CN107281538B - 一种胃修复用贻贝来源生物粘合剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胃修复用贻贝来源生物粘合剂及其制备方法。本发明技术取材于盛产于我国东南沿海的厚壳贻贝或翡翠贻贝，并首创性地将厚度不超过4mm的闭壳肌及其韧带与壳作为提取的对象，提取得到生物粘合剂。本发明的技术平均可以从每30只贻贝中提取出1.06g粗提粘合剂，以及0.42g水溶性粘合剂；整个制备过程仅需要少量的尿素溶液，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。用本发明方法制备的贻贝生物粘合剂，具有产量高、成本低廉、生物相容性好、粘附效果好等特点，还具有较佳的防水功能，具有广阔的市场前景。

Description

一种胃修复用贻贝来源生物粘合剂及其制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种胃修复用贻贝来源生物粘合剂及其制备方法。

背景技术

海洋贻贝属于软体动物门瓣腮纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝粘胶的主要成分足丝粘附蛋白(Mussel foot proteins，mefp)具有高强度、高韧性和防水性。已有文献报道具有黏附功能的蛋白主要包括mefp-3和mefp-5。

近几十年，对仿赔贝蛋白粘合剂的研究工作越来越多，并且持续受到了关注，其无细胞毒性，无免疫原性，具有粘接多样性，因此在医用方面具有十分广阔的前景。目前已有美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织黏附剂，该商品已商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAKTM，CELL AND TISSUEADHESIVE，Catalog NO.354240，Catalog NO.354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强与样品的黏附。将此产品涂敷于接触面后，可承受1.5Mpa的压强。然而由于紫贻贝分泌的黏附蛋白含量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到1mg黏附蛋白，所以由此获得的黏附蛋白产品CELL-TALK^TM价格十分昂贵，1mg高达90美元(Practical recombinant hybrid mussel bioadhesive fp-151，Biomaterials.2007)。因此由于贻贝黏附蛋白的提取工作工艺复杂、成本较高且产率较低，从而限制了它的应用。

目前有很多科研团队和专家在模拟及制备贻贝粘附蛋白方面做了很多的研究工作。这些工作主要包括使用DNA基因重组技术来制造粘附蛋白以及合成高分子的仿生。粘着蛋白原在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂的糖基化修饰、羟基化修饰及交联反应，而利用基因工程途径所得到的粘着蛋白产物则缺少这种严格而充分的修饰和加工过程。尽管学者们在体外对其进行了部分糖基化修饰，但所添加的寡糖链的数量、羟基化以及交联程度与天然蛋白质相比均相差甚远，致使所得蛋白产物的粘度远远不及天然蛋白，因此无法获取理想粘度的粘着蛋白产品。而基于贻贝仿生设计制备的高分子材料(如聚多巴胺粘合剂)，它的生物相容性、安全性亟待改善。而根据文献报道，这种合成性聚多巴胺粘合剂最多能够承受20kpa的压强(Mussel-inspired hyperbranched poly(amino ester)polymer asstrong wet tissue adhesive,Biomaterials.2014)。

所以获得价格低廉，良好生物相容性，同时具有强大黏附性能的天然贻贝来源的生物粘合剂具有重大意义。

现今用于脏器修复(胃，肝脏)的粘合材料种类多样，以合成性材料为主。这些合成性材料主要包括：聚乳酸纳米薄片(Free-Standing Biodegradable Poly(lactic acid)Nanosheet for Sealing Operations in Surgery Adv.Mater.2009),聚乙交酯及其共聚物合成的粘附性材料(Mussel-inspired nanofibrous sheet for suture-less stomachincision surgery，Chem.Commun.2015)。这些材料能够承受小于500kpa的压强，然而这些合成型材料的制作过程复杂，此外某些化学成分还会对机体产生毒副作用，影响修复效果。举例来说，胃作为消化器官，周围是潮湿的环境，胃的表面也会有各种成分的粘液，此外，机体还会分泌胃酸和各种消化酶，所以用于胃修复的粘合材料除了需要具有良好的生物相容性，强大的粘附能力，还需要具有较佳的防水功能，以及一定抵御胃酸和各种消化酶的能力。

