JP5765512B2

JP5765512B2 - バイオシリカの製造法

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Publication number: JP5765512B2
Application number: JP2009125168A
Authority: JP
Inventors: 祐介松田; 雅人堀口; 弘磯部; 高康井上; 亜紀子堀江
Original assignee: Kwansei Gakuin Educational Foundation; Fuji Chemical Co Ltd
Current assignee: Kwansei Gakuin Educational Foundation; Fuji Chemical Co Ltd
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2029-05-25
Also published as: JP2010268762A

Description

本発明は、バイオシリカ（bio-silica）の製造法、およびバイオシリカの製造においてバイオシリカの形状を制御する方法等に関する。

シリカは多種多様な用途に欠かせない材料であるが、一般に工業的なシリカ材料の作製方法は酸やアルカリの薬品を大量に使用し、かつ反応にも長時間を要する。これに対し、近年、生物を使用するバイオミネラリゼーションが注目を浴びている。

生物の歯や骨、貝殻や真珠などは、有機物と無機物とが互いにナノスケールからマクロスケールで融合または複合した構造体である。このような鉱物を生物が作り出す作用をバイオミネラリゼーションと呼ぶ。自然界では、膨大な量のシリカ(SiO₂)が生物によって産出・利用されている。その生物の代表例が単細胞の珪藻である。珪藻の細胞壁は多くの植物の細胞壁とは異なり、セルロースではなくシリカを主成分として構成されている。

1999年以降Kroegerらにより、海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformisの細胞壁をフッ素酸で溶かした溶液から、4kDa〜8kDaのポリペプチドSilaffin-1A₁，Silaffin-1A₂，Silaffin-1Bが単離され、これらのポリペプチドそれぞれにin vitroにおいて球状バイオシリカ形成能があることが示された(非特許文献１、２参照)。また、これら３種類のポリペプチドのアミノ酸配列はsilaffin-1と呼ばれる遺伝子上に、Silaffin-1A₂とSilaffin-1Bとは１回ずつ、Silaffin-1A₁は５回繰り返しコードされていた（図１参照）。

Silaffin-1は翻訳後調節により細胞内で分解作用を受け、それぞれの機能リピート単位に断片化されてから機能すると考えられているが、実際に生体内で各機能リピート単位に分かれてから機能しているかどうかは不明であり、リピート構造が保たれたまま機能している可能性も否定できない。いずれにしても、ケイ酸を顆粒状に凝集させ、球状バイオシリカ形成活性を有するこれらのポリペプチド（以下、総称して「シラフィン」という。）は、他の種類の珪藻にも存在し、珪藻殻形成に関与していると考えられている。

ところで近年、半導体微細加工技術をはじめとするナノテクノロジー分野では、生体物質の自己組織化機能に注目が集まっている。中でも、自然界の珪藻殻が持つ幾何学的な微細構造が注目されている。上述のように、珪藻由来ペプチドのシラフィンがin vitro系で珪酸を顆粒状に凝集させ、バイオシリカ形成活性を有することから、この生体物質の自己組織化機能を細胞外の人工的な環境で良好に再現・コントロールすることで、珪藻殻自己組織化機能を利用した人工バイオミネラリゼーション技術を開発・確立し、さらにこれを半導体微細加工技術に応用することが期待されている。そのため、例えばシラフィンを用いて半導体基板表面にナノスケールのバイオシリカを形成する場合に、基板表面へのシラフィンの吸着を制御することで、基板上にバイオシリカを所望のパターンに形成する技術の開発が求められている。

シラフィンを用いたバイオシリカの製造は、半導体微細加工技術への応用にとどまらず、種々の産業利用が期待されている。その一例が、バイオシリカを酵素などの生体高分子の固定化用担体として利用し、この機能高分子担体をバイオリアクターやバイオセンサー等に利用する技術の開発である。ナノスケールの球状バイオシリカは単位重量あたりの表面積が非常に大きく、このバイオシリカに活性を保持したまま酵素などの機能高分子を固定することで、バイオリアクター等に有用な優れた反応素子の提供が期待できる。また、ナノスケールのバイオシリカは球状以外の形状（例えば、繊維状）についても、マイクロフィルター、シリカナノファイバー、またはそれらの中に高分子機能を包埋した機能材料等の幅広い分野に応用し得る。そのためには、バイオシリカの形状や粒径（粒の大きさ）を良好に制御し、特にその微細化を図る方法が求められている。もちろん、バイオシリカの微細化は半導体微細加工技術への応用においても重要である。

