KR100872847B1 - 홍합 바이오접착제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 홍합유래 바이오-접착제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 본 신규한 MGFP-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) 단백질 및 MGFP-5과 FP(Foot Protein)-1간의 조합형 단백질에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 접착 활성을 가지는 접착 단백질을 경제적이면서도 대량으로 생산하여 화학 접착제 대용으로 사용할 수 있다.

Description

홍합 바이오접착제{MUSSEL BIOADHESIVE}
(a) FIELD OF THE INVENTION
본 발명은 홍합유래 바이오-접착제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 MGFP-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) 단백질 및 MGFP-5과 FP(Foot Protein)-1 간의 조합형 단백질에 관한 것이다.
(b) BACKGROUND OF THE INVENTION
홍합은 특별한 비수용성 접착제를 생산 및 분비하므로, 효과적인 내수성 바이오-접착제에 대한 잠재적 원료로써 연구되어오고 있다. 홍합은 발에서 뻗어나오는 족사를 통하여 수중 표면에 단단히 부착한다. 각 족사의 끝부분에는 내수성 접착제를 포함하고 있어 접착 플라크(plague)는 젖은 고체 표면에 고정할 수 있다(Waite, J. H., Biology Review. 58:209-231(1983). 이러한 강력하고 유연한 내수성 접착제는 바이오테크놀러지 분야에서의 잠재적 이용가능성에 주목을 받고 있다. 홍합 유래 접착 단백질은 또한 인체에 무해하고 면역반응을 일으키지 않아, 의약용도의 접착제로 사용 가능성이 있다(Dove et al., Journal of American Dental Association. 112:879 (1986)). 더욱이 상기 홍합 유래 접착 단백질은 생분해가능하므로 환경친화적인 장점도 갖고 있다.
족사는 근부위와 원부위(distal part)로 구분할 수 있다. 근부위는 홍합 발 의 줄기 샘(stem gland)에 연결되어 있고, 원부위는 접착 플라크에 연결되어 있다. 상기 접착 플라크는 5종의 단백질, 즉 FP(foot protein)-1 내지 FP-5로 이루어져 있다(Deming, T. J., Current Opinion in Chemical Biology. 3:100-105 (1999)).
홍합 접착 단백질 대부분은 타이로신 잔기의 수산화과정에서 유래된 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)을 높은 비율로 포함하고 있으며(Waite, J. H., Biology Review. 58:209-231 (1983)), 부착면에 인접한 접착 단백질에서 DOPA 잔기의 함유율이 가장 높게 확인된다(Waite, J. H., Integr. Comp. Biol. 42:1172-1180 (2002)). 이와는 대조적으로 DOPA 잔기가 결핍된 홍합 접착 단백질 유사체들은 접착성이 현저히 감소되는 것으로 알려져 있다(Yu et al., Journal of American Chemical Society. 121:5825-5826 (1999)). 또한 DOPA 잔기는 산화과정을 거쳐 전환된 도파 퀴논(Dopa o-quinone)을 통하여 접착 단백질들 간의 가교화를 유도하는 것으로 확인된 바 있다. 즉 홍합 접착 단백질의 DOPA 함유율은 접착 특성과 밀접한 관련성이 있다.
현재 홍합으로부터 추출한 접착 단백질 산물인 셀-텍(Cell-Tak)이 상업적으로 시판되고 있다. 상기 접착제는 FP-1 및 FP-2 단백질로 주로 이루어져 있으며 소량의 fp-3이 함유되어 있다. 그러나 이들의 추출과정은 1 mg의 단백질을 추출하는데 10,000 마리의 홍합이 사용되는 노동 집약적이고, 비효율적인 방법이다(Morgan, D., The Scientist. 4:1-6 (1990)).
이에, 대장균이나 효모와 같은 발현 시스템을 통하여 재조합 홍합 단백질 예컨대 FP-1을 생산하기 위한 연구들이 이루어지고 있다. 그러나 홍합 접착 단백질은 매우 편중된 아미노산의 조성을 가지며, 예컨대, FP-1의 경우 총 아미노산에서 89％가 5종의 아미노산으로 이루어져 있다.. 또한 홍합과 그외 발현 시스템간의 코돈 이용(codon usage)의 차이(tRNA 이용 문제점) 및 낮은 단백질 수율과 같은 다수의 문제들로 인하여 기능적이며 경제적인 홍합 접착 단백질 생산이 어려운 실정이다(US patent 5242808, Filpula et al., Biotechnol. Prog. 6:171-177 (1990), Salerno et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58:209-214 (1993), Kitamura et al., Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 37:729-736 (1999)).
SUMMARY OF THE INVENTION
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 홍합로부터 분리한 신규한 접착단백질 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 신규한 홍합 접착 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 홍합 접착단백질을 생물학적 활성을 지닌 상태로 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 2종이상의 홍합 접착 단백질을 융합시킨 조합형 접착 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 신규한 접착 단백질을 유효성분으로 포함하는 접착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(M. galloprovincialis)로부터 추출한 신규한 접착 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 상기 접 착 단백질은 바람직하기로는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열의 일예는 서열번호 5에 기재된 핵산 서열이다.
또한 본 발명은 홍합 접착 단백질의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 FP-1으로부터 유래된 일부 아미노산 서열이 연결된 조합형 접착 단백질 및 상기 조합형 접착 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 조합형 접착 단백질의 일예는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 및 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이다. 상기 조합형 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일예로는, 서열번호 9에 기재된 핵산 서열, 서열번호 11에 기재된 핵산 서열, 서열번호 13에 기재된 핵산 서열, 서열번호 17에 기재된 핵산 서열, 서열번호 19에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 21에 기재된 핵산 서열이 있다.
또한 본 발명은 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현가능하도록 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현가능하도록 포함하는 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 접착 단백질을 코딩하는 유전자를 발현가능하도록 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계 및 (c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 접착 단백질을 생산 하는 단계를 포함하는 접착 단백질의 생산방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 형질전환체를 파쇄한 후 원심분리하여 상층액 및 펠렛을 각각 분리하는 단계; (b) 상기 펠렛에 산성 유기용매를 가한 후 현탁시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 현탁액을 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계를 포함하는 접착 단백질의 정제방법을 제공한다.
또한 본 발명은 접착 단백질을 유효성분으로 포함하는 접착제를 제공한다.
또한 본 발명은 접착제에 산화제, 충진제 및 계면활성제로 이루어진군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 접착 단백질의 농도를 조절하는 것을 포함하는 접착제의 접착력을 조절하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 접착 단백질을 유효성분으로 함유하는 코팅제를 제공한다.
도 1은 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(M. galloprovincialis)로부터 추출한 RNA를 주형으로 MGFP-5 단백질 cDNA 단편을 RT-PCR하여 전기영동한 사진이다.
도 2는 pTrcHis 벡터에 MGFP-5 cDNA를 삽입하여 pMDG05 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 것이다.
도 3은 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 FP-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함) 및 이의 합성에 사용된 4개의 올리고머(KD-1, KD-2, KD-3, 및 KD-4)를 나타낸 것이다.
도 4는 6xAKPSYPPTYK와 MGFP-5유전자를 동시에 발현 시킬 수 있는 다양한 조합의 벡터 구성도이다.
도 5는 재조합 Mgfp-051의 유전자 서열을 생산하기 위한 pMDG051벡터를 제작하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 재조합 MGFP-150을 생산하기 위한 pMDG150벡터 제작 과정을 나타낸 도면이다.
도 7은 재조합 MGFP-151을 생산하기 위한 pMDG151벡터 제작 과정을 나타낸 도면이다.
도 8은 재조합 MGFP-151을 생산하기 위한 pENG151벡터 제작 과정을 나타낸 도면이다.
도 9는 E. coli BL21/pMDG05 및 E. coli BL21/pTrcHis(pTrcHisA로 형질전환한 E. coli BL21/pTrcHisA) 각각의 배양물의 전기영동사진이다.
도 10은 E. coli BL21/pMDG05 배양액으로부터 분리한 세포 펠렛(WC), 용해성 상층 분획(I), 비용해성 세포 부산물(IS) 및 음성대조군(N)의 SDS-PAGE에 대한 웨스턴 블롯 사진이다.
도 11은 실버 염색한 SDS-PAGE 사진으로, E. coli BL21/pMDG05으로부터 MGFP-5 재조합 단백질을 정제하는 친화성 크로마토그래피 단계별 시료를 전기영동한 것이다.
도 12는 정제한 MGFP-5 재조합 단백질의 질량 분석 결과이다.