目前来说，从贻贝中提取合成的贻贝黏附蛋白产品CELL-TALK^TM等粘附剂由于价格昂贵，仅使用极少量应用于各种培养板的包被，或精子细胞、T47D人乳腺癌细胞和嗜中性粒细胞的培养，其在器官修复中的使用以及效果尚未见研究报道。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种利用尿素抽提法从原材料来源广泛、价格低廉的贻贝(Mytilus edulis)中提取粘附成份，低成本制备具有良好生物相容性以及强大黏附性能的贻贝来源防水生物粘合剂方法，可用于胃修复的相关产品中。

本发明所采取的技术方案是：

一种生物粘合剂的制备方法，是取贻贝中厚度不超过4mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，加入尿素溶液进行超声提取，取上清液透析后冻干得到。

优选的，贻贝的种类包括厚壳贻贝、翡翠贻贝、紫贻贝。本发明采用我国东南沿海盛产的厚壳贻贝或翡翠贻贝作为原料，取材方便，价格8～10元一只；如果是批量购买，价格更优惠。紫贻贝一般产自国外。

优选的，取贻贝中厚度为1-3mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，加入尿素溶液进行超声提取。

现有技术中通常都是从贻贝的分泌物中提取粘附成分。而本发明首创，采用不超过4mm的闭壳肌及其韧带与壳(保留壳)作为提取的对象，取得了良好的效果。

优选的，加入尿素溶液的浓度为6～8M，在0～4℃下进行超声提取。

优选的，加入尿素溶液的浓度为8M。

优选的，超声提取的时间为14～16小时,功率55-65Khz，强度60％-80％。

优选的，透析时，采用截留分子量大小为3～8KD的透析袋。

优选的，透析时，采用截留分子量大小为5KD的透析袋。

优选的，所述的制备方法包括下列步骤：

1)取活的贻贝，清除脏器，切除大部分闭壳肌，仅留取厚度不超过4mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，用预冷的PBS液洗净；

2)加入预冷的浓度为6～8M的尿素溶液，覆盖组织表面，0～4℃超声提取14～16小时；

3)取上清，选取截留分子量大小为3～8KD的透析袋进行透析4～6天；

4)透析后将液体冻干，即得生物粘合剂粗提品；

5)用去离子水溶解粘合剂粗提品，70～100℃水浴2～4小时；

6)离心取上清液；

7)上清液继续70～100℃水浴1～2小时，离心，获得可溶性成份；

8)冻干得到水溶性生物粘合剂。

优选的，贻贝的种类包括厚壳贻贝、翡翠贻贝、紫贻贝。本发明采用我国东南沿海盛产的厚壳贻贝或翡翠贻贝作为原料，取材方便，价格8～10元一只。紫贻贝一般产自国外。

优选的，步骤1)留取临近粘附面，厚度为1-3mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳。

优选的，步骤2)尿素溶液浓度为8M。

优选的，步骤2)超声时间为14-16小时，功率55-65Khz，强度60％-80％。

优选的，步骤2)和步骤3)中PBS和尿素溶液预冷的温度为0-4℃。考虑到这些粘附蛋白中存在糖蛋白，为了保证蛋白活性，所以整个过程均在0-4℃的环境下进行。

优选的，步骤3)选取截留分子量大小为5KD的透析袋进行透析。

优选的，步骤5)去离子水溶解粘合剂粗提品，其中每g粘合剂粗提品添加30～50ml的去离子水。

优选的，步骤5)和步骤6)中所述的水浴温度为70～90℃。

优选的，步骤6)所述的转速为1500～2000rpm，时间为5～10min。

一种生物粘合剂，是利用上述任一项所述方法制备得到的，包括生物粘合剂粗提品和/或水溶性生物粘合剂。

本发明得到的生物粘合剂粗提品，以及经过精炼以后的水溶性生物粘合剂。其中，生物生物粘合剂粗提品能够承受>200N的拉力，>770kpa的压强。水溶性粘合剂则能够承受170N左右的拉力，350kpa的压强。均优于现有技术得到的贻贝粘附蛋白的效果。