これまでに、シラフィンまたはそのキメラ蛋白を使用してバイオシリカを製造する方法がいくつか報告されている（特許文献１、非特許文献３〜７参照）。さらに、組換えシラフィン（EAK₁-R5）により形成されるシリカの大きさや構造は、温度や試薬の添加順序などによって操作が可能なことも示されている（非特許文献３参照）。しかし、これらの文献では、いずれも基質として高価なテトラメトキシシラン（TMOS）が用いられており、製造コストがかかることが難点であった。また、生成されるシリカの形状を制御する方法についても、より安全性及び操作性の優れたものが求められているのが現状である。

一方、ケイ酸ナトリウムを原料にしてミクロサイズのシリカを製造する方法についても報告がある。１つは非イオン性界面活性剤の存在下でアルカリケイ酸塩水溶液と鉱酸を混合撹拌してマイクロポアシリカ多孔質粒子を得る方法で（特許文献２）、もう１つはケイ酸ナトリウムをウシ血清アルブミン存在下で重合することにより生成粒子径を制御する方法である（非特許文献８）。しかしながら、これらはいずれもシラフィンを用いてバイオシリカを製造する方法ではない。

特開２００６−１９７８２５号公報特開２００４−１８２４９２号公報

Nils Kroeger, Rainer Deutzmann, Manfred Sumper (1999) Polycationic Peptides from Diatom Biosilica That Direct Silica Nanosphere Formation. Science, 286:1129-1132. Nils Kroeger, Rainer Deutzmann, Manfred Sumper (2001) Silica-precipitating Peptides from Diatoms: The Chemical Structure of Silaffin-1A from Cylindrotheca fusiformis. J. Biol. Chem., 276:26066-26070. Marner WD et al, Biomacromol., (2008), vol. 9, No.1, p.1-5 M.B. Dickerson et al., J Nanoscience Nanotechnology, (2005), vol. 5, No.1, p.63-67 Rajesh R. Naik et al., Chem. Commun., 2004, 7; (15), p.1684-85 日本植物生理学会年会要旨集、vol.49, p.357, 2008年日本農芸化学会大会講演要旨集、vol.2007, p.18, 2007年 T Coradin, ChemBioChem, 2003, 3, p.1-9

上述の通り、ナノオーダーの特定形状のシリカは、様々な分野への応用が期待されているが、従来の方法では製造コストが高く、また得られるバイオシリカの形状制御も困難であるという問題があった。そこで、本発明は、シラフィンを用いたバイオシリカの新規製造法、および、シラフィンを用いたバイオシリカの製造において、バイオシリカの微細化を図るためその形状を制御する方法を提供すること等をその課題とする。

本発明者らは、大腸菌発現系により大量精製した単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンの２種類の組換えシラフィンを用いて種々のバイオシリカ形成条件について検討した結果、バイオシリカの形状及び粒径が、用いる基質を選択すること、及び／又は当該基質に応じて反応液中或いは反応液の表面に中性環境を作成することによって変化し、これら該中性領域のｐＨ勾配を調節することで、形成されるバイオシリカの形状及び粒径を制御しうること等を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記の発明を包含するものである。
項１．シラフィンを用いてバイオシリカを製造するにあたり、用いるケイ酸原を選択すること並びに／又はシラフィン及びケイ酸原を含有する反応液のｐＨを変えてｐＨ勾配を形成することにより、得られる形状を制御することを特徴とするバイオシリカの製造方法。
項２．ケイ酸原が活性ケイ酸である、項１に記載の製造方法。
項３．シラフィン及び活性ケイ酸を含有する酸性反応液に塩基を添加して中性環境を形成する、項２に記載の製造方法。
項４．シラフィン及び活性ケイ酸を含有する酸性反応液のｐＨが２〜４の範囲である、項３に記載の製造方法。
項５．シラフィン及びケイ酸ソーダを含有する塩基性反応液に酸を添加して中性環境を形成する、項１に記載の製造方法。
項６．シラフィンが組換えシラフィンである、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
項７．シラフィンが単リピート型又は７回リピート型の組換えシラフィンである、項６に記載の製造方法。
項８．シラフィンがヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンである、請求項６又は７記載の製造方法。
項９．項１〜８のいずれかの方法により製造されたバイオシリカ。
項１０．シラフィン及びケイ酸を含有する酸性若しくはアルカリ性反応液中に、アルカリ若しくは酸を添加又は接触させて、該反応液中又は反応液の表面にｐＨ勾配を形成させ、それにより形成されるバイオシリカの形状を制御する方法。