도 13은는 E. coli BL21/pMDG051 로부터 MGFP-51 재조합 단백질 발현을 분석 한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다.
도 14는 E. coli BL21/pMDG150로부터 MGFP-15 재조합 단백질 발현을 분석한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다.
도 15는 E. coli BL21/pMDG151 로부터 MGFP-151 재조합 단백질 발현을 분석한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다.
도 16은 E. coli BL21/pMDG151 로부터 발현된 MGFP-151 재조합 단백질의 회수율을 아세트산 용액의 농도에 따라 나타낸 것이다.
도 17은 MGFP-151 재조합 단백질의 크로마토그래피를 통하여 수득한 분획들의 SDS-PAGE(A) 및 이의 웨스턴 블롯(b)이다.
도 18은 MGFP-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질의 타이로신 잔기를 DOPA로 수정한 후 이를 슬라이드 글라스, 폴리메틸 메타크릴레이트 판 및 알루미늄 판 위에 코팅한 결과이다.
도 19는 타이로신을 처리한 BSA, Cell-Tak, MGFP-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질의 QCM 분석결과이다.
도 20은 재조합 접착 단백질의 점착성을 측정하는 방법의 개략도이다.
도 21은 타이로신 잔기가 수정된 MGFP-1 재조합 단백질 및 MGFP-5 재조합 단백질의 점착성을 나타내는 것이다.
도 22는 재조합 접착 단백질의 세포 부착성을 측정한 것이다.
도 23은 재조합 접착 단백질의 초파리 S2 세포 부착성을 측정한 것이다.
도 24A 내지 C는 MGFP-5 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질이 코팅된 기질 표면을 나타낸 사진으로, A는 2500X 배율 사진이고, B는 10000x 배율 사진이고, C는 35000X 배율 사진이다.
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
본 발명자들은 홍합의 한 종류인 미틸러스 갈로프로빈시얼리스로부터 신규한 접착 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 획득하였으며, 이로부터 번역되는 접착단백질을 생산하는 시스템을 확립하였다. 또한 2종이상의 홍합 접착 단백질이 융합된 조합형 단백질 및 이의 생산 시스템을 확립하였다.
본 발명의 접착 단백질은 다양한 기질, 예컨대 유리, 금속, 고분자 수지, 플라스틱 또는 생물의 세포막, 예컨대 원핵 생물의 세포막, 진핵생물의 세포막, 식물의 세포벽 및 지질에 부착 특성을 갖는 단백질이다.
본 발명에 따른 접착 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 50 ％, 보다 바람직하게는 80 ％, 보다 더 바람직하게는 90 ％, 가장 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성을 갖으며 동시에 부착성, 예컨대 서열번호 6의 아미노산 서열이 갖는 부착성과 유사하거나 또는 상기에 비하여 70 내지 200％의 부착활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일예로는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 있다. 상기 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 접착 단백질은 이하 MGFP-5(Mytilus galloprovincialis foot Protein-5)로 기재한다.
MGFP-5를 코딩하는 유전자는 아미노산에 대한 코돈 사용(conod usage)에 따라 다수 개의 핵산 서열로 표시될 수 있으며, 일예로는 서열번호 5에 기재된 핵산 서열 및 서열 번호 15에 기재된 핵산 서열이 있다.
또한 본 발명의 접착 단백질은 접착 단백질의 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드를 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 더욱 포함할 수 있다. 상기한 펩타이드는 예컨대 용해도, 접착력, 가교도, 단백질의 발현, 정제 및 회수율 증강 등을 목적으로 할 수 있으며, 일예로, 상기 펩타이드는 정제 증강을 위한 목적으로, 통상의 리포터 단백질, 예컨대 GST 또는 히스티딘 태그를 사용할 수 있다. 접착 단백질의 정제를 위한 목적으로 펩타이드가 더욱 포함된 형태의 예로는 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 있다.
바람직한 상기 펩타이드는 접착 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하며, 더욱 바람직하기로는 홍합 접착 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 펩타이드는 서열번호 25의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속 연결된 형태일 수 있다. 본원발명의 일실시예에서는 서열번호 25의 아미노산 서열이 6회 연속된 서열번호 8를 제작하여, 본원발명의 접착 단백질의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 연결시켰다. 상기 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열은 FP-1 단백질 서열의 일부분이다.
상기 서열번호 25의 서열이 더욱 연결된 조합형 접착 단백질의 일예로는, 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열이 있다. 상기 서열번호 10은 서열번호 6의 아미노산 서열의 아미노 말단에 서열번호 25의 서열이 6회 연속 연결된 형태이다. 상기 서열번호 12는 서열번호 6의 아미노산 서열의 카르복시 말단에 서열번호 25의 서열이 6 회 연속 연결된 형태이다. 상기 서열번호 14는 서열번호 6의 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단 각각에 서열번호 25의 서열이 6회 연속 연결된 형태이다.
또한 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 조합형 접착 단백질은, 정제를 용이하게 하기 위한 목적의 펩타이드를 더욱 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 조합형 접착 단백질의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 위치될 수 있으며, 펩타이드의 예로는 GST 또는 히스티딘 태그가 있다. 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 조합형 접착 단백질은 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 각각의 아미노 말단에 히스티딘 태그가 포함된 형태이다.
또한 본 발명의 조합형 접착 단백질은, 접착 단백질 클로닝시 부가적으로 삽입되는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 이종의 단백질 연결 부위에 더욱 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 접착 단백질 및 조합형 접착 단백질은 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.
벡터내 삽입되는 접착 단백질을 코딩하는 서열은, 본 발명에 따른 접착 단백질 또는 조합형 접착 단백질을 코딩하는 서열이며, 바람직하기로는 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 50％, 보다 바람직하게는 80％, 보다 더 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 50％ 이상, 보다 바람직하게는 80％, 보다 더 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 5 ' 말단 및/또는 3' 말단에 서열번호 26 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 서열이 1 내지 10회 연속 연결된 서열, 및 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 아미노산 서열의 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기가 더욱 포함된 단백질을 코딩하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하기로는, 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 벡터내 삽입시킬 수 있다.
본 발명에서는, 일실시예로 MGFP-5 서열을 pGEM-T 벡터에 클로닝하고, 서열번호 7의 서열(서열번호 25의 아미노산 서열이 6회 반복된 6xAKPSYPPTYK은 pUC18에 클로닝 하였다. 이후 MGFP-5 서열은 pTrcHisA 벡터에 클로닝하여 pMDG05 벡터(도 4)를 제작하였다. 또한 하기 표 1의 구성을 갖는 조합형 단백질을 발현하는 벡터 제조를 위하여, MGFP-5 서열 및 서열번호 7의 서열을 pTrcHisA 벡터에 클로닝하여 pMDG150, pMDG051및 pMDG151 벡터를 각각 제작하였다(도 7 내지 9).
(표 1)
Figure 112006067946215-pct00001
상기 pTrcHisA 벡터는 trc 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 이용하여 외부 단백질 발현을 유도할 수 있으며, 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 단백질 분리정제를 위한 6개의 히스티딘 서열이 외부 유전자 서열 5 ' 위치에 존재하여 재조합 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있도록 한 공지의 벡터이다. 본 발명에서는 pMDG05 벡터를 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 2002년 6월 20일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10291BP를 받았으며, pENG151 벡터는 동일 기탁기관에 2005년 1월 19일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10766BP를 부여 받았다.
접착 단백질 및 조합형 접착 단백질 발현용 벡터는 원핵생물, 진핵생물 및 진핵생물 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조할 수 있다. 상기 원핵생물은 E. coli 및 Bacillus로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 진핵생물은 효모, 곤충, 동물 및 식물이며, 상기 진핵생물 유래 세포는 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포이나, 이에 한정되는 것은 아니 다.
일실시예로, E. coli BL21에 pMEG05, pMDG150, pMDG051 및 pMDG151 벡터 각각을 형질전환하여, E. coli BL21/pMDG05, E. coli BL21/pMDG150, E. coli BL21/pMDG051 및 E. coli BL21/pMDG151을 제조하였다. 상기 4종의 형질전환체는 통상의 LB 배지에서 배양할 수 있으며, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 첨가할 수 있다. 바람직한 재조합 단백질의 발현방법은 LB(5 g/liter yeast extract, 10 g/liter Tryptone, 10 g/liter NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6 내지 0.9 일 때 IPTG를 0.1 내지 10 mM 첨가하여 2시간 내지 7시간 배양하는 것이다.
