CN102344488A - 厚壳贻贝足腺多酚蛋白的提取方法及快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种贻贝足腺黏附蛋白的提取及其快速检测方法，用醋酸-尿素抽提结合还原剂的使用从厚壳贻贝足腺中提取黏附蛋白粗品，通过反相高效液相色谱结合氯化硝基四氮唑蓝(NBT)特异性染色来鉴别富含DOPA的贻贝粘蛋白组分，从而有效地提高了厚壳贻贝足腺粗蛋白中富含DOPA的多酚黏附蛋白的收率。本发明提取方法简单、易操作且成本较低，检测方法快速，并在液相条件下可以直接检测DOPA含量，较传统方法操作简便，且可以进行DOPA的定量分析，更有助于提高贻贝黏附蛋白提取过程中的命中率和回收率，制得的贻贝足腺黏附蛋白可用于生物粘合剂的制备。

Description

厚壳贻贝足腺多酚蛋白的提取方法及快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种贻贝足丝黏附蛋白的提取以及快速检测方法，具体为从厚壳贻贝足腺组织中提取多酚黏附蛋白并进行DOPA含量的快速检测。

背景技术

贻贝属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、翼形亚纲(Pterimorphia)、贻贝目(Mytioida)、贻贝科(Mytilidae)，是一种常见的海洋双壳贝类，可通过其足腺细胞分泌的足丝与礁石、船体等固体表面形成牢固连接，并可经受海浪的反复冲刷而不脱落。贻贝足丝蛋白(mussel foot proteins，mfp)是贻贝科所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白，也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。贻贝的足丝黏附蛋白的粘合力及防水性能极强且无毒性，是现有任何粘合剂均无法比拟的，因此在医药、造船、涂料等行业具有广泛的应用前景。贻贝足丝黏附蛋白中大都含有大量的翻译后修饰的3，4-二羟基苯丙氨酸(3，4-dihydroxyphenyl-L-alanine，DOPA)，而贻贝足丝黏附蛋白正是通过DOPA与外界基质之间形成氢键从而具备强黏附能力的，因此，DOPA的含量与贻贝足丝黏附蛋白的黏附能力呈正相关，即DOPA含量越高，其足丝黏附蛋白的黏附能力越强。目前，贻贝足丝黏附蛋白中，公认的黏附能力最强的是mfp-3和mfp-5两种足丝蛋白，这两种蛋白分子量分别为5-7kDa和9kDa左右，序列中DOPA的含量超过＞20mol％，较其他足丝蛋白(＜5mol％)要高很多。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种贻贝足腺粘附蛋白的提取方法，采用醋酸-尿素抽提结合反相高效液相分离来进行提取，原料来源广泛、操作简单且成本较低。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种贻贝足腺粘附蛋白的快速检测方法，根据检测DOPA含量来对洗脱峰进行筛选。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝足腺黏附蛋白的提取方法，其特征在于采用醋酸-尿素抽提系统结合还原剂进行提取，包括以下步骤：

1)取活的厚壳贻贝足部清洗除去色素层，剪碎在-5℃～0℃温度下加入至含7～9mol/L尿素的4～6(wt)％的醋酸溶液中，另加入0.05～0.15mmol/L的三羧乙基膦作为还原剂；

2)将上述组织混合液进行冰浴匀浆；

3)将匀浆液离心处理，取上清液；

4)把得到的上清液按体积比1∶2±0.2(优选1∶2)加入预冷的-82℃～-86℃丙酮，静止20～40分钟，以沉淀总蛋白，经离心弃上清，收集沉淀，溶于4～6(wt)％的醋酸溶液中，即获得贻贝足腺黏附蛋白粗品；

5)最后将上述复溶后的厚壳贻贝足腺黏附蛋白粗品经0.4～0.5μm膜过滤，上样反相高效液相色谱进行脱盐及粗分，并以紫外光进行检测，收集洗脱峰，冷冻干燥即可。

所述步骤5中上样反相高效液相色谱具体为：采用C18反相半制备柱，流动相为：A液为含0.09-0.11(wt)％三氟乙酸的去离子水，B液为含0.09-0.11(wt)％三氟乙酸的乙腈；采用40分钟内10％到50％的B液浓度进行线性梯度洗脱，流速2.0～3.0毫升/分钟.