本発明によれば、バイオシリカの形状及び粒径を制御することにより新規なバイオシリカが得られ、高い強度のシリカ構造や安定な無機物−有機物コンポジットの形成が可能になる。それらは新規機能材料として幅広い分野に使用できる。

また、本発明のシラフィンを用いたバイオシリカの製造方法により、バイオシリカを限られた領域に規則性を持って配列できるようになるため、本発明は半導体微細加工の新たな技術としても非常に有用である。

さらに、本発明のシラフィンを用いたバイオシリカの製造方法によって得られた様々な形状のシリカは、マイクロフィルター、シリカナノファイバー等としても利用することができ、またそれらの中に例えばビオチンのような極めて吸着容量の大きな低分子を包埋することにより、あらゆるタンパク質の固定化担体としても利用し得る。

海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformis由来シラフィン-1の全アミノ酸配列、および組換えシラフィン等を説明する図である。酸性のシラフィン反応液に塩基を滴下することによって得られるバイオシリカ形成を示す写真である。Ａ：活性ケイ酸をシラフィン反応液に滴下した後の最初の反応を示す。Ｂ：単リピートシラフィンによって形成された最初の反応生成物を示す。Ｄ：水酸化ナトリウムを滴下することによって得られたバイオシリカ形成を示す。Ｅ、Ｇ：水酸化ナトリウム（Ｅ）及びＴｒｉｓ−Ｂａｓｅ（Ｇ）を滴下した場合に形成された繊維状バイオシリカを示す。Ｃ、Ｆ、Ｈ：シラフィンなし。酸性シラフィン反応液に各種濃度の水酸化ナトリウムを滴下した場合のバイオシリカ形成を示す写真である。Ａ：単リピート型シラフィン、Ｂ：７回リピート型シラフィン。アルカリ性のシラフィン反応液に酸を滴下することによって得られるバイオシリカ形成を示す写真である（単リピート型シラフィンを用いた）。Ａ：塩酸添加前のシラフィン反応液。Ｂ：シラフィンを含まない反応液。Ｃ：塩酸を滴下した後の最初の反応。Ｄ：塩酸を滴下した後のシラフィンを含まない反応液。Ｅ：一度シリカ沈殿が観察されたシラフィン反応液に塩酸を滴下することによってさらに形成されたバイオシリカ。アルカリ性のシラフィン反応液に酸を滴下することによって得られるバイオシリカ形成を示す写真である（単リピート型シラフィンを用いた）。Ａ：硫酸を滴下することによって形成されたバイオシリカのＳＥＭ顕微鏡画像。Ｂ：硫酸を滴下することによって形成されたバイオシリカの粒径分布。Ｃ、Ｄ：塩酸を用いた場合の結果。Ｅ、Ｆ：酢酸を用いた場合の結果。アルカリ性のシラフィン反応液に酸を滴下することによって得られるバイオシリカ形成を示す写真である（シラフィン濃度は１０μＭであり、単リピート型シラフィンを用いた）。Ａ、Ｂ：硫酸を滴下することによって得られたバイオシリカのＳＥＭ顕微鏡画像（Ａ：低倍率、Ｂ：高倍率）。Ｃ：硫酸を滴下することによって得られたバイオシリカの粒径分布。Ｄ、Ｅ、Ｆ：塩酸を用いた場合の結果。Ｇ、Ｈ、Ｉ：酢酸を用いた場合の結果。

以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面においてアミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えばアミノ酸については、ＧまたはＧｌｙ：グリシン、ＡまたはＡｌａ：アラニン、ＶまたはＶａｌ：バリン、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン、ＳまたはＳｅｒ：セリン、ＴまたはＴｈｒ：スレオニン、ＣまたはＣｙｓ：システイン、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸、ＫまたはＬｙｓ：リジン、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン、ＹまたはＴｙｒ：チロシン、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン、ＰまたはＰｒｏ：プロリン、ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン、ＱまたはＧｌｎ：グルタミンである。

［１］バイオシリカの製造方法
本発明のバイオシリカ製造法の一実施態様として、シラフィンを用いてバイオシリカを製造するにあたり、ケイ酸原を選択することによって、反応液のｐＨを変えることなく製造することができる。

さらに、好ましい実施態様としては、選択するケイ酸原に応じて、シラフィン及び当該ケイ酸原を含有する酸性若しくはアルカリ性反応液中又は該反応液の表面で中性環境を形成し、該中性環境の領域においてバイオシリカを形成させれば、より効率的に短時間で新規な形状のバイオシリカを製造することが出来る。