상기의 방법으로 발현시킨 재조합 단백질은 형질전환체의 수용성 형태 및/또는 비수용성 형태로 발현되므로, 발현 양상에 따라 각각 분리 및 정제한다. 수용성 형태로 발현되는 경우, 세포 파쇄물의 상층액을 친화성 수지, 예컨대 니켈 레진이 충진된 컬럼으로 크로마토그래피를 실시하여 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 비수용성 형태로 발현되는 경우 세포 파쇄물의 세포 부산물(펠렛)을 산성 유기용매, 바람직하기로는 PH 3 내지 6을 갖는 유기용매에 현탁시켜 현탁액을 제조한 후, 상기 현탁액을 원심분리하여 상층액을 분리하여 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 상기 산성 유기용매의 예로는 아세트산, 구연산 및 젖산이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 아세트산의 경우, 5 내지 30 (v/v)％의 아세트산을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 20 내지 30 (v/v)％의 아세트산 용액에 세포 부산물(펠렛)을 용해시킨다. 산성 유기용매 처리로 수득한 상층액은 또한 젤 여과 크로마코그래피 를 실시하여 재조합 단백질을 더욱 정제할 수 있다.
본 발명의 방법으로 재조합 접착 단백질 MGFP-5는 95％ 이상의 순도로 2-3 mg/L를 수득할 수 있으며, MGFP-151은 95％ 이상의 순도로 약 5 mg/L를 수득할 수 있다. MGFP-5와 MGFP-151은 거의 유사한 수준의 접착력을 나타내지만, MGFP-5에 비하여 MGFP-151의 용해도가 현저히 높아져 농축성이 우수한 장점이 있다. 특히 MGFP-5는 5 ％ 아세트산 용액에 약 1 mg/mL로 용해되지만, MGFP-151은 물에서는 약 110 mg/mL로 5 ％ 아세트산 용액에서는 약 220 mg/mL로 용해된다. 접착 단백질의 용해도는 고농도로 농축 가능성과 직결되는 것이므로, 용해도가 높을수록 고농도로 쉽게 농축할 수 있어 산업적 이용가능성이 향상된다. 즉 이러한 관점에서 접착 단백질 MGFP-151은 MGFP-5에 비하여 효용성이 높다 할 수 있다.
본 발명의 접착 단백질 및 이를 발현시켜 수득한 재조합 접착 단백질은 부착활성을 가져 접착제 용도로 사용할 수 있다. 접착활성은 단백질의 타이로신 잔기의 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로의 수정 실험에 의하여 확인한 것이다. 따라서, 본 발명의 접착 단백질은, 다양한 기질에 대한 접착제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 인체에 무해하여 생체용 접착제로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 접착 단백질을 유효성분으로 포함하는 접착제를 제공한다. 상기 접착 단백질은 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총 수의 5 내지 100 ％가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 수정된 형태일 수 있으며, 또한 상기 접착제는 접착 단백질내 타이로신 잔기를 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 수정시킬 수 있는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 물질의 대표적인 예는 티로시나제 (tyrosinase)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 접착제는 통상의 바이오 접착제에 함유되거나 또는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 0.5 내지 90 중량％로 더욱 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 계면활성제, 산화제 및 충진제(filler)가 있으나, 이에 한정되진 않는다(참조: 미국 공개특허공보 제 2003-65060호 및 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 계면활성제는 양이온성, 음이온성, 비이온성, 양쪽성 계면활성제일 수 있으며, 그 예로는 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate) 및 소듐 도데실벤젠설포네이트(sodium dodecylbenzensulfonate)가 있다. 상기 산화제는 티로시나제, 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase), 글루타알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드, 비스(설포숙시니미딜) 수베레이트(bis(sulfosuccinimidyl) suberate), 3,3' -디티오비스(설포숙시니미딜프로피오네이트)(3,3' -Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), O2, Fe3+, H2O2 및 IO4 -로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며(참조: Macromlecules 1998, 31, 4739-4745), 상기 충진제는 콜라겐 히알루론 산, 콘드로이탄 설페이트(condroitan sulfate), 엘라스틴, 라미닌, 카세인, 하이드록시아페티트, 알부민, 피브로넥틴 및 하이브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 접착제는, 유리, 플라스틱, 고분자합성수지 또는 생물 시료를 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용할 수 있으며, 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 Cell-Tak 제품(BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, USA)에 준하여 사용할 수 있다. 일예로, 본 발명의 접착제는 용제형, 수용성, 무용제형일 수 있으며, 기질에 대하여 0.01 내지 100 ug/cm2 로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다.
상기 생물 시료는, 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 모두 의미한다. 일예로는, 세포, 조직, 기관, RNA, DNA, 단백질, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 호르몬 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 접착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수(물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자, 의약물, 생리적 또는 대사적 관찰 장치, 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).
또한 본 발명은 접착제에 계면활성제, 산화제 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 접착 단백질의 농도를 조절함으로써 상기 접착제의 접착력을 조절하는 방법을 제공한다(참 조: 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 산화제, 계면활성제 및 충진제는 상기 기술한 바와 동일하다.
본 발명은 또한 상기 접착 단백질을 유효성분으로 함유하는 코팅제를 제공한다. 본 발명의 접착 단백질은 유리, 플라스틱, 고분자합성수지 또는 생물 시료에 접착하는 특성이 있어 상기 기질에 대한 로팅제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 특히 내수성 및 방수성을 가지므로, 수중 환경에 사용되는 기질의 표면에 도포함으로써 기질의 산화를 방지할 수 있다. 코팅제의 적용예로는 선박의 모터 부분의 프로펠라에 도포하여 부식을 방지하는 용도가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 코팅제는 접착 단백질만을 단독으로 포함할 수 있으나, 그외 공지의 접착제, 본 발명의 접착 단백질을 제외한 접착 단백질, 공지의 코팅제에 포함하는 수지, 유기용매, 계면활성제, 부식방지제 또는 색소 등을 더욱 포함할 수 있다. 부가적으로 포함하는 성분의 함량은, 성분의 종류나 코팅제의 제형에 따라 통상적으로 허용되는 범위내에서 적절히 조절할 수 있다. 부가적인 성분이 포함되는 경우, 유효 성분인 접착 단백질은 코팅제내에 접착 활성을 유지할 수 있는 함량으로 포함되며, 예컨대 코팅제에 0.1 내지 80 중량％로 포함될 수 있다.
본 발명의 코팅제는 크림상, 에어졸상(분무형), 고체상, 액상 및 유상으로제조할 수 있으나, 상기한 제형에 한정되지 않는다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하, MGFP-5 유전자를 클로닝하기 위한 홍합은 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(M. galloprovincialis)를 사용하였다.
실시예 1: MGFP-5 유전자의 클로닝
MGFP-5를 클로닝하기 위하여, 서열번호 1의 프라이머(5'-ggcctgcagcagttctgaagaatacaaggg-3)와 서열번호 2의 프라이머(gtagatctatacgccggaccagtgaacag)를 각각 합성하였다. 홍합 cDNA 라이브러리를 주형으로 PCR을 30회 실시하여 243 bp 크기의 PCR 산물을 수득하였다(도 1). 상기 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(프로메가)에 클로닝하였다.
MGFP-5 의 상위 신호 서열을 수득하기 위하여, 홍합(M. galloprovincialis) cDNA 라이브러리를 주형으로 네스티드(nested) PCR을 실시하였다. 프라이머는 cDNA 라이브러리에 사용한 ZAP 벡터의 T3 프로모터 프라이머(서열번호 32) 와 서열번호 3의 프라이머(5'-cttgtattttccgctgttttt-3')을 사용하였다. PCR을 통하여 약 300 bp의 증폭 산물을 수득하여 이를 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다.
MGFP-5의 C 말단의 폴리-A 부위를 클로닝하기 위하여, 서열번호 4(5'-aaaaacagcggaaaatacaag-3') 및 T7 프로모터 프라이머(서열번호 33)을 이용하여 네스티드 PCR을 실시하였다. 350 bP의 증폭산물은 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다.
상기에서 수득한 MGFP-5 cDNA의 염기서열을 분석하여, MGFP-5 유전자의 분비서열(secretion signal sequence)을 제외한 서열은 서열번호 5에, 이로부터 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타내었다.