所述尿素的浓度为8mol/L，所述醋酸溶液的浓度为5(wt)％，所述三羧乙基膦的浓度为0.1mmol/L。

所述膜为0.45μm。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝足腺黏附蛋白的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将贻贝足腺黏附蛋白粗品经反相高效液相色谱分离的洗脱峰进行蛋白质含量测定；

2)对洗脱峰进行DOPA含量测定：利用NBT染色剂对DOPA的特异性染色，通过与标准浓度的L-DOPA与NBT染色后的492nm光吸收值进行比较，从而计算出蛋白样品中的DOPA含量，再与蛋白质定量所获得的蛋白质含量数据进行比较，从而计算出黏附蛋白中DOPA的比例；

3)根据DOPA的含量大小进行筛选，含量越高，粘附能力越强，收集含量高的洗脱峰。

所述蛋白质含量测定是采用Bradford染色法进行，具体为：以牛血清白蛋白作为标准蛋白，事先配置标准浓度的牛血清白蛋白，加入Bradford染色液后在酶标仪上测定630nm波长的光吸收值，绘制标准曲线，之后再检测样品蛋白与Bradford染色反应后的630nm波长的光吸收值，通过与标准曲线对照从而计算蛋白质含量。

本发明从中国东海海域常见的经济贝类厚壳贻贝的足腺中快速获得富含DOPA的多酚黏附蛋白，可用以制备生物粘合剂。同时，鉴于贻贝足丝蛋白的种类复杂，而其黏附能力与其序列中的DOPA含量直接相关，本发明还建立了一种从贻贝足腺黏附蛋白粗品中快速检测DOPA含量的技术，将有助于提高贻贝黏附蛋白提取过程中的命中率和回收率。

贻贝的足丝中虽然富含黏附蛋白，但其状态为固化状态，水溶性极差，不利于提取，而足腺中储存的足丝黏附蛋白处于前体状态，尚未固化，因此，从贻贝足腺中直接提取足丝黏附蛋白是一种较好的选择，其操作简单，无需昂贵试剂；贻贝足丝蛋白中含有大量的L-3，4-二羟基苯丙氨酸(3，4-dihydroxyphenyl-L-alanine，DOPA)，该基团在有氧气及甘氨酸钾存在的碱性条件下，会参与发生氧化还原反应。而氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotretrazolium blue chloride，NBT)为脱氢酶(dehydrogenase)或氧化酶(oxidase)的底物，即NBT为H受体，在其接受H后可形成蓝紫色沉淀。传统的DOPA检测方法主要是先对蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后再进行转膜，之后对膜上的蛋白质印迹进行NBT特异性染色以检测DOPA的存在，该方法操作繁琐且不能对DOPA进行定量检测，本发明在液相条件下直接检测DOPA含量，较传统方法操作简便，且可以进行DOPA的定量分析

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用醋酸-尿素抽提结合反相高效液相分离提取厚壳贻贝足腺中多酚黏附蛋白，提取方法简单易操作，且原料来源广泛、成本低，且通过反相高效液相色谱结合NBT特异性染色进行DOPA的定量分析，在液相条件下直接检测贻贝足腺黏附蛋白的DOPA含量，不仅操作简便快速，更有助于提高贻贝黏附蛋白提取过程中的命中率和回收率，制得的贻贝足腺黏附蛋白可用于生物粘合剂的制备。

附图说明

图1为实施例1中采用反相高效液相色谱分离厚壳贻贝足腺黏附蛋白，使用紫外检测器在280nm波长下进行在线检测的色谱图；

图2为实施例2中利用96孔板结合酶标仪对厚壳贻贝足腺粘附蛋白进行DOPA含量的检测图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