シラフィンは、天然シラフィン、合成シラフィンまたは組換えシラフィンの使用が例示され、特に限定されるものではないが、大腸菌などを用いた大量調製が可能なことから組換えシラフィンの使用が好ましい。図１および配列表の配列番号１には、海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformis由来天然シラフィン-1（Silaffin-1）の全アミノ酸配列が示される。この一部のポリペプチド（SSKKSGSYSGSKGSK）を化学合成した合成シラフィンには、バイオシリカ形成能（沈積能）が認められている。組換えシラフィンとしては、常法に従い得られる組換えシラフィンが用いられる。たとえば、上記のようなバイオシリカ形成活性の中心となる配列をコードした遺伝子領域を含む発現ベクターを構築し、これらを導入して形質転換された、大腸菌を培養することにより得られるシラフィンを用いることができる。また、何らかの機能タンパク質の遺伝子を、バイオシリカ形成活性の中心となる配列をコードした遺伝子に融合させたもので、大腸菌を形質転換し、これらの大腸菌を培養して得られるシラフィンを用いてもよく、得られるシラフィンがバイオシリカ形成活性を有する限り用いることができる。ここで発現ベクターの構築、形質転換、大腸菌の培養などの手法としては、周知の操作と材料を用いて行うことができる。

本発明者が大腸菌発現系により大量精製した単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンの２種類の組換えシラフィンの配列が、それぞれ配列番号４と５に示される。このうち単リピート型シラフィンは、シラフィン-1のリピート単位Ｒ７のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加したアミノ酸配列からなる。他方、７回リピート型シラフィンは、シラフィン-1の７つのリピート単位Ｒ１〜Ｒ７のアミノ酸配列（配列番号３）のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加したアミノ酸配列からなる（図１参照）。

後述の実施例に示すように、上記の単リピート型シラフィンおよび７回リピート型シラフィンのいずれもバイオシリカ形成活性が確認されているので、これらの組換えシラフィンを本発明に使用することが好ましい。これらの組換えシラフィンは、ニッケルカラムを用いて精製するためにＣ末にヒスチジンのタグを付加しているが、このようにヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンを使用することは以下の点から好ましい。即ち、シラフィンを用いてin vitro系でバイオシリカを形成する場合に、反応溶液中にニッケルイオンを加えることで、組換えシラフィンのヒスチジン側鎖がニッケルイオンと結合し、ニッケルを含有した特殊なバイオシリカの形成が可能である。このように他の原子・分子と結合親和性のある配列タグを付加した組換えシラフィンを使用することは、他の原子・分子を含有した特殊なバイオシリカを形成するのに有用である。なお、付加するのに好ましいヒスチジンタグの大きさは、ヘキサマー以上である。

もちろん、使用する単リピート型シラフィン、７回リピート型シラフィンの各アミノ酸配列は配列番号２〜５に示されるものに限られず、このうち１〜数個のアミノ酸を置換、欠失または付加させたものを使用してもよいし、２〜６回リピート型のシラフィンを使用してもよい。さらに、バイオシリカ形成活性を有する限り、他の珪藻由来のシラフィンや、その合成シラフィン、組換えシラフィンを使用してもよい。ここで、バイオシリカ形成活性を有するシラフィンとは、自発的なゲル化などの沈積作用でなく、短時間に、さまざまなケイ酸分子の重合を引き起こし、タンパク質乃至ペプチド等の生体高分子生成を促進する活性を有するシラフィンをいう。

本発明の製造方法の一実施態様においては、バイオシリカの原料となる物質であるケイ酸原（換言すれば、シラフィンのバイオシリカ形成活性の基質となる物質）を選択することによりバイオシリカを形成する場合、ケイ酸原の選択は、初期重合度を指標にして行うことができる。例えば、当該指標に基づいて、ケイ酸原として活性ケイ酸などを選択使用すれば、酸性環境においてｐＨを変えることなくバイオシリカを製造できる。本発明において、「初期重合度が低い」とは、通常、初期平均重合度が約２００以下、好ましくは１００程度以下のことをいう。このようなケイ酸原のなかでも、生成直後の活性ケイ酸やテトラアルコキシシランからアルコキシ基を脱離した直後のものなどが好適な例として挙げられ、さらには、イオン交換樹脂などを用いてケイ酸ソーダから結合するナトリウムなどをはずして得られる活性ケイ酸などがより好ましい。好適な活性ケイ酸としては、製造してすぐの、初期重合度の低いものが好ましく、とりわけ、２００程度以下の重合度、好ましくは１００程度以下の重合度のもの、より好ましくは３０程度以下の重合度のものが好ましい。粒度としては、粒径が５ｎｍ以下、好ましくは、１〜４ｎｍの粒径の活性ケイ酸が好ましい。