실시예 2: MGFP-5의 유전학적 생산을 위한 벡터 제조
pGEM-T 벡터에 들어있는 MGFP-5 cDNA를 PstI과 EcoRI 제한효소자리(restriction enzyme site)를 이용하여 분리한 후 PstI과 EcoRI 제한효소로 잘려진 pTrcHisA 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입하여, pMDG05(4630bp)를 제조하였다(도 2). pMDG05는 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원(KCTC)에 2002년 6월 20일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10291BP를 받았다.
pMDG05 벡터는 대장균 발현용 프로모터인 trc 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, 미국)를 이용하여 발현을 유도할 수 있다. 또한 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 단백질 분리정제를 위하여 히스티딘(histidine) 잔기 6개가 MGFP-5 유전자의 5'말단에 위치한다.
실시예 3: FP-1에서 유래된 펩타이드(6xAKPSYPPTYK) 제조
FP-1 (Genbank No.Q27409 or S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 25로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 FP-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하였다.
즉, 도 3에 기재된 KD-1 내지 KD-4를 각각 합성하여 어닐링함으로써, 서열번호7의 FP-1 변이체를 코딩하는 서열번호8의 6 x AKPSYPPTYK를 합성하였다. 상기 6 x AKPSYPPTYK의 5'말단에 추가로 5' 에서 3' 방향으로 EdoRI 및 NheI 제한효소부위를 위치시키고, 3'말단에는 BamHI 제한효소부위를 위치시켰다(도 3). 상기 6xAKPSYPPTYK는 Nhel 및 BamHI 제한효소부위를 이용하여 pUC18 벡터에 삽입하고, pAD501 벡터를 제조하였다(M. Kitamura, 1999, Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 37, 729-736).
도 3에서, 폴리뉴클레오타이드의 BamHI 부위 5' 위치에 존재하는 ACTAT는 ORF를 맞추기 위하여 삽입한 것이다.
실시예 4: FP-1 및 MGFP-5로 이루어진 조합체 제조
이하, MGFP-5는 MGFP-05로 기재하고, MGFP-5의 N-말단에 실시예 3의 6xAKPSYPPTYK이 결합된 조합체는 MGFP-150으로 기재하고, MGFP-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK이 결합된 조합체는 MGFP-051로기재하고, MGFP-5의 N-말단 및 C-말단 모두에 6xAKPSYPPTYK이 결합된 조합체는 MGFP-151로 기재한다(상기 표 1 참조).
서열번호 10의 MGFP-150, 서열번호 12의 MGFP-051 및 서열번호 14의MGFP-151 조합체 각각을 제조하고자 하였으며, 실험 설계상 상기 조합체들은 5' 말단에 히스티딘 태그(6xHis)와 그외 아미노산 잔기들이 포함되며, 6xAKPSYPPTYK 와 MGFP-5와의 사이에 아미노산 잔기들이 포함된다.
MGFP-05, MGFP-150, MGFP-051 및 MGFP-151 조합체를 각각 발현하기 위하여, 서열번호 15, 17, 19 및 21의 구조체를 벡터에 삽입하여 도 4의 pMDG05, pMDG150, pMDG051 및 pMDG151을 각각 제조하였다. 상기 4종의 벡터는 IPTG(isopropylthio-beta-D-galactoside, sigma, US)에 의하여 발현이 유도되는 trc 프로모터하에 발현이 조절되며, 각 조합체의 5' 상위에 히스티딘 잔기가 6개 존재하며, 조합체의 3' 말단에는 번역종결코돈(TAA)이 위치한다.
각 벡터의 제조방법은 다음과 같다.
실시예 2의 pMDG05 벡터내 MGFP-5의 유전자 서열을 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 PCR하고, Pst I과 EcoR I 제한효소를 이용하여 절단한 다음 동일 효소로 절단된 pTrcHisA 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입하여, pTEMP150(4630bp)를 제작하였다. 또한 실시예 2의 pAD501 벡터내 6xAKPSYPPTYK를 서열번호 23(5'-GGT ACC CGA ATT CGA ATT CGC TAA ACC G-3') 및 24(5'-GGT CGA CTC AAG CTT ATC ATT TGT AAG TCG-3')의 프라이머 세트로 증폭시키고, EcoR I과 Hind III 제한효소로 잘라주었다. 그 후 EcoR I과 Hind III 제한효소로 잘려진 pTEMP150에 삽입하여, pMDG051를 제작하였다 (도 5).
pAD501벡터내 6xAKPSYPPTYK를 Nhe I 과 BamH I 제한효소를 처리하여 분리하고, 동일 효소로 처리한 pMDG05벡터에 삽입하여, pMDG150을 제작하였다 (도 6).
pAD501벡터내 6xAKPSYPPTYK를 Nhe I 과 BamH I 제한효소를 처리하여 분리하고, 동일 효소로 처리한 pTrcHis A벡터(Invitrogen, 미국) 에 삽입하여, pTEMP1 (4523bp)을 제작하였다. 그 후, pMDG05벡터내 MGFP-5의 유전자 서열을 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 증폭시키고, 이를 Pst I과 EcoR I 제한효소를 처리한 후 동일 효소가 처리된 pTEMP1에 삽입하여, pTEMP(4741bp)을 제작하였다. 또한 pAD501 벡터내 6xAKPSYPPTYK를 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트로 증폭시킨 후 EcoR I과 Hind III 제한효소로 잘라주었다. 그 후 EcoR I과 Hind III 제한효소로 잘려진 pTEMP2에 삽입하여, pMDG151 (4927bp)을 제작하였다 (도 7).
또한, Mgfp-151의 유전자는 T7 프로모터를 이용하여 대량 발현시키기 위해서 Mgfp-151의 유전자를 pMDG151벡터로부터 서열번호 34의 프라이머(5'- CCT AAC ATA TGG GGG TTC TCA TCA TC - 3' ) 및 서열번호 35의 프라이머 (5' -ATC CGC CAA AAC AGC CAA GCT T - 3' )로 증폭한 후, 증폭 산물은, Nde I과 Hind III 제한효소자리를 이용하여, pET 22b(+)벡터(Novagen, EMB Bioscience, Inc 441 Charmany Dr. Madison, WI 53719 USA)에 삽입함으로써 pENG151벡터를 제조하였다(도 8). 상기 pENG151 벡터는 E.coli에 형질전환하였으며, 2005년 1월 19일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 KCTC10766BP로 기탁하였다.
실시예 5: MGFP-5 및 조합체를 생산하는 형질전환체의 제조
클로닝용 E. coli Top10(F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ801acZ△M15 △ lacX74 deoR recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Strr) endA1 nup, Invitrogen) 및 단백질 발현용으로 사용된 E. coli BL21(F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dc)는 각각 CaCl2 버퍼를 사용하여 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 상기 컴피턴트 세포 각각에 실시예 4의 pMDG05, pMDG051, pMDG150 및 pMDG151 벡터 각각을 열충격(42 에서 2분간 방치)방법에 의해 형질도입하였다. 이후 앰피실린(ampicillin, Sigma)을 이용한 선별과정을 통하여, 각각의 형질전환체, E. coli Top10/pMDG05, E. coli Top10/pMDG051, E. cili Top10/pMDG150, E. coli Top10/pMDG151, E coli BL21/pMDG05, E. coli BL21/pMDG051, E. coli BL21/pMDG150 및 E. coli BL21/pMDG151을 수득하였다.
실시예 6: E. coli BL21/pMDG05로부터 MGFP-5의 발현 및 정제
6-1. E. coli BL21/pMDG05 배양
E. coli BL21/pMDG05는 LB(5 g/liter yeast extract, 10 g/liter Tryptone 및 10 g/liter NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.7-0.8 정도가 되었을 때 IPTG를 최종농도 1 mM로 첨가하여 재조합 접착단백질인 MGFP-5의 발현을 유도하였다. 이때 50 ㎖ 멸균된 튜브에 10 ㎖의 LB 배지를 넣고(500 ㎍의 앰피실린 첨가) 12시간 키운 배양액을 100 ㎖의 LB 배지가 들어있는 500 ㎖ 플라스크에 넣어 접종하였다. E. coli BL21/pMDG05 배양액은 13,000 rpm, 4 에서 10분간 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고 이를 -80 °C 에 보관하였다.
6-2. MGFP-5 발현 확인
세포 펠렛은 SDS-PAGE용 완충액(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 10 ％ glycerol, 5 ％ SDS, 5 ％ β-mercaptoethanol, 0.25 ％ bromophenol blue) 100 ㎍에 희석하고, 100 에서 5분간 끓여 변성시켰다. SDS-PAGE의 경우 시료를 15％ SDS-폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후 쿠마시블루(Coomasie blue) 염색 또는 실버염색(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 웨스턴블롯의 경우는 시료를 15％ SDS-폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후, 나이트로셀룰로즈 막에 15 V 전압하에 이동시켰다. 단백질이 전이된 나이트로셀룰로즈막을 모노클로날 히스티딘 친화성 리간드 항체(R＆D Systems, 미국)를 이용, MGFP-5 단백질을 발색반응 후 검 출하였다.