将生物粘合剂粗提品进行精炼水提的目的是考虑到粘附蛋白的有效成分中包含有糖蛋白，但是非糖蛋白的成分的精炼工艺还在摸索中。

上述任一项所述方法制备得到的生物粘合剂在制备治疗胃修复产品中的的应用，所述生物粘合剂包括生物粘合剂粗提品和/或水溶性生物粘合剂。

优选的，所述生物粘合剂粗提品在胃修复应用时，每50mg粗提粘合剂给予80-120ul去离子水溶解(或25mg粗提粘合剂溶于40-60μL水)。

本发明产品由于来自天然提取的贻贝生物中，无毒安全，具有良好的组织亲和性，并且展现出较佳的防水功能，可以很好地克服现有仿生材料的粘合剂产品的缺陷。此外，通过动物实验证实本发明的生物粘合剂具备抵御胃酸和各种消化酶的能力，在胃修复中取得了良好的效果，能够适用于医疗材料领域，具有更广泛的应用前景。

上述任一项所述方法制备得到的生物粘合剂在制备粘合产品中的应用，所述生物粘合剂包括生物粘合剂粗提品和/或水溶性生物粘合剂。

本发明的有益效果是：

本发明技术取材于盛产于我国东南沿海的厚壳贻贝或翡翠贻贝，并首创性地将厚度不超过4mm的闭壳肌及其韧带与壳(保留壳)作为提取的对象，提出得到生物粘合剂。用本发明方法制备的贻贝生物粘合剂，具有产量高、成本低廉、生物相容性好、粘附效果好等特点，还具有较佳的防水功能，具有广阔的市场前景。

本发明的技术平均可以从每30只贻贝中提取出1.06g粗提粘合剂，以及0.42g水溶性粘合剂。整个制备过程仅需要少量的尿素溶液，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。

本发明所制备的生物粘合剂(粗提品)具有防水的性能，在潮湿的环境下粘附在载玻片表面，能够承受>200N的拉力，>770kpa的压强。水提后得到的水溶性粘合剂则能够承受170N左右的拉力，350kpa的压强。而根据文献报道，贻贝足部来源的粘蛋白最多能够承受20kpa的压强(Mussel-inspired hyperbranched poly(amino ester)polymer as strongwet tissue adhesive,Biomaterials.2014)。而美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)足部提取的粘附蛋白(BD CELL-TAKTM，CELL AND TISSUE ADHESIVE)，可承受1.5Mpa的压强(具体信息可见于产品的信息说明)。也即，本发明所获得贻贝来源粘合剂的粘附能力大大优于现有技术中心提到的仿生材料粘合剂，或是贻贝来源提取的贻贝粘附蛋白的粘附能力。

本发明所获得生物粘合剂以及相关产品可用于胃修复中。申请人研究中发现，本发明得到的生物粘合剂具有良好的生物相容性、防水性能以及一定的抵御胃酸和各种消化酶的能力，在大鼠胃损伤模型中，经少量的粗提生物粘合剂覆盖于伤口表面，七天后，损伤的胃表面完全得到修复。所制得的防水粘合剂(粗提粘合剂)在临床使用中可作为一种生物医用材料，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为贻贝来源生物粘合剂实物图；

