JP3619280B2 - ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は水中や湿潤な環境で使用できる接着剤の原料となるペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造するために用いる遺伝子ＤＮＡに関する。接着蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積される該ポリペプチドを採集することにより、得られる該ペプチドは、接着剤の原料として広い用途で利用されることが期待される。
【０００２】
【従来の技術】
乾燥条件下で強い接着力を示す接着剤は様々な種類のものが開発されている。そのうちの多くのものは一旦乾燥条件下で接着してしまえば湿潤環境におかれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達することができる接着剤は存在しなかった。
ムラサキイガイは自己を良好な環境に固定するために接着蛋白質を合成して自己を基物に接着させることができる。この接着蛋白質には大まかには２種類あることがこれまでに知られていた（Ｒｚｅｐｅｃｋｉ，Ｌ．Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ｗａｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ １８３：１２３−１３７，１９９２ ）。
【０００３】
上記２種の一方の蛋白質（以下「第１蛋白質」という）は、主として数十個のＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ という１０アミノ酸の繰り返しにより構成される蛋白質で、配列中のＰｒｏ 及びＴｙｒ 残基はしばしば修飾されてそれぞれヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）及びドーパ（Ｄｏｐａ）残基に変換されていることが知られており、ドーパのキノン架橋が接着に関与することが推測されている（Ｊ．Ｈ．Ｗａｉｔｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ，７：９−１４，１９８７）。この蛋白質のｃＤＮＡについてはすでに明らかにされ、その一部の配列を用いて、微生物に作らせる方法がすでに報告されている（特開平１−１０４１８０号公報）。
【０００４】
もう一方の蛋白質（以下「第２蛋白質」という）は、上皮性細胞増殖因子に似た配列を繰り返し持つ構造であることが明らかにされている（Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｍｉｋｉ，Ｄ．，Ｏｄｏ，Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）。
近年さらに新たな接着蛋白質成分（以下「第３蛋白質」という）が、単離され、その部分アミノ酸配列が明らかにされたが（Ｗａｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．）、その全アミノ酸配列及び遺伝子の配列は明らかにされていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子工学の手法を用いて第３蛋白質を生産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、第３蛋白質の配列を得るために、日本産のムラサキイガイより第３蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離した。日本産のムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ ）はチレニアイガイとも呼ばれる地中海系の種である（Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｊ．Ｌｉｎｎｅａｎ Ｓｏｃ．，２０：３６５−３７４，１９８３ ）。研究の結果、日本産ムラサキイガイの足から抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりすでに知られている第３蛋白質の断片配列と相同性のある配列を持つｃＤＮＡ配列を単離することに成功し、さらにその塩基配列を決定して本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードするムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子である。
また、本発明は、ＤＮＡ配列が配列番号２で表される上記記載のムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする。ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であって、前記配列と同様の接着特性を有するアミノ酸配列をいう。
【０００９】
本発明の遺伝子の塩基配列の一例としては、配列番号２で示される塩基配列を挙げることができる。
本発明の遺伝子は以下の手順で得ることができる。まず日本産ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ ）の足をチオシアン酸グアニジン等により可溶化し、フェノール／クロロホルムによる抽出を行ない、イソプロパノールにより沈殿させることにより全ＲＮＡを得ることができる。全ＲＮＡを得る方法はこの方法に限定されるものではなく、ＬｉＣｌ沈殿法や塩化セシウム溶液に重層して遠心することによっても得られる。
【００１０】
全ＲＮＡから、部分アミノ酸配列から設計したプライマーを用いて逆転写ＰＣＲ法を行なうことにより部分ｃＤＮＡ配列を増幅することができる。また、その部分配列から設計したプライマーを用いてＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ：ＵＳＡ．８５：８９９８−９００２（１９８８））法を行なうことによりｃＤＮＡの両末端を含むＤＮＡ配列を増幅することができる。さらにこの５’及び３’非翻訳領域の配列から設計したプライマーを用いて全コーディング領域を含むｃＤＮＡ断片を得ることができる。得られた断片の配列はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手順により翻訳開始コドンから終止コドンまでを含む第３蛋白質ｃＤＮＡを単離することができる。
【００１１】
単離した配列は適当な発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることにより、当該ペプチドを大量調製することが可能である。この際、当該ＤＮＡはシグナル部分（配列番号２に示す塩基配列の１番目の塩基から６３番目の塩基の部分）を含むため、当該ペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シグナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用いることにより細胞内で生産させることも可能である。
【００１２】
【実施例】
〔実施例１〕 部分配列の増幅
岩手県宮古市宮古湾で採集した殻長３〜５ｃｍのムラサキイガイ１２個体の足をチオシアン酸グアニジン、クエン酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルザルコシン酸ナトリウム、β−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械的に破砕し、フェノール及びクロロホルムによる抽出を行なって蛋白質等を除去したのち、イソプロパノールを加えて沈殿させることにより約１ｍｇの全ＲＮＡを得た。
【００１３】