上述のように、生成直後の活性ケイ酸などが望ましく用いられるが、さらに、シラフィン及びケイ酸原を含有する反応液を酸性環境乃至塩基性環境からｐＨを変えて中性環境にし、バイオシリカを形成すれば、より効率的にシリカを形成することができる。

本発明のバイオシリカ製造法の好ましい実施態様において、シラフィン及びケイ酸原を含有する反応液のｐＨを変えてｐＨ勾配を形成することによりバイオシリカを形成する場合、使用するケイ酸原は特に限定はされないが、酸性又はアルカリ性のケイ酸類を用いるのが好ましい。使用できる具体的な基質・原料の例示としては、活性ケイ酸（SiO₂）、ケイ酸ソーダ（ケイ酸ナトリウム（Na₂O・nSiO₂・mH₂O、式中ｎ及びｍは整数を表す））、ケイ酸カリウム、メタケイ酸マグネシウム(MgSiO₃)、オルトケイ酸マグネシウム(Mg₂SiO₄)、マグネシウムトリシリケート(Mg₂Si₃O₈)、マグネシウムメゾトリシリケート、蛇紋石(Mg₃Si₂O₇)、三ケイ酸マグネシウム・などのケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、ケイ酸カルシウムアルミニウム、テトラメトキシシランなどのテトラアルコキシシランなどが挙げられる。好ましい具体例としては、活性ケイ酸、ケイ酸ソーダ、ケイ酸カリウム、テトラメトキシシランなどのテトラアルコキシシランからアルコキシ基を脱離した直後のものなどが挙げられ、とりわけ、活性ケイ酸（特に生成直後の活性ケイ酸）が好ましい。

本発明の製造方法の好ましい実施態様の一つを以下に具体的に説明する。

まず、反応液のｐＨを変えてｐＨ勾配を形成することによるバイオシリカ形成反応のために、シラフィン、基質・原料となるケイ酸原（例えば活性ケイ酸）、水、緩衝液を含有する反応液を作成する。反応液中に含有させるシラフィンの量は、単リピート型シラフィンの場合、終濃度が通常１００ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１μＭ〜１０μＭとなるように調節し、７回リピート型シラフィンの場合、終濃度が通常１０ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１００ｎＭ〜１０μＭとなるように調節する。また、反応液に含有させるケイ酸原の量は使用するケイ酸原料の種類によっても異なるが、ケイ素のモル量として終濃度が通常１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭ〜２００ｍＭとなるように調節する。

当該反応液は、使用するケイ酸原の種類によって、酸性またはアルカリ性のいずれあってもよい。例えば、ケイ酸原が活性ケイ酸などの場合、シラフィン及びケイ酸原を含有する反応液は酸性（ｐＨ２〜４）になる。ケイ酸原がケイ酸ソーダ、ケイ酸カリウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、ケイ酸カルシウムアルミニウムなどの場合、シラフィン及びケイ酸原を含有する反応液はアルカリ性（ｐＨ９〜１1）になる。また、反応液を所望の適切なｐＨ環境に調整するために、反応液中にトリス塩酸、クエン酸リン酸等の各種緩衝液などを含有させてもよい。

次いで、反応液のｐＨを変えてｐＨ勾配を形成する。より具体的には、上記反応液中またはその表面に中性環境を形成する。本発明において「中性環境を形成する」とは、酸性反応液であれば塩基（アルカリ溶液）を、またはアルカリ性反応液であれば酸（酸性溶液）を、それぞれの反応液に添加するか、或いは塩基又は酸をガス状若しくは液状にして反応液表面に吹きつけるなどして、反応液中又はその表面に中性環境（ｐＨ６〜８）を作り出すことをいう。添加する方法は特に限定はされず、反応液を撹拌しながらそこへ酸、塩基又はそれらの水溶液（以下単に試薬と称す場合もある）を滴下する方法、反応液に試薬をマイクロフィーダで微量ずつ供給する方法などが挙げられる。また反応液表面に試薬を、噴霧器等を用いて吹き付ける方法や揮発性のガス（例、アンモニアガスなど）により、液面ｐＨを変える方法などの方法を採用することもできる。