图2为贻贝来源生物粘合剂主要成份分析图；

图3为贻贝来源生物粘合剂在载玻片衔接面粘附生物力学图；

图4为不同浓度贻贝来源生物粘合剂粗提物在载玻片衔接面粘附生物力学图；

图5为贻贝来源生物粘合剂修复胃损伤后的效果示意图；

图6为贻贝来源生物粘合剂修复胃组织后HE染色结果图；

图7为贻贝来源生物粘合剂修复胃组织后Masson染色结果图。

具体实施方式

本发明的原材料选自盛产于我国东南沿海的厚壳贻贝或翡翠贻贝，价格约为8～10元一只，大量购买价格更优。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1)取活的贻贝，清除脏器，切除大部分闭壳肌，仅留取厚度为1-3mm的与贝壳内表面紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，用预冷的PBS液洗净(4℃)；

2)加入8M尿素溶液(4℃)，覆盖组织表面，4℃超声抽提16小时；

3)取上清，选取截留分子量大小为5KD透析袋进行透析6天；

4)透析后液体冻干，即得生物粘合剂粗提品。

结果如图1所示。临近粘附面的瑶柱组织经过8M尿素溶液过夜处理后，脱离壳的表面，粘性成份保存在尿素溶液中。经过透析、冻干处理后，所得到的冻干粉末即为生物粘合剂(粗提品)。

图1为贻贝来源生物粘合剂(粗提品)实物图。A为实施例1中8M尿素溶液过夜处理后临近粘附面的瑶柱组织脱离了壳的表面。B为经过实施例1中透析、冻干处理后提取的粘性材料(粗提品)大体观。

实施例2

1)取活的紫贻贝，切除大部分瑶柱组织，仅留取小块临近粘附面，2mm的与贝壳内表面紧密黏附的闭壳肌及其韧带和壳，用冷的PBS液洗净(4℃)；

2)加入6M尿素溶液(4℃)，覆盖组织表面即可，4℃超声抽提14小时；

3)取上清，选取截留分子量大小为5KD透析袋进行透析5天；

4)透析后液体冻干，即得粘合剂粗提品；

5)用去离子水溶解粘合剂粗提品，其中每g粘合剂粗提品添加50ml的去离子水进行溶解，80℃水浴2小时；

6)1500rpm离心15min，取上清；

7)上清继续80℃水浴1小时，离心，获得可溶性成份；

8)冻干得到水溶性生物粘合剂。

经过计算，本技术平均可以从每30只贻贝中提取出1.06g粗提粘合剂，和/或0.42g水溶性粘合剂。整个制备过程仅需要少量的尿素溶液，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。