使用醋酸-尿素抽提系统结合还原剂快速提取贻贝足腺粗黏附蛋白

1)厚壳贻贝足部的获取及匀浆：取壳长为12-15厘米的成年厚壳贻贝，于海水中饲养24小时，饲养温度为10℃，以手术刀切取其足部，以去离子水冲洗后，至于-80℃冰箱中预冷30分钟后取出，在冰上以手术刀刮除色素层及部分肌肉层，剩余足腺部分剪碎后在-5℃～0℃温度下加入至含8mol/L尿素的5(wt)％的醋酸溶液中，另加入0.1mmol/L的三羧乙基膦作为还原剂以促进足腺粘蛋白的溶解。将上述切碎的组织混合液进行冰浴匀浆操作，收集匀浆液，置入离心管中，20000g，4℃离心20分钟；

2)丙酮沉淀蛋白：离心后弃沉淀，收集上清液，按照体积比1∶2比例加入预冷的-82℃～-86℃丙酮，静止30分钟，以沉淀总蛋白，之后以20000g，4℃离心20分钟，离心后弃上清，收集沉淀，复溶于5(wt)％醋酸中，即获得厚壳贻贝足腺黏附蛋白粗品，该粗品避光保存于-80℃冰箱中；

3)将上述复溶后的厚壳贻贝足腺黏附蛋白粗品经0.45μm针头过滤器过滤后，上样反相高效液相色谱进行脱盐及粗分，采用C18反相半制备柱(7.8×250mm)，流动相为：A液为含0.1(wt)％三氟乙酸的去离子水，B液为含0.1(wt)％三氟乙酸的乙腈；采用40分钟内10％到50％的B液浓度进行线性梯度洗脱，流速2.5毫升/分钟，以280nm波长的紫外光进行检测，收集洗脱峰，冷冻干燥后备用。

实施例2

蛋白质含量的测定

1)蛋白质定量工作液的配制：

Bradford液的配制：100mL 95％乙醇；200mL 88％磷酸；350mg Serva G蓝，室温保存。

工作液的配制：425mL去离子水；15mL 95％乙醇；30mL 88％磷酸；30mL Bradford液。混合后用滤纸过滤，于4℃避光保存备用。

2)蛋白标准液的配制及标准曲线的绘制

精确称取牛血清白蛋白，溶于去离子水中，配制成1.000mg/mL蛋白标准溶液，精确吸取牛血清白蛋白标准溶液0、2、4、8、16、20μL，分别加入至已预冷的96孔板的孔内(如表2所示，编号为1～6)；各孔对应分别加入去离子水补至20μL；最后各孔均加入蛋白质定量工作液180μL，震荡30秒后用酶标仪在630nm处读取相应的吸光值；以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，630nm光吸收值为纵坐标，即可绘制出Bradford染色测定蛋白质含量的标准曲线。

3)取足丝蛋白样品20μL，加至编号为7的加样孔内。震荡30秒后用酶标仪在630nm处读取相应的吸光值，通过与标准曲线对照，即可计算出样品中蛋白质的含量。

表1：采用考马氏亮蓝染色法检测足丝蛋白的蛋白质含量

通过本实施例子方法，可以对贻贝足腺黏附蛋白粗品经反相高效液相色谱分离的洗脱峰进行蛋白质含量测定。

实施例3

利用NBT染色法对厚壳贻贝足腺多酚黏附蛋白的DOPA含量进行快速检测

1)NBT/Glycinate溶液的配制：

NBT溶液，浓度0.24mM；甘氨酸钾溶液，浓度为2M；两者混合后，调PH值为10；

2)左旋多巴(L-DOPA)标准溶液的配制：

在万分之一天平上精密称取左旋多巴10mg，加入去离子水(经煮沸除气)中溶解并于10mL容量瓶中定容，摇匀后以0.22μm微孔滤膜过滤，即得1mg/mL左旋多巴标准溶液。该溶液需新鲜配制且应避光保存。