次にこのＲＮＡを鋳型としてＲｏｃｈｅ 社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールにしたがって逆転写ＰＣＲを行なった。ｃＤＮＡの合成にはキットに添付のオリゴｄＴプライマーを用いた。断片の増幅には２種のプライマーＧＡ（Ｔ，Ｃ）ＴＡ（Ｔ，Ｃ）ＴＡ（Ｔ，Ｃ）ＧＧ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）ＣＣ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）ＡＡ（Ｔ，Ｃ）ＧＧ及びＴＴＣ ＣＡ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）ＣＣ（Ａ，Ｇ）ＴＴ（Ａ，Ｇ）ＴＴＣ ＣＡ（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）ＣＣ（Ｔ，Ｃ）ＴＴ をミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成して用い、９４℃３０秒、４０℃３０秒、７２℃９０秒の増幅サイクルを３０回、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のサーマルサイクラー４８０ を用いて行なった。得られたＤＮＡ断片はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ を用いてプラスミドベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋） に挿入した。挿入断片の配列をＡｐｐｌｙｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３ＡＤＮＡ シーケンサー及びＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて決定した。
【００１４】
〔実施例２〕 末端配列の増幅
決定した断片配列を用いて、その上流及び下流の配列をＲＡＣＥ法により増幅した。すなわち、上流の増幅は５’−ＡｍｐｌｉＦｉｎｄｅｒ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて添付のプロトコールに従って行なった。鋳型として足の全ＲＮＡを用い、相補鎖合成プライマーとしてＧＣＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＴ、増幅用プライマーとしてＧＴＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＣＧ ＴＣＴ を各々ミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成して用いた。増幅は、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１２０ 秒の増幅サイクルを４０回、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のサーマルサイクラー４８０ を用いて行なった。得られたＤＮＡ断片はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてプラスミドベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋） に挿入した。挿入断片の配列をＡｐｐｌｙｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３ＡＤＮＡ シーケンサー及びＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて決定した。下流の配列は全ＲＮＡを鋳型としてＲｏｃｈｅ 社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールにしたがって逆転写ＰＣＲを行なった。ｃＤＮＡの合成にはオリゴｄＴプライマーを用い、断片の増幅には２種のプライマーＴＡＴ ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＧＴ ＴＡＴ ＧＧＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＣ 及びＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ をミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成して用い、９４℃３０秒、３７℃３０秒、７２℃１２０ 秒の増幅サイクルを４０回、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のサーマルサイクラー４８０ を用いて行なった。得られたＤＮＡ断片はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ を用いてプラスミドベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋） に挿入した。挿入断片の配列をＡｐｐｌｙｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３ＡＤＮＡ シーケンサー及びＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて決定した。
【００１５】
〔実施例３〕 全コーディング領域の増幅
コーディング領域全体を含む配列を得るために、得られた５’− 及び３’− 非翻訳領域の配列をもとに、再度逆転写ＰＣＲを行なった。逆転写ＰＣＲは５’− 非翻訳領域の一部の配列のセンス鎖に相当するプライマーＴＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＧ及び３’− 非翻訳領域の一部の配列のアンチセンス鎖に相当するプライマーＡＴＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＡ をミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成して用い、次にこの全ＲＮＡを鋳型としてＲｏｃｈｅ 社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、添付のプロトコールにしたがって逆転写ＰＣＲを行なった。ｃＤＮＡの合成にはキットに添付のオリゴｄＴプライマーを用いた。断片の増幅には５’− 非翻訳領域の一部の配列のセンス鎖の相当するプライマーＴＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＧ及び３’− 非翻訳領域の一部の配列のアンチセンス鎖に相当するプライマーＡＴＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＡ をミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成して用い、９４℃３０秒、４０℃３０秒、７２℃９０秒の増幅サイクルを３０回、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のサーマルサイクラー４８０ を用いて行なった。得られたＤＮＡ断片はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ を用いてプラスミドベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋） に挿入した。なお、このプラスミドベクターを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｍｇｆｐ３−４は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８６６ として寄託されている（寄託日平成７年３月２７日）。
【００１６】
挿入断片の配列をＡｐｐｌｙｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３ＡＤＮＡ シーケンサー及びＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて決定した。この配列を配列番号２に示す。また、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１７】
【発明の効果】
本発明は、ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子を提供する。本発明の遺伝子から作られる蛋白質は、接着剤の原料として極めて有用である。
【００１８】
【配列表】

【００１９】

Claims (2)

1. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ接着特性を有する蛋白質、をコードするムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子。
2. ＤＮＡ配列が配列番号２で表される請求項１記載のムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子。