实施例3

1)取活的贻贝，切除大部分瑶柱组织(闭壳肌)，仅留取小块临近粘附面，1mm的闭壳肌及其韧带与壳，用冷的PBS液洗净(4℃)；

2)加入7M尿素溶液(4℃)，覆盖组织表面即可，4℃超声抽提15小时；

3)取上清，6-8KD透析袋中透析4天；

4)透析后液体冻干，即得粘合剂粗提品；

5)用去离子水溶解粘合剂粗提品，其中每g粘合剂粗提品添加30ml的去离子水；80℃水浴2小时；

6)2000rpm离心10min，取上清；

7)上清继续80℃水浴1小时，离心，获得可溶性成份；

8)冻干得到水溶性生物粘合剂。

实施例4

1)取活的贻贝，切除大部分瑶柱组织，仅留取小块临近粘附面，1.5mm的与贝壳内表面紧密黏附的闭壳肌及其韧带和壳，用冷的PBS液洗净(4℃)；

2)加入8M尿素溶液(4℃)，覆盖组织表面即可，4℃超声抽提15小时；

3)取上清，7KD透析袋中透析5天；

4)透析后液体冻干，即得粘合剂粗提品；

5)用去离子水溶解粘合剂粗提品，其中每g粘合剂粗提品添加40ml的去离子水；80℃水浴2小时；

6)2000rpm离心10min，取上清；

7)上清继续水浴1小时，离心，获得可溶性成份；

8)冻干得到水溶性生物粘合剂。

下面对实施例所获得贻贝来源生物粘合剂(包括粘合剂粗提品和水溶性生物粘合剂)进行分析。

一、贻贝来源生物粘合剂质谱分析

1)吸取已制备好的粗提样品(实施例1，约30μg)，加入30μL STD buffer，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μL UA buffer(8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.5)混匀，转入30kDa超滤管离心。加入200μL UA buffer离心，弃滤液。加入100μL IAA(50mM IAA in UA)，振荡1min，避光室温孵育30min，离心。加入100μL UA buffer，离心，重复2次。加入100μL25mM NH₄HCO₃，离心，重复2次。加入40μL 25mM NH₄HCO₃同时加入Trypsin，酶切过夜后离心。再加入40μL 25nM NH₄HCO₃，离心，酸化。

2)分别配置A液和B液。A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱。色谱梯度:0---50min，B液线性梯度从4％到50％；50min---54min，B液线性梯度从50％到100％；54min----60min，B液维持在100％。

3)质谱数据采集:多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan)。

4)数据分析：质谱测试原始文件(raw file)用Mascot2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

实验结果如图2所示。图2表示的是粗提成份的基峰图(图2A)以及二级质谱图(图2B)。通过chemcalc软件，基于二级质谱图所显示的每个峰值，最终筛出100种可能的目标分子式，以及糖基化相关的关键酶，糖蛋白的进一步提纯还在摸索过程中。

二、贻贝来源生物粘合剂生物力学拉伸

称取实施例2的样品，包括25mg的粘合剂粗提品和25mg的水溶性生物粘合剂，分别溶于50ul去离子水中(潮湿环境下实验)，生物粘合剂在常温下加入本发明限定的水量，可以获得口香糖状粘合剂，混匀后均匀涂抹于两块载玻片的接触界面(接触面宽2cm，长2.5cm)，按压两块玻片的接触面，处理半小时后，通过Electro Force试验机(～220N)来检测粘合剂的拉伸性能。仪器拉伸速率为0.02mm/s，测试三次。处理数据后作应力-应变曲线。

实验结果如图3所示。图3A为经过上述步骤后，两块玻片的接触面紧密地粘附在一起。图3B为经过实施例3中的生物力学实验后，所绘制的应力-应变曲线，其中B图左侧为粗提粘合剂的生物力学拉伸图，右侧为水溶性粘合剂的生物力学拉伸图，其中形变，即两玻片受力后的接触长度改变与原来接触长度的比值；压强，即两玻片单位接触面积上的受力大小。

由图3可知，将粘性成份均匀涂抹于两块载玻片接触面后，接触面紧密地粘附在一起。通过粗提粘合剂和水溶性粘合剂应力-应变曲线可以看出，接触面分别能承受770kpa(>200N的拉力)和350kpa(170N左右的拉力)的压强，说明所提取的粘性成份具有很强的粘附能力。此外，这两种粘合剂冻干粉均在潮湿的环境下黏附载玻片接触面的，可见其有一定的防水性。而根据文献报道，合成性聚多巴胺粘合剂最多能够承受20kpa的压强(Mussel-inspired hyperbranched poly(amino ester)polymer as strong wet tissueadhesive,Biomaterials.2014)。而美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)足部提取的粘附蛋白(BD CELL-TAKTM，CELL AND TISSUE ADHESIVE)，可承受1.5Mpa的压强(具体信息可见于产品的信息说明)。通过对比发现，本发明技术所获得粘性材料效果更佳。

为了研究粘合剂使用时所需添加的最佳水量，称取一定量的粗提品(25mg)，分别溶于25μL,50μL,100μL去离子水中，混匀后均匀，涂抹于两块载玻片的接触界面(接触面宽2cm，长2.5cm)，按压两块玻片的接触面，处理半小时后，通过Electro Force试验机(～220N)来检测粘合剂的拉伸性能。仪器拉伸速率为0.02mm/s，测试三次。处理数据后作应力-应变曲线，见图4。