本発明の製造方法においては、酸性反応液に塩基を添加して中性環境を形成する場合は、該中性領域におけるシラフィン触媒反応の反応点近傍で幅１０〜４００ｎｍの繊維状バイオシリカが形成される。また、アルカリ性反応液に酸を添加して中性環境を形成する場合は、該中性領域におけるシラフィン触媒反応の反応点近傍で粒子径１００ｎｍ以下の微小な球状バイオシリカが形成される。各バイオシリカの形状及び幅・粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）などを用いることにより測定可能である。

酸性反応液に添加する塩基（アルカリ溶液）としては、例えば、水酸化ナトリウム、Tris-base（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられ、より好ましくは、水酸化ナトリウム、Tris-base、水酸化カリウムなどが挙げられる。用いる塩基の濃度は、酸性反応液中又は表面に中性環境を形成し得る濃度であれば特に限定はされないが、通常、１０ｍＭ〜１Ｍの塩基を用い、好ましくは、１０ｍＭ〜５００ｍＭの塩基を用いる。添加する塩基の濃度が低いほど、得られる繊維状シリカの繊維の幅が細くなる。

アルカリ性反応液に添加する酸としては、例えば、硫酸、塩酸、酢酸、その他の有機酸などが挙げられ、好ましくは、硫酸、塩酸及び酢酸が挙げられる。用いる酸の濃度は、アルカリ性反応液中又は表面に中性環境を形成し得る濃度であれば特に限定はされないが、通常、１０ｍＭ〜１Ｍの酸を用い、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭの酸を用いる。添加する酸が弱酸であるほど、得られる球状シリカの粒径が微小になる。

また、本発明の製造方法における反応温度については、通常、０〜６０℃、好ましくは、１０〜６０℃、さらに好ましくは、２０〜４０℃の範囲で反応を行う。反応温度が０℃より低くになると得られるバイオシリカの粒子径が不均質になり、また６０℃より高くなると得られるバイオシリカはゲル状になる。

さらに、本発明には上記製造方法によって得られたバイオシリカも包含される。

［２］バイオシリカの形状を制御する方法
上述のように、用いるシリカ基質・原料を活性ケイ酸などに選択するか、又は／及び用いるケイ酸原すなわちシリカ基質の種類に応じてシラフィン反応液のｐＨを酸性又はアルカリ性に調整し、さらに中性環境を形成するために反応液に加える塩基又は酸の種類によってｐＨ勾配を作ることにより、得られるバイオシリカの形状および大きさを制御することが可能となる。

したがって、本発明には、シラフィン及びケイ酸原を含有する酸性若しくはアルカリ性反応液中に、アルカリ若しくは酸を添加又は接触させて、該反応液中又は反応液表面にｐＨ勾配を形成させ、それにより形成されるバイオシリカの形状を制御する方法が包含される。

本発明の制御方法においては、シラフィン及びケイ酸原を含有する酸性反応液にはアルカリを、アルカリ性反応液には酸を添加又は接触させて、所望のｐＨ勾配を形成する。ｐＨ勾配がアルカリ性から酸性へ向かう場合は、１０〜５００ｎｍの球状のバイオシリカが得られる。また、ｐＨ勾配が酸性からアルカリ性へ向かう場合は、１０〜４００ｎｍ幅の繊維状のバイオシリカが得られる。

以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施例の記載によって何ら制限されるものではない。
（実施例１）
［１］実験に使用したシラフィン
シラフィンは、大腸菌発現系により大量精製した単リピート型の組換えシラフィン-1および７回リピート型の組換えシラフィン-1の２種類を使用した。（以下、これらを総称して、「組換えシラフィン」あるいは単に「シラフィン」という場合がある。）
シラフィンの調製において、宿主大腸菌にはBL21(DE3) (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada)を使用し、プラスミドベクターにはpET21a (Novagen, EMD Biosciences, Inc., Canada)を使用した。また、ヒスチジンタグを付加し、ニッケルニトリロ酢酸(Ni-NTA)カラムを用いて精製を行った。実験に使用した単リピート型の組換えシラフィンおよび７回リピート型の組換えシラフィンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４及び５に示される。

（実施例２）
［２］シラフィン酸性反応液への塩基添加
精製・濃縮・Buffer置換したシラフィンのサンプルに対し、Buffer置換に使用した脱imidazole bufferを用いて、観察するシラフィン濃度条件の10倍濃度になるように段階希釈を行った。そして以下の反応溶液を作製し、ｐH３の条件でシラフィン反応を行った。なお、以下の反応液中におけるケイ素のモル量は約１４７ｍＭである。また、使用した活性ケイ酸の初期重合度は約１００以下である。