도 9는 E. coli BL21/pMDG05 및 E. coli BL21/pTrcHis(pTrcHisA로 형질전환한 E. coli BL21/pTrcHisA) 각각의 배양물의 전기영동사진으로, MW는 사이즈 마커이고, N은 대조군이고, WC는 E. coli BL21/pMDG05배양물이다. 도 9에서, E. coli BL21/pMDG05에서 MGFP-5 단백질이 발현됨을 확인되었다.
재조합 MGFP-5의 발현형태를 확인하기 위하여 세포시료를 세포 펠렛과, 세포 펠렛을 라이시스(lysis)하여 수득한 비용해성 세포 부산물(cell debris)와 용해성 상층 분획을 각각 SDS-PAGE와 웨스턴블롯을 수행하였다.
즉, E. coli BL21/pMDG05의 세포 펠렛에 1g 당 5 ml 완충액 (8M urea, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 8.0)를 첨가한 후 상온에서 1시간 교반하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄물(lysate)는 14,000rpm으로 20분간 원심분리하여 용해성 상층 분획과 비용해서 세포 부산물(debris)를 각각 수득하였다.
도 10은 E. coli BL21/pMDG05 배양액으로부터 분리한 세포 펠렛(WC), 용해성 상층 분획(I), 비용해성 세포 부산물(IS) 및 음성대조군(N)의 SDS-PAGE에 대한 웨스턴 블롯 사진이다. 도 10에서, MGFP-5 단백질은 용해성 상층 분획에서 다량 검출되어, 세포내에서 수용성 형태로 발현됨을 알 수 있었다.
6-3. MGFP-5 재조합 단백질 정제
E. coli BL21/pMDG05에서 수용성 형상으로 발현되는 재조합 MGFP-5 을 분리정제하기 위하여 pMDG05 벡터에 들어 있는 히스티딘 친화성 리간드를 이용하여 친화크로마트그래피를 수행하였다.
고정된 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized metal affinity chromatographym, IMAC) 정제는 엑타 프라임 정제 시스템(Acta Prime Purification System, Amersham Biosciences)을 이용하여 실시하였으며, 상온에서 유속 1ml/min으로 실시하였다. 레진은 0.1M NiSO4 (Samchun Chemicals)를 부과한 10 ml Ni-NTATM Agarose (Qiagen)를 이용하였고, 변성 조건에서 분리하였다. 컬럼에 상기 레진을 충진시킨 후 완충액(8M urea, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 8.0))을 주입하여 평형화시켰다. 이후 수용성 상층 분획을 컬럼에 주입한 후 완충액A(8M urea, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium Phosphate, pH 6.3) 및 완충액B(8M urea, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 5.9)을 흘려주었다. MGFP-5 재조합 단백질의 용출은 용출 완출액(8M urea, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 4.5)을 컬럼에 흘려주어 실시하였으며, 용출되는 분획은 모은 후 5 % 아세트산 용액에 4 로 투석(dialysis, Spectra/Por molecularporous membrane tubiug, Spectrum Lab., 미국)하였다.
도 11은 실버 염색한 SDS-PAGE 사진으로, E. coli BL21/pMDG05으로부터 MGFP-5 재조합 단백질을 정제하는 친화성 크로마토그래피 단계별 시료를 전기영동한 것이다. M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 컬럼에 수용성 상층 분획을 주입하였을때 흡착되지 않은 분획이고, 레인 2는 컬럼 세척 단계에서 수득한 용출 분획이며, 레인 3은 용출 완충액으로 분리시킨 용출 분획이다. 도 11에서 MGFP-5 재조합 단백질이 고순도로 정제됨을 확인할 수 있다.
6-4. MGFP-5 재조합 단백질 분석
MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight) 질량 스펙트로스코피 분석을 PerSeptive Voyager DE instrument (Perkin-Elmer)를 이용하여 실시하였다.
기질 용액으로 30% 아세토나이트릴 및 0.1 % 트리플로로아세트산에 용해시킨 시나피닉 산(Sinapinic acid)을 이용하였다. 상기 6-3에서 수득한 MGFP-5 재조합 단백질은 상기 기질 용액에 1:25로 희석한 후 1 ul를 금 플레이트에 점적한 후 진공펌프로 건조하였다. 질량 스펙트라는 25,000V의 가속 전압, 그리드(grid) 전압 70 내지 80 %, 가이드 와이어 전압 0.3％, 지연 시간 200 내지 500 ns, N2 레이저 전원 1600 내지 1900(arbitrary units)의 양성 이온 모드에서 측정하였다. 내부적인 교정(internal calibration)은 66.431에서의 [M + H]+ 및 33.216에서의 [M + 2H]2+ 조건에서 BSA를 이용하여 실시하였다.
도 12는 정제한 MGFP-5 재조합 단백질의 질량 분석 결과이다.
실시예 7: E. coli BL21/pMDG051로부터 MGFP-51의 발현 및 정제
실시예 6과 동일한 방법으로 E. coli BL21/pMDG051를 배양하였고, 세포 펠펫을 수득한 후 비수용성 세포 부산물 및 수용성 상층 분획을 각각 수득하였다. 이후 상기 시료는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 13은 E. coli BL21/pMDG051 로부터 MGFP-51 재조합 단백질 발현을 분석한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다. W는 세포 펠렛이고, S는 수용성 상층 분획이고, IS는 비수용성 세포 부산물이다. 도 13에서, MGFP-51 재조합 단백질은 세포내 수용성 형태 및 비수용성 형태 모두로 발현됨을 알 수 있다.
실시예 8: E. coli BL21/pMDG150로부터 MGFP-150의 발현 및 정제
실시예 6과 동일한 방법으로 E. coli BL21/pMDG150을 배양하였고, 세포 펠펫을 수득한 후 비수용성 세포 부산물 및 수용성 상층 분획을 각각 수득하였다. 이후 상기 시료는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 14는 E. coli BL21/pMDG150로부터 MGFP-15 재조합 단백질 발현을 분석한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다. M은 사이즈 마커이고, W는 세포 펠렛이고, S는 수용성 상층 분획이고, IS는 비수용성 세포 부산물이다. 도 14에서, MGFP-15 재조합 단백질은 세포내 수용성 형태 및 비수용성 형태 모두로 발현됨을 알 수 있다.
실시예 9: E. coli BL21/pMDG151로부터 MGFP-151의 발현 및 정제
9-1. MGFP-151의 발현
실시예 6과 동일한 방법으로 E. coli BL21/pMDG151를 배양하였고, 세포 펠펫을 수득한 후 비수용성 세포 부산물 및 수용성 상층 분획을 각각 수득하였다. 이후 상기 시료는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 15는 E. coli BL21/pMDG151 로부터 MGFP-151 재조합 단백질 발현을 분석한 SDS-PAGE 사진(A) 및 웨스턴 블롯 사진(B) 이다. W는 세포 펠렛이고, S는 수용성 상층 분획이고, IS는 비수용성 세포 부산물이다. 도 15에서, MGFP-51 재조합 단백질은 수용성 및 비용성 형태로 발현됨을 알 수 있다.
9-2. MGFP-151 재조합 단백질의 정제 I
세포 펠렛에 1 g 당 5 ml의 라이시스 완충액(lysis buffer, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 8.0)을 가하여 현탁한 후 20,000 PSI(Constant systems, Low March, UK)로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 18,000 g, 4 ° C에서 20분간 원심분리하여 세포 부산물은 수득하였다. 세포 부산물에 5, 10, 15, 20, 25, 30, 22, 24, 26 및 28 (v/v)%의 아세트산을 각각 1g 당 20 ml을 가하여 희석한 후 동일조건으로 원심분리하였다. 상층액은 크로마토그래피용 시료를 제조하였다.
40 cm x 2.6 cm의 컬럼에 세파크릴 S-300 HR (Pharmacia)를 충진하고, 5 %의 아세트산으로 평형화시켰다. 이후 시료 2 ml를 주입한 후 상기 시료 희석에 사용한 아세트산을 동일 농도로 각각 흘려주면서 용출 분획을 수득하였다. 아세트산의 농도별로 용출시킨 분획은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후 코마시 블루로 염색하여 MGFP-151의 정제율을 확인하였다(도 16). 도 16에서 MGFP-151 재조합 단백질은 아세트산 20 내지 30 (v/v)% 농도에서 용출됨을 확인할 수 있다. 특히 25 % 아세트산으로 희석하였을때 75％의 순도 및 45％의 수율로 가장 좋은 결과를 확인하였다.