3)NBT染色后的左旋多巴标准浓度曲线的绘制：

精确吸取左旋多巴溶液0、1、2、4、8、10、20μL，分别加入至已预冷的96孔板的孔内(如表1所示，编号为1～7)；各孔对应分别加入去离子水(煮沸去除氧气)补至20μL；最后各孔均加入NBT/Glycinate溶液180μL。25℃，避光静置1小时后用酶标仪在492nm处读取相应的吸光值；以左旋多巴溶液浓度为横坐标，630nm光吸收值为纵坐标，即可绘制出NBT染色测定多巴含量的标准曲线。

4)取足丝蛋白样品20μL，加至编号为8的加样孔内。25℃，避光静置1小时后用酶标仪在492nm处读取相应的吸光值。通过与标准曲线对照，即可计算出样品蛋白中的DOPA浓度。

表2：利用NBT染色检测足丝黏附蛋白DOPA含量的加样表

通过本实施例子方法，可以计算出蛋白样品中的DOPA含量，再与蛋白质定量的数据进行比较，从而计算出黏附蛋白中DOPA的比例；从而可以根据DOPA的含量大小进行筛选，收集含量高的洗脱峰。

Claims (6)

1.一种贻贝足腺黏附蛋白的提取方法，其特征在于采用醋酸-尿素抽提系统结合还原剂进行提取，包括以下步骤：

1)取厚壳贻贝足部清洗除去色素层，剪碎在-5℃～0℃温度下加入含7～9mol/L尿素的4～6(wt)％的醋酸溶液中，另加入0.05～0.15mmol/L的三羧乙基膦作为还原剂；

2)将上述组织混合液进行冰浴匀浆；

3)把匀浆液离心处理，取上清液；

4)把得到的上清液按体积比1∶2±0.2加入预冷的-82℃～-86℃丙酮，静止20～40分钟，经离心弃上清，收集沉淀，溶于4～6(wt)％的醋酸溶液中，即获得贻贝足腺黏附蛋白粗品；

5)最后将上述复溶后的厚壳贻贝足腺黏附蛋白粗品经0.4～0.5μm膜过滤，上样反相高效液相色谱进行脱盐及粗分，收集洗脱峰，冷冻干燥即可。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤5中上样反相高效液相色谱具体为：采用C18反相半制备柱，流动相为：A液为含0.09-0.11(wt)％三氟乙酸的去离子水，B液为含0.09-0.11(wt)％三氟乙酸的乙腈；采用40分钟内10％到50％的B液浓度进行线性梯度洗脱，流速2.0～3.0毫升/分钟。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述尿素的浓度为8mol/L，所述醋酸溶液的浓度为5％，所述三羧乙基膦的浓度为0.1mmol/L。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述膜为0.45μm。

5.一种贻贝足腺黏附蛋白的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将贻贝足腺黏附蛋白粗品经反相高效液相色谱分离的洗脱峰进行蛋白质含量测定；

2)对洗脱峰进行DOPA含量测定：利用NBT染色剂对DOPA的特异性染色，通过与标准浓度的L-DOPA与NBT染色后的492nm光吸收值进行比较，从而计算出蛋白样品中的DOPA含量，再与蛋白质定量的数据进行比较，从而计算出黏附蛋白中DOPA的比例；

3)根据DOPA的含量大小进行筛选，收集含量高的洗脱峰。

6.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于所述蛋白质含量测定是采用Bradford染色法进行，具体为：以牛血清白蛋白作为标准蛋白，事先配置标准浓度的牛血清白蛋白，加入Bradford染色液后在酶标仪上测定630nm波长的光吸收值，绘制标准曲线，之后再检测样品蛋白与Bradford染色反应后的630nm波长的光吸收值，通过与标准曲线对照从而计算蛋白质含量。

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