の濃度で含む接着剤を、物体表面に任意の方法、例えば滴下や塗布等によって付着させ、適宜乾燥すればよい。

　接着方法及びコーティング方法において、乾燥時間は特に限定されないが、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、更に好ましくは３０分以上、最も好ましくは６０分以上である。接着又はコーティング面積に応じて、更に長い時間乾燥を行ってもよい。

＜実施例１＞　大腸菌を用いた接着性分子の製造
　配列番号１のアミノ酸配列に対応する塩基配列を決定し、その塩基配列の両末端に制限酵素BamHIの認識配列を付加した人工ポリヌクレオチド（配列番号２）を作製した。

　図１に示す、ベクターpGEX4T-1（Merck Millipore社製）を上記制限酵素で切断し、上記人工ポリヌクレオチドとライゲーションした。人工ポリヌクレオチドのベクターへの挿入後の塩基配列を、シークエンシングによって確認した。このベクターを、ホスト大腸菌（BL21, GEヘルスケア株式会社製）に、付属のプロトコールに従って導入し、形質転換体を作製した。ここで、pGEX4T-1は、発現させるペプチドが、そのN末端にGlutathione S-transferase（GST）が融合するように構成されている。

　得られた形質転換株を、アンピシリンが終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したLB培地中で、３７℃で振とう培養し、培地の濁度（OD600）が０．４～０．８となった時点で、LB培地にイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）を終濃度０．１ｍＭとなるよう添加し、GST－組換えペプチド融合体の発現を誘導した。IPTG添加後は、LB培地の濁度が一定になるまで、すなわち大腸菌の増殖が定常状態になるまで、３７℃で３時間振とう培養を続けた。なお、IPTG濃度０．１ｍＭ、温度３７℃で３時間という培養条件は、GST－組換えペプチド融合体が、後述の可溶性画分に可溶となるようにする目的で設定したものである。

　次いで、形質転換株を含む培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃）にかけ、上清を除去し、沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline, PBS）で再懸濁し、PBS懸濁液を得た。PBS懸濁液を超音波破砕処理し、次いで１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離にかけ、上清を回収した。上清は可溶性画分であり、GST－組換えペプチド融合体が存在する。この可溶性画分を、Glutathione Sepharose 4B担体（GEヘルスケア株式会社製）と混合し、GST－組換えペプチド融合体を担体に吸着させた。吸着方法は、担体に添付のプロトコールに従った。GST－組換えペプチド融合体を吸着した担体を、PBSで数回洗浄した後、トロンビンを溶解したPBSと混合し、室温（22～25℃）で2～16時間インキュベートして、組換えペプチドをGSTから切断した。次いでこの混合液を、遠心分離（５０００　g、４℃、５分間）にかけ、上清を回収した。上清には組換えペプチドとトロンビンが含まれるが、トロンビンはベンザミジンカラム（セリンプロテアーゼ精製・除去用カラム、GEヘルスケア株式会社製）を用いて除去した。以下、回収した組換えペプチドを39s1Cと称する。なお、形質転換体におけるGST－組換えペプチド融合体の発現は、図２に示すSDS-PAGEによって確認した。GST－組換えペプチド融合体のバンドは、黒塗りの矢印で示すバンドである。
＜実施例２＞　本発明の接着性分子のガラスへの接着性試験
　精製した39s1Cを純水と混合して得たペプチド液、及びBSAを純水に溶解したペプチド液の、２種類のペプチド液を調製した。どちらのペプチド液も、ペプチド濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。各ペプチド液１μｌをスライドグラス上に滴下し、次いで、凍結乾燥状態のチロシナーゼをリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）に溶解して調整したチロシナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１μｌを滴下した各ペプチド液に加えてピペッティングによって軽く混合した。次いで、スライドグラスを２２～２５℃の飽和水蒸気下に静置し、０分又は３０分インキュベートした。インキュベート後、室温にて３０分の減圧乾燥を行った。次いで、スライドグラスを蒸留水に浸したまま、４５回／分の振とうで３０分間洗浄を行い、再度、室温にて３０分減圧乾燥を行った。乾燥後、スライドグラスを０．２５％ＣＢＢ（Ｒ‐２５０）溶液に一晩浸し、次いで蒸留水でスライドグラスを数回洗浄し、CBBによる染色で青色になった部分があるかを目視で確認した。ペプチドがガラス表面に付着していれば、CBB染色による青色部分が確認される。

　図３に示すように、３０分間の洗浄後、BSAは、反応時間０分、３０分ともに、スライドグラスに付着していなかった（図３（Ｂ））。それに対し、39s1Cは、３０分間の洗浄を経ても、反応時間０分、３０分ともに、スライドグラスに付着していることを示す青色部分が観察され、39s1Cとチロシナーゼとを３０分インキュベートしチロシン残基をDOPA化させた方が、より濃い青色が観察され、スライドグラスにより多く付着していたことが確認された（図３（Ａ））。
＜実施例３＞　本発明の接着性分子の金属への接着性試験
　精製した39s1Cを純水と混合して得たペプチド液を調製した。ペプチド濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。ペプチド液１μｌをアルミニウム（Al）板、銅（Cu）板及び鉄（Fe）板表面に滴下した。次いでチロシナーゼ溶液１μｌ（１ｍｇ／ｍｌ、凍結乾燥状態のチロシナーゼをリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）に溶解し調製したもの）を加えてピペッティングによって軽く混合した。次いで、スライドグラスを２２～２５℃の飽和水蒸気下に静置し、３０分インキュベートした。インキュベート後、室温にて３０分の減圧乾燥を行った。次いで、スライドグラスを蒸留水に浸したまま、４５回／分の振とうで３０分間洗浄を行い、再度、室温にて３０分減圧乾燥を行った。乾燥後、スライドグラスを０．２５％CBB（R-250）溶液に一晩浸し、次いで蒸留水でスライドグラスを数回洗浄し、CBBによる染色で青色になった部分があるかを目視で確認した。ペプチドが金属表面に付着していれば、CBB染色による青色部分が確認される。図４に示すように、どの金属板に対しても、39s1Cは付着していた。

Claims

　配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の配列に対して保存的アミノ酸置換、欠失、挿入及び／又は修飾を含むアミノ酸配列を有する、接着性分子。
　前記接着性分子が少なくとも１つのジヒドロキシフェニルアラニンを含む、請求項１に記載の接着性分子。
　請求項１又は２に記載の接着性分子を含む接着剤。
　請求項１又は２に記載の接着性分子をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
　請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
　第１の物体を第２の物体に接着させる接着方法であって、請求項３に記載の接着剤を、第１の物体表面に付着させることを含む、接着方法。
　　請求項３に記載の接着剤を、物体表面に付着させることを含む、物体表面のコーティング方法。
　接着性分子の接着性を増強する方法であって、チロシナーゼと、請求項１の接着性分子と、を反応させることを含む、方法。