9-3. MGFP-151 재조합 단백질의 정제 II
세포 펠렛에 1 g 당 5 ml의 라이시스 완충액(lysis buffer, 10 mM Tris-Cl, 100 mM sodium phosphate, pH 8.0)을 가하여 현탁한 후 20,000 PSI(Constant systems, Low March, UK)로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 18,000 g, 4 ° C 에서 20분간 원심분리하여 세포 부산물은 수득하였다. 세포 부산물에 25％의 아세 트산 용액을 1g 당 20 ml을 가하여 현탁시키고, 동일조건으로 원심분리하였다. 상층액은 동결 건조한 후, 5 % 아세트산 용액 2 ml에 용해시켜 크로마토그래피용 시료를 제조하였다.
40 cm x 2.6 cm의 컬럼에 세파크릴 S-300 HR (Pharmacia)를 충진하고, 5 %의 아세트산으로 평형화시켰다. 이후 시료 2 ml를 주입한 후 5(v/v)%의 아세트산을 각각 흘려주면서 용출 분획I 및 II를 수득하였다. 상기 분획 I 및 II는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 후 코마시 블루로 염색하여 mgf-151의 정제율을 확인하였다(도 17). 도 17은 MGFP-151 재조합 단백질의 크로마토그래피를 통하여 수득한 분획들의 SDS-PAGE(A) 및 이의 웨스턴 블롯(b)이다. 크로마토그래피를 통하여 95.8%의 순도를 갖는 MGFP-151 재조합 단백질을 분리할 수 있었다.
상기 정제한 MGFP-151 재조합 단백질은 HALDI-TOF 질량 스펙트로미터로 분석하여, 최초 설계힌 MGFP-151 펩타이드와 동일함을 확인하였다.
실시예 10: 접착 단백질의 타이르신 잔기의 변형
실시예 6 내지 9에서 정제한 MGFP-05, MGFP-051, MGFP150 및 mfgp-151 접착 단백질 각각은 25 mM 아스코르빈산을 포함하는 5 % 아세트산 완충액에 1.44 mg/ml로 용해시킨 후 50 ug/ml의 티로시나제를 첨가한 후 25 ° C에서 6시간 흔들어 주었다. 상기 과정을 통하여 접착 단백질의 타이로신 잔기를 DOPA로 수정하였다. 또한 BSA(Bovine serum albumin)은 음성 대조군으로 이용하였고, 홍합 접착 단백질 FP-1 및 fp-2로 이루어진 상품명 Cell-TakTM(BD Bioscience, Two Oak Park, Belford, MA, USA)은 양성 대조군으로 사용하였다.
실시예 11: MGFP-05 및 MGFP-151 재조합 단백질의 다양한 표면에서의 코팅력 검증
Mgfp-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질의 슬라이드 글라스, 폴리메틸메타크릴레이트 판 및 알루미늄 판 위에서의 코팅 능력을 측정하였다. 각각의 표면은 물로 여러 번 씻어 준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 1.44 mg/mL의 단백질 용액 5 μL를 각각의 표면에 점적한 후 25° C 에서 12시간동안 보관하였다. 건조되면, 각 판들은 이차 증류수로 2시간동안 흔들면서 씻어주었으며, 각 표면에 남아있는 물은 진공펌프를 이용해서 증발시켜 주었다. 건조 후, 표면에 코팅된 단백질은 코마시 글루 염색으로 시각화하였다. 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18은 Mgfp-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질의 타이로신 잔기를 DOPA로 수정한 후 이를 슬라이드 글라스, 폴리메틸 메타크릴레이트 판 및 알루미늄 판 위에 코팅한 결과이다. Mgfp-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질은 타이로신 잔기가 수정되지 않은 상태에서도 유리, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 알루미늄에 모두 점착되었으며 타이로신 잔기가 DOPA로 수정한 경우 점착력은 더욱 높게 확인되었다.
실시예 12: QCM(Quartz Crystal Microbalance)를 이용한 재조합 접착 단백질의 흡착측정
사용한 수정결정(Quartz Crystal, Seiko EG ＆ G)은 직경이 5 mm이며 기본 진동수가 MHz인 금이 코팅된 AT-cut 수정이다. 단백질의 농도가 1.44 mg/mL인 단백 질(BSA, Cell-Tak, MGFP-01 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질) 용액 5μL를 각각 수정결정 (Quartz Crystal)의 금 표면위에 올려놓은 후에 25° C 의 항온 수조에서 12시간동안 보관하였다. 그 후, 항온 수조에서 꺼내어 말린 후에, 이차 증류수로 1시간동안 흔들면서 씻어주었으며, 수정결정에 남아있는 물은 진공펌프를 이용해서 증발시켜주었다. 건조된 수정결정 (Quartz Crystal)은 EQCM 컨트롤러 (QCA917; Seiko EG＆ G)에 연결하고, 공명 진동수의 변화를 측정하였다. 수정결정의 진동수의 감소는 표면에 흡착된 질량과 비례하므로(G. Sauerbrey, 1959, Z. Phys, 155, 206) 공명진동수의 변화는 수학식 1에 대입하여 질량 증가분을 계산하였다 (M. Thomson, 1991, Analyst, 116, 881-889).
(수학식 1)
Figure 112006067946215-pct00002
상기 수학식 1에서, △mass는 질량변화이고, △freq는 공명 진동수의 변화이고, μp는 AT-cut 수정결정상수(quartz crystal constant, 2.947 × 1.011g/cm/sec2)이고, P q는 수정결정 밀도 (quartz crystal density, 2.648 g/cm2)이고, F q 2는 참고 진동수(9.00 MHz)이고 및 A는 수정결정 표면적(quartz crystal surface area, 0.196 cm2)이다.
도 19는 타이로신을 처리한 BSA, Cell-Tak, MGFP-05 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질의 QCM 분석결과로, 금 표면에 흡착된 정도를 진동수 변화로 나타내고 있다. 도 19에서, 티로시나제로 수정된 MGFP-151 재조합 단백질이 가장 큰 진동수의 변화를 보였으며, 이는 가장 많은 질량이 수정결정위의 금표면에 흡착되었음을 의미한다. Cell-TakTM 또한 BSA에 비해서 많은 양이 흡착된 것을 알 수 있었으나, MEFP-5 재조합 단백질에 비하여 매우 흡착력이 매우 낮게 확인되었다. 각각의 질량 변화율은 MGFP-151 재조합 단백질이 36%, MGFP-5 재조합 단백질이 23.2%이였으며, Cell-Tak는 10% 이하이다.
실시예 13: AFM(atomic force microscope)를 이용한 재조합 접착 단백질의 흡착측정
힘-거리 곡선(force-distance curve)은 AFM(SPA400; Seiko Instruments)을 이용하여 구하였으며, AFM의 cantilever는 ducker et al. 방법에 따라 실시하였다(W. Ducker, Nature, 1991, 353, 239-241)(도 20).
본 실험에서 사용된 cantilever는 Olympus oxide-sharpenedsilicon nitrate probes (Veeco ＆ Seiko Instruments)이고, 탄성계수가 0.57 또는 11 N/m이다. 직경이 20 μm인 유리 비드(Park Science)를 에폭시 레진(Vantico)을 통해서 Cantilever의 끝에 부착해주었고, 상온에서 24시간동안 두었다. 유리 비드를 붙인 AFM cantilever는 AFM에 장착하고, 유리 비드를 티로시나제로 수정된 단백질 용액(1.44 mg/ml의 BSA, Cell-Tak, MGFP-1 또는 MGFP-5) 10 μL에 30분 동안 담구었다. 유리비드는 깨끗한 유리 표면에 접촉시키고, 힘 거리 커브(force-distance curve)를 구하였다.
도 21은 타이로신 잔기가 수정된 MGFP-1 재조합 단백질 및 MGFP-5 재조합 단백질의 점착성을 나타내는 것으로, 재조합 홍합접착단백질 MGFP-5와 MGFP-151는 각각 평균값이 약 540 nN과 500 nN으로 커다란 접착능력을 갖는 것을 알 수 있었으며, Cell-Tak은 250 nN, BSA는 약 30 nN을 나타내었다. 이 결과는 티로시나제로 수정된 재조합 홍합접착단백질들이 강한 접착능력을 갖고 있는 것을 보여준다.
실시예 14: 세포에 대한 접착성 측정
Drosophila S2 세포(Invitrogen)를 이용하였다.