图4表明：以50μL水溶解粘合剂后所制样品相比于25μL水溶解所得样品来说，其能够承受的力要大。虽然100μL水溶解粘合剂后，其样品能承受更大的力，但是之后出现了玻片滑脱现象。因此以25mg粘合剂溶于50μL水后所得的样品具有较好的粘附性能。

三、贻贝来源生物粘合剂修复大鼠胃损伤模型

为了在体内检测粘合剂对组织脏器缺口的修复作用，我们构建了大鼠胃损伤模型。从南方医科大学动物中心购买10只SD大鼠，雄性，180～220g。构建胃损伤模型前予禁水4小时，禁食12小时术前处理。手术台以及手术器械消毒备用。

材料准备：滤纸高温消毒，烤干。滤纸上均匀涂抹粗提的贻贝来源粘合剂(50mg粗提粘合剂予100ul去离子水溶解，这里所选的粘合剂稀释比例是综合生物力学和前期动物预实验结果得到的，这种浓度对胃损伤切口的修复作用较好，粘合力增强，且未产生毒副作用；其效果优于单纯的利用粘合剂粗提品的粉末直接涂敷到胃伤口中的效果；此外，粘合剂以所述比例水稀释后，性状发生变化，会变成强粘合性的口香糖状物质)。稀释比例实验见图4结果。

10％水合氯醛常规麻醉大鼠，将麻醉后大鼠置于手术台，在腹部沿腹中线切口，暴露腹腔，在胃前壁作一长1cm的切口，将涂有粘合剂的滤纸(1×0.5cm)贴附于胃切口表面，为固定滤纸，采用7-0尼龙线将滤纸固定在胃黏膜表面，将胃组织放入腹腔，关闭腹腔，术后禁水四小时，禁食一天。观察七天。所有动物实验程序获得南方医科大学动物伦理委员会的许可，并在严格遵循《中国实验动物管理条例》的情况下进行。

图5为贻贝来源生物粘合剂修复大鼠胃损伤图。图5A为经过上述步骤后，粘合剂移植到胃损伤表面的大体图。图5B为经过上述步骤后，粘合剂材料治疗胃伤7天后修复的胃组织表面大体图。

由图5可知，胃部伤口经过粘性材料处理后7天，可见胃损伤表面光滑，未见明显伤口扩大，出血和感染等现象，伤口恢复较好，修复后的组织和周围未组织并没有明显差异。表明本发明所提取的这种材料有明显的粘附伤口，促进损伤脏器修复的功能。

本发明产品由于来自天然提取的贻贝生物中，无毒安全，具有良好的组织亲和性，并且展现出较佳的防水功能，可以很好地克服现有仿生材料的粘合剂产品的缺陷。此外，通过动物实验证实本发明的生物粘合剂具备一定抵御胃酸和各种消化酶的能力，在胃修复中取得了良好的效果，能够适用于医疗材料领域，具有更广泛的应用前景。

四、修复后胃组织HE染色

为了检测粘合剂修复胃组织的成效，我们采用HE染色检测胃组织各层的修复状况。10％水合氯醛常规麻醉大鼠，将麻醉后大鼠置于手术台，在腹部沿腹中线切口，暴露腹腔，找出胃组织，取出胃前壁损伤修复后的胃组织，PBS清洗后予4％多聚甲醛固定组织4小时，30％蔗糖脱水后，将组织放于冷冻台上，滴上包埋剂。将包埋好的组织夹紧于切片机持承器上，修平组织。调好欲切的厚度(6～8um)。切片。

切片在37度烤箱烘4小时后予HE染色。切片分别按照以下程序进行处理：70％酒精(3s)，80％酒精(3s)，90％酒精(3s)，95％酒精(3s)，100％酒精(3s)，100％酒精(3s)，二甲苯(3s)，二甲苯(3s)，苏木素染色(5min)，流水冲洗(10min)，伊红染色(5s)，流水冲洗(5min)，中性树胶封片，采集图片。