Citric acid - phosphate buffer 1(89.2 mM Citric acid, 21.6 mM Na₂HPO₄)
(終濃度 17.8 mM) 200 μL
組換えシラフィン-1 100 μL
超純水 600 μL
1 % 活性ケイ酸水溶液 100 μL
Total 1000 μL
反応から3分後、上清を200 μLずつ取り分け、それぞれ2 μLの1 M, 500 mM, 100 mM, 50 mM, 10 mM NaOHを添加あるいは1 M Tris-base（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）を添加し、それぞれ5分間静置した。塩基性試薬を添加しなかった反応液、NaOHを添加した反応液、Tris-baseを添加した反応液それぞれに対し超純水での洗浄操作を数回(実験時期によって異なる)行い、反応産物を回収した。その後、ガリウム砒素基板（以下、「GaAs基板」という場合がある。）に、得られたバイオシリカを10μL程度スポットし、シリカゲル吸湿剤を敷いた10cmプラスチックシャーレに静置した後、フタをしてパラフィルムで密閉し数時間放置し、バイオシリカを乾燥させた。乾燥後、電子線露光装置 (ELS-3300PLM, Elionix, Tokyo, Japan)の走査型電子顕微鏡(SEM)機能を用いてバイオシリカを観察した。用いたNaOHはpK_b= 0.2、Trisは温度依存性があるが室温(25 ℃)でのpK_a = 8.06である。

（結果）
活性ケイ酸を含むシラフィン反応液を長時間静置すると微量のシリカ沈積物が生じたが、繊維状ではなかった(図２A)。
そこで、得られたバイオシリカを沈殿させ（上記参照）、上清に2 μLの1 M, 500 mM, 100 mM, 50 mM, 10 mM NaOH, あるいは1 M Tris-baseを添加すると直ちにバイオシリカ形成が起きた。1 M, 500 mM NaOHや1 M Tris-baseなど比重の大きい塩基は拡散せず試験管の底に滞留し、2層の液層を形成した。1 M NaOHの場合上層はpH 3、下層はpH 12であった。反応はこの境界から上層にかけて見られた(図２D)。100 mM 以下のNaOHは拡散したが、バイオシリカの収量は少なかった(data not shown)。得られたバイオシリカ構造は、幅 100 〜 400 nmの繊維状構造を含んでいた(図２B、E、G)。単リピート型シラフィンによって形成するバイオシリカでは、塩基添加した場合に繊維状構造を形成しやすく、添加した塩基濃度が低いほど繊維の幅は細くなった(図３A)。7回リピート型シラフィンを用いた場合は、添加した塩基の濃度に関わらず均質な繊維状構造であった(図３B)が、添加した塩基の濃度が高いほどゲルが多く認められた(data not shown)。

（実施例３）
［３］シラフィンアルカリ性反応液への酸添加
精製・濃縮・Buffer置換したシラフィンのサンプルに対し、Buffer置換に使用した脱imidazole bufferを用いて、観察するシラフィン濃度条件の10倍濃度になるように段階希釈を行った。そして以下の反応溶液を作製し、ｐＨ１０．５の条件でシラフィン反応を行った。なお、以下の反応液中におけるケイ素のモル量は約８９ｍＭである。

リン酸緩衝液
(終濃度 80 mM) 200 μL
組換えシラフィン-1
(1.5 μMと10 μMの2通り) 100 μL
超純水 600 μL
ケイ酸ソーダ (終濃度 1%) 100 μL
Total 1000 μL
反応液を10 分間程度放置してバイオシリカ形成が起きないことを確認した後、反応液に1 μLの0.5M H₂SO₄を添加したもの、1 μLの1M HClを添加したもの、1 μLの1M CH₃COOHを添加したものの3通りについて、それぞれ酸添加後5分間静置した。この時の溶液の変化を、デジタルカメラを用いて記録した。また反応産物は超純水での洗浄を行い回収した。
その後、ガリウム砒素基板（以下、「GaAs基板」という場合がある。）に、得られたバイオシリカを10μL程度スポットし、シリカゲル吸湿剤を敷いた10cmプラスチックシャーレに静置した後、フタをしてパラフィルムで密閉し数時間放置し、バイオシリカを乾燥させた。乾燥後、電子線露光装置 (ELS-3300PLM, Elionix, Tokyo, Japan)の走査型電子顕微鏡(SEM)機能を用いてバイオシリカを観察した。