S2 세포는 27° C의 배양기에서 10% IMS(insect medium supplement), 1％ Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen), hygromycin 3 μL/mL를 함유한 M3 배지 (Shields and Sang M3 insect medium; Sigma)에서 배양하였다. 멸균된 슬라이드 글라스(20 mm x 20 mm, Marienfeld, German)에 실시예 10에서 준비한 티로시나제가 처리된 MGFP-5 재조합 단백질, MGFP-151 재조합 단백질, Cell-Tak 및 BSA를 각각 10 μL를 떨어뜨린 후에, 라미나 플로우 푸드(Laminar flow hood)에서 25° C로 30분간 둔 다음 PBS로 2회 세척하였다. 상기 슬라이드 글라스는 95%의 생존율을 나타내는 4 x 106 cells/mL의 S2 세포가 있는 100-mm 세포배양 접시에 침지하였다. 27° C의 배양기에서 1시간 내지 7일간 둔 후, 부착되지 않은 세포는 PBS로 세척하여 제거하였고 트립판 블루 염색을 통하여 세포 생존율 및 부착 위치를 확인하였다.
그 결과, MGFP-5 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질이 코팅된 부위에 S2 세포가 부착됨을 확인할 수 있었으며, 부착된 S2 세포는 7일 이상 생존하였다.(도 22 및 도 23)
실시예 15: MGFP-5 및 MGFP-151의 화학적 접착 안정성 검사
MGFP-5 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질은 유리에 각각 점적하고 비교군으로 Cell-Tak도 점적하였다. 건조시킨 후 이를 5% 아세트산, 25 % 메탄올 및 70% 물로 이루어진 용매에 담구고, 20분간 85° C로 가열하였다. 그 결과, 유리 또는 아크릴 판에 코팅시킨 접착 단백질들은 용매 조건에서 고온으로 방치하는 경우 MGFP-5는 떨어져 탈착되나, MGFP-151은 계속적으로 붙어있음을 알 수 있었다.
또한 유리 또는 아크릴판에 각각을 코팅한 후 SEM으로 접착 안정성을 측정하였다.
도 24A 내지 C는 MGFP-5 재조합 단백질 및 MGFP-151 재조합 단백질이 코팅된 기질 표면을 나타낸 사진으로, A는 2500X 배율 사진이고, B는 10000x 배율 사진이고, C는 35000X 배율 사진이다. 관찰결과, MGFP-151이 코팅된 표면은 매끈하였으나 MGFP-5가 코팅된 표면은 약간 투둘투둘하였다. 상기한 차이점들은 가교도의 차이로 생각된다.
[서열목록 프리텍스트]
서열번호 1 내지 4는 프라이머 서열이다.
서열번호 5는 미틸로스 갈로프로빈시얼리스에서 분리한 MGFP-5 단백질의 cDNA이다.
서열번호 6은 미틸로스 갈로프로빈시얼리스에서 분리한 MGFP-5 단백질 서열이다.
서열번호 7은 미틸로스 에둘리스에서 분리한 MEFP-5 단백질의 일부 서열이 6회 반복 연속된 핵산 서열이다.
서열번호 8은 미틸로스 에둘리스에서 분리한 MEFP-5 단백질의 일부 서열이 6회 반복 연속된 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-150 접착 단백질을 코딩하는 핵산서열이다.
서열번호 10은 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-150 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-015 접착 단백질을 코딩하는 핵산서열이다.
서열번호 12는 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-015 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-151 접착 단백질을 코딩하는 핵산서열이다.
서열번호 14는 FP-1과 MGFP-5을 조합하여 제조한 MGFP-151 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 MGFP-5의 발현을 위해 pMDG05 벡터에 삽입된 구조체의 핵산서열이다.
서열번호 16은 MGFP-5의 발현을 위해 pMDG05 벡터에 삽입된 구조체로부터 발현되는 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 17은 MGFP-150의 발현을 위해 pMDG150 벡터에 삽입된 구조체의 핵산서열이다.
서열번호 18은 MGFP-150의 발현을 위해 pMDG150 벡터에 삽입된 구조체로부터 발현되는 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 19는 MGFP-015의 발현을 위해 pMDG015 벡터에 삽입된 구조체의 핵산서열이다.
서열번호 20은 MGFP-015의 발현을 위해 pMDG015 벡터에 삽입된 구조체로부터 발현되는 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 21은 MGFP-151의 발현을 위해 pMDG151 벡터에 삽입된 구조체의 핵산서열이다.
서열번호 22는 MGFP-151의 발현을 위해 pMDG151 벡터에 삽입된 구조체로부터 발현되는 접착 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 23 및 24는 프라이머 서열이다.
서열번호 25는 FP-1의 일부 서열이다.
서열번호 26 내지 31은 FP-1의 일부 서열인 AKPSYPPTYK를 코딩하는 핵산서열이다.
서열번호 32는 T3 프로모터에 대한 프라이머 서열이다.
서열번호 33은 T7 프로모터에 대한 프라이머 서열이다.
서열번호 34 및 35는 프라이머 서열이다.
<110> POSCO POSTECH Foundation <120> Mussel Bioadhesive <130> DPP-2006-3208-KR <150> US 60/556,805 <151> 2004-03-26 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggcctgcagc agttctgaag aatacaaggg 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtagatctat acgccggacc agtgaacag 29 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cttgtatttt ccgctgtttt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaaaacagcg gaaaatacaa g 21 <210> 5 <211> 228 <212> DNA <213> Mytilus galloprovincialis <220> <221> CDS <222> (1)..(228) <223> Mytilus galloprovincialis foot protein-5 cDNA <400> 5 agt tct gaa gaa tac aaa ggt ggt tat tac cca ggc aat act tac cac 48 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 tat cat tca ggt ggt agt tat cac gga tcc ggc tat cat gga gga tat 96 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 aag gga aag tat tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa 144 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 aac agc gga aaa tac aag tat ctg aag aaa gct aga aaa tac cat aga 192 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 aag ggt tac aag aag tat tat gga ggt ggt agc agt 228 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 76 <212> PRT <213> Mytilus galloprovincialis <400> 6 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 7 <211> 180 <212> DNA <213> mytilus edulis <220> <221> CDS <222> (1)..(180) <223> 6 times repeated sequence derived from mytilus edulis foot protein-1 <400> 7 gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca 48 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa 96 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc 144 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa 180 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 60 <212> PRT <213> mytilus edulis <400> 8 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 9 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bioadhesive protein(mgfp-150) coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <223> Bioadhesive protein(mgfp-150) <400> 9 gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca 48 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa 96 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc 144 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa agt tct gaa gaa 192 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt 240 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat 288 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa 336 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag 384 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc 411 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe 130 135 <210> 10 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe 130 135 <210> 11 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bioadhesive protein(mgfp-051) coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <223> Bioadhesive protein(mgfp-051) <400> 11 agt tct gaa gaa tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac 48 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 tat cat tca ggt ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat 96 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 aag gga aag tat tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa 144 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 aac agc gga aaa tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga 192 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 aag ggt tac aag aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg 240 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro 65 70 75 80 tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat 288 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 85 90 95 aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac 336 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 100 105 110 ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct 384 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 115 120 125 aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa 411 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 130 135 <210> 12 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 85 90 95 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 100 105 110 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 130 135 <210> 13 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bioadhesive protein(mgfp-151) coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(591) <223> Bioadhesive protein(mgfp-151) <400> 13 gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca 48 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 ccg act tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa 96 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc 144 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa agt tct gaa gaa 192 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt 240 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat 288 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa 336 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag 384 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg 432 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct 480 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac 528 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac 576 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 180 185 190 ccc ccg act tac aaa 591 Pro Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 14 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 180 185 190 Pro Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 15 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct for expression of Bioadhesive protein(mgfp-5) in pMDG05 vector <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <223> Bioadhesive recombinant protein expressed in pMDG05 vector <400> 15 atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act 48 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 ggt gga cag caa atg ggt cgg act ctg tac gac gat gac gat aag gat 96 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 cga tgg gga tcc gag ctc gag atc tgc agc agt tct gaa gaa tac aag 144 Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys 35 40 45 ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt ggt agt 192 Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser 50 55 60 tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat tac gga 240 Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa tac aag 288 Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys 85 90 95 tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag aag tat 336 Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr 100 105 110 tat gga ggt agc agt taa 354 Tyr Gly Gly Ser Ser 115 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys 35 40 45 Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser 50 55 60 Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys 85 90 95 Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr 100 105 110 Tyr Gly Gly Ser Ser 115 <210> 17 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct for expression of Bioadhesive protein(mgfp-150) in pMDG150 vector <220> <221> CDS <222> (1)..(453) <223> Bioadhesive recombinant protein expressed in pMDG150 vector <400> 17 atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc gct aaa 48 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act 96 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 20 25 30 tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct 144 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 35 40 45 tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag 192 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa ggc tgc agt tct gaa gaa 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu 65 70 75 80 tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt 288 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 85 90 95 ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat 336 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 100 105 110 tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa 384 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 115 120 125 tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag 432 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 130 135 140 aag tat tat gga ggt agc agt taa 456 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 145 150 <210> 18 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 20 25 30 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 35 40 45 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 85 90 95 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 100 105 110 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 115 120 125 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 130 135 140 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser 145 150 <210> 19 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct for expression of Bioadhesive protein(mgfp-051) in pMDG051 vector <220> <221> CDS <222> (1)..