实验结果如图6所示，其中图6B为图6A的局部放大图。HE结果表明胃组织三层(浆膜层，肌层，粘膜层)经粘合材料治疗后修复较好。

五、修复后胃组织Masson染色

为了检测修复胃组织是否出现瘢痕修复，我们采用Masson染色检测胶原纤维增殖状况。10％水合氯醛常规麻醉大鼠，将麻醉后大鼠置于手术台，在腹部沿腹中线切口，暴露腹腔，找出胃组织，取出胃前壁损伤修复后的胃组织，PBS清洗后予4％多聚甲醛固定组织4小时，30％蔗糖脱水后，将组织放于冷冻台上，滴上包埋剂。将包埋好的组织夹紧于切片机持承器上，修平组织。调好欲切的厚度(6～8um)。切片。

切片在37℃烤箱烘4小时后予Masson染色。步骤如下：

1)滴加一滴(50-100ul)苏木素染液染色5-10min。蒸馏水冲掉染液；

2)蒸馏水或自来水冲洗2-5min；

3)滴加一滴(50-100ul)复合染色液染色5min；

4)蒸馏水冲洗2-3s；

5)滴加一滴(50-100ul)磷钼酸染色1min；

6)甩干；

7)滴加一滴(50-100ul)亮绿染色液染色5min左右；

8)蒸馏水冲洗2-3s；

9)晾干，中性树胶封片，采集相片。

实验结果如图7所示，其中图7B为图7A的局部放大图。Masson染色结果表明胃组织经粘合材料治疗后修复较好，未见较厚的胶原纤维组织增生，无瘢痕修复过程。

六：价格对比

根据计算本发明的技术平均可以从每30只贻贝中提取出1.06g粗提粘合剂，以及0.42g水溶性粘合剂。贻贝的价格约为8～10元一只。整个制备过程仅需要少量的尿素溶液，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。

而美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)的足部提取到粘附蛋白，名称和货号分别为BD CELL-TAKTM CELL AND TISSUE ADHESIVE，Catalog NO.354240，Catalog NO.354241。该产品从大约10000个贻贝中也仅能提取到1mg黏附蛋白，所以由此获得的黏附蛋白产品CELL-TALKTM价格十分昂贵，1mg高达90美元。

通过对比，可以发现本发明所获得黏附蛋白的技术，操作简单，价格低廉，所获产品性价比高，具有良好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物粘合剂的制备方法，其特征在于：取贻贝中厚度不超过4mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，加入尿素溶液进行超声提取，取上清液透析后冻干得到。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：贻贝的种类包括厚壳贻贝、翡翠贻贝、紫贻贝。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：加入尿素溶液的浓度为6～8M，在0～4℃下进行超声提取。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：超声提取的时间为14～16小时。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：透析时，采用截留分子量大小为3～8KD的透析袋。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

取活的贻贝，清除脏器，切除大部分闭壳肌，留取厚度不超过4mm的与壳紧密粘附的闭壳肌及其韧带和壳，洗净；加入浓度为6～8M的尿素溶液，覆盖组织表面，0～4℃超声提取14～16小时；取上清，选取截留分子量大小为3～8KD的透析袋进行透析4～6天；透析后将液体冻干，即得生物粘合剂粗提品；

用去离子水溶解粘合剂粗提品，70～100℃水浴2～4小时；离心取上清液；上清液继续70～100℃水浴1～2小时，离心，获得可溶性成份；冻干得到水溶性生物粘合剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：水浴温度为70～90℃。

8.一种生物粘合剂，其特征在于：是利用权利要求1-7任一项所述方法制备得到的。

9.权利要求1-7任一项所述方法制备得到的生物粘合剂在制备治疗胃修复产品中的的应用，其特征在于：所述生物粘合剂包括生物粘合剂粗提品和/或水溶性生物粘合剂。

10.权利要求1-7任一项所述方法制备得到的生物粘合剂在制备粘合产品中的应用，其特征在于：所述生物粘合剂包括生物粘合剂粗提品和/或水溶性生物粘合剂。