（結果）
ケイ酸ソーダを含むシラフィン反応液はバイオシリカを形成しなかった(図４A)が、この反応液に1 μLのHClを添加すると酸の拡散領域にのみシラフィン反応が認められた(図４C)。この酸添加により生成したバイオシリカを沈殿し、その上清のpHを測定すると依然10.5であった。この上清に再びHClを添加すると酸拡散領域におけるシリカ形成が再び起きた(図４E)。

酸強度の異なる硫酸(H₂SO₄)、塩酸(HCl)、酢酸(CH₃COOH)の3種類の酸を用いて、酸性側へのpH変動の違いがバイオシリカ形成に反映されるかを検証した。3種類の酸の酸解離定数pKaはそれぞれ次の通りで、H₂SO₄はpK_a= −10, 1.99、HClはpK_a = −7、CH₃COOHはpK_a = 4.8である。それぞれ球状のバイオシリカ粒子形成が認められた(図５及び図６)。いずれの酸を用いて形成されたシリカ粒子も粒子径は≦100 nmの微小なものであった。
通常、添加した酸が強酸であるほど最頻粒子径が大きくなる。

以上のように、本発明は、シラフィンを用いたバイオシリカの新規製造法、およびバイオシリカ形状を制御する方法を提供するものであり、前述したとおり、半導体微細加工技術への利用のほか、マイクロフィルター、シリカナノファイバー若しくはこれらの中に高分子機能を包埋した機能材料として、また電気・電子材料、光学材料、酵素固定化材料として、さらには各種バインダーや充填材としてなど、様々な分野における新規機能材料として利用しうるなどといった産業上の利用可能性を有するものである。

［配列番号１］海洋性珪藻Cylindrotheca fusiformis由来シラフィン-1の全アミノ酸配列
［配列番号２］単リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号３］７回リピート型シラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号４］単リピート型シラフィン-1のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列
［配列番号５］７回リピート型シラフィン-1のＮ末にメチオニンを、Ｃ末にロイシン、グルタミン酸およびヒスチジンヘキサマーを付加した組換えシラフィン-1のアミノ酸配列

Claims

下記（Ａ）または（Ｂ）に記載する組換えシラフィン、及びケイ酸原を用いてバイオシリカを製造する方法であって、
（Ａ）配列番号２〜５のいずれかに記載するアミノ酸配列からなる組換えシラフィン
（Ｂ）配列番号２〜５のいずれかに記載するアミノ酸配列のうち、１〜数個のアミノ酸を置換、欠失または付加させてなる、バイオシリカ形成活性を有する組換えシラフィン：
ケイ酸原として活性ケイ酸を用い、当該活性ケイ酸と上記組換えシラフィンを含有する酸性の反応液に塩基を添加してｐＨ６〜８の中性環境を形成して繊維状バイオシリカを製造するか、または
ケイ酸原としてケイ酸ソーダ、ケイ酸カリウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、及びケイ酸カルシウムアルミニウムからなる群から選択される少なくとも１種のケイ酸塩を用い、当該ケイ酸塩と上記組換えシラフィンを含有するアルカリ性の反応液に酸を添加してｐＨ６〜８の中性環境を形成して球形バイオシリカを製造することを特徴とするバイオシリカの製造方法。
組換えシラフィン及び活性ケイ酸を含有する酸性反応液のｐＨが２〜４の範囲、または組換えシラフィン及びケイ酸塩を含有するアルカリ性反応液のｐＨが９〜１１の範囲である、請求項１に記載の製造方法。
形成される繊維状バイオシリカの幅が１０〜４００ｎｍ、または形成される球状バイオシリカの粒子径が１０〜５００ｎｍである、請求項１または２に記載する製造方法。
酸性の反応液に添加する塩基の濃度、またはアルカリ性の反応液に添加する酸の濃度がそれぞれ１０ｍＭ〜１Ｍである、請求項１乃至３のいずれかに記載する製造方法。
組換えシラフィンがヒスチジンのタグを付加した組換えシラフィンである、請求項１乃至４のいずれかに記載する製造方法。
請求項１〜５のいずれかの方法により製造されたバイオシリカ。
シラフィン及びケイ酸を含有する酸性若しくはアルカリ性反応液中に、アルカリ若しくは酸を添加又は接触させて、該反応液中又は反応液の表面にｐＨ勾配を形成させ、それにより形成されるバイオシリカの形状を制御する方法。