(537) <223> Bioadhesive recombinant protein expressed in pMDG051 vector <400> 19 atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act 48 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 ggt gga cag caa atg ggt cgg act ctg tac gac gat gac gat aag gat 96 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 cga tgg gga tcc gag ctc gag atc tgc agc agt tct gaa gaa tac aag 144 Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys 35 40 45 ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt ggt agt 192 Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser 50 55 60 tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat tac gga 240 Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa tac aag 288 Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys 85 90 95 tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag aag tat 336 Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr 100 105 110 tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg acc tac 384 Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 115 120 125 aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct agc tat 432 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac aaa gca 480 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac ccc ccg 528 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 act tac aaa taa 540 Thr Tyr Lys <210> 20 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Thr Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Arg Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Ser Ser Glu Glu Tyr Lys 35 40 45 Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly Gly Ser 50 55 60 Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly 65 70 75 80 Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys 85 90 95 Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr 100 105 110 Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 115 120 125 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys <210> 21 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> construct for expression of Bioadhesive protein(mgfp-151) in pMDG151 vector <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <223> Bioadhesive recombinant protein expressed in pMDG151 vector <400> 21 atg ggg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc gct aaa 48 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 ccg tct tac ccg ccg acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act 96 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 20 25 30 tat aag gct aaa cct agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct 144 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 35 40 45 tac ccg ccg act tac aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag 192 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 gct aaa ccg agt tac ccc ccg act tac aaa ggc tgc agt tct gaa gaa 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu 65 70 75 80 tac aag ggt ggt tat tac cca ggc aat tcg aac cac tat cat tca ggt 288 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 85 90 95 ggt agt tat cac gga tcc ggc tac cat gga gga tat aag gga aag tat 336 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 100 105 110 tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa aac agc gga aaa 384 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 115 120 125 tac aag tat cta aag aaa gct aga aaa tac cat aga aag ggt tac aag 432 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 130 135 140 aag tat tat gga ggt agc agt gaa ttc gct aaa ccg tct tac ccg ccg 480 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 145 150 155 160 acc tac aaa gca aaa ccc tcg tac cca ccg act tat aag gct aaa cct 528 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 165 170 175 agc tat cca cct acg tac aaa gct aaa ccg tct tac ccg ccg act tac 576 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 180 185 190 aaa gca aaa ccg tcc tac cct ccg acc tat aag gct aaa ccg agt tac 624 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 195 200 205 ccc ccg act tac aaa t aa 642 Pro Pro Thr Tyr Lys 210 <210> 22 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 22 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 20 25 30 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 35 40 45 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Cys Ser Ser Glu Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr His Ser Gly 85 90 95 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 100 105 110 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 115 120 125 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 130 135 140 Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Glu Phe Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 145 150 155 160 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 165 170 175 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 180 185 190 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 195 200 205 Pro Pro Thr Tyr Lys 210 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggtacccgaa ttcgaattcg ctaaaccg 28 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggtcgactca agcttatcat ttgtaagtcg 30 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> mytilus edulis <400> 25 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 26 gctaaaccgt cttacccgcc gacctacaaa 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 27 gcaaaaccct cgtacccacc gacttataag 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 28 gctaaaccta gctatccacc tacgtacaaa 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 29 gctaaaccgt cttacccgcc gacttacaaa 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 30 gcaaaaccgt cctaccctcc gacctataag 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Mytilus edulis <400> 31 gctaaaccga gttacccccc gacttacaaa 30 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cctaacatat gggggttctc atcatc 26 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atccgccaaa acagccaagc tt 22

Claims (49)

  1. 삭제
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  6. 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 접착 펩타이드; 및 상기 접착 펩타이드의 카르복시 말단, 아미노 말단 또는 카르복시 말단 및 아미노 말단의 양단에 접착 펩타이드의 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드가 더욱 연결된 것인 접착 단백질로서,
    상기 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 것인 접착 단백질.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 접착 단백질은 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열 및 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 접착 단백질.
  8. 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 접착 펩타이드; 및 상기 접착 펩타이드의 카르복시 말단, 아미노 말단 또는 카르복시 말단 및 아미노 말단의 양단에 접착 펩타이드의 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드가 더욱 연결된 것인 접착 단백질로서,
    상기 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드는 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 것인 접착 단백질.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 접착 단백질은 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열,서열번호 18에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 20에 기재된 아미노산 서열 및 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 접착 단백질.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 6항 내지 제9항중 어느 한항에 따른 접착 단백질을 코딩하는 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 삭제
  14. 제 12항에 있어서, 상기 물리화학적 특성을 향상시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 26 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 것인 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9에 기재된 핵산 서열, 서열번호 11에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 13에 기재된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  16. 삭제
  17. 제 12항에 있어서, 상기 접착 단백질을 코딩하는 서열은 서열번호 17에 기재된 핵산 서열, 서열번호 19에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 21에 기재된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제 6항 내지 9항중 어느 한항에 따른 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현가능하도록 포함하는 벡터.
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  25. (a) 제 6항 내지 9항중 어느 한항에 따른 접착 단백질을 코딩하는 유전자를 발현가능하도록 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계 및
    (c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 접착 단백질을 생산하는 단계
    를 포함하는 접착 단백질의 생산방법.
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  34. (a) 제 6항 내지 9항중 어느 한항에 따른 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현가능하도록 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 파쇄한 후 원심분리하여 상층액 및 펠렛을 각각 분리하는 단계;
    (b) 상기 펠렛에 산성 유기용매를 가한 후 현탁시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 현탁액을 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계;
    를 포함하는 접착 단백질의 정제방법.
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  39. 제 6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 접착 단백질을 유효성분으로 포함하는 접착제.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 수정된 것인 접착제.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 접착제는 플라스틱, 유리, 금속, 진핵생물의세포, 원핵생물의 세포, 식물세포의 세포벽 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 접착되는 것인 접착제.
  42. 제 39항에 있어서, 상기 접착제는 생물 시료에 적용되는 것인 접착제.
  43. 제 39항에 있어서, 상기 접착제는 계면활성제, 산화제 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 물질을 더욱 포함하는 것인 접착제.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐 도데실설페이트 또는 소듐 도데실벤젠설포네이트인 접착제.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 산화제는 티로시나제 또는 H2O2인 접착제.
  46. 제 43항에 있어서, 상기 충진제는 콜라겐, 히알루론 산, 콘드로이탄 설페이트, 엘라스틴, 라미닌, 카세인, 하이드록시아페티트, 알부민, 피브로넥틴 및 하이브린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접착제.
  47. 제 39항에 있어서, 상기 접착제는 수중환경에 사용되는 기질에 적용되는 것인 접착제.
  48. 제 39항에 따른 접착제에 산화제, 충진제 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 접착 단백질의 농도를 조절하는 것을 포함하는 접착제의 접착력을 조절하는 방법.
  49. 제 6항 내지 제 9항중 어느 한항에 따른 접착 단백질을 유효성분으로 함유하는 코팅제.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101412773B1 (ko) * 2011-04-06 2014-06-30 포항공과대학교 산학협력단 티로시나아제 동시발현에 의해 제조된 홍합 접착 단백질
KR101578522B1 (ko) 2012-08-23 2015-12-17 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질 기반의 생체접착 하이드로젤
KR20190067123A (ko) 2017-12-06 2019-06-14 주식회사 아모라이프사이언스 홍합접착단백질의 생산 방법

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004031258A1 (de) * 2004-06-29 2006-02-09 Jennissen, Herbert P., Prof. Dr. Proteinhybride mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen
WO2006038866A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Bio Polymer Products Of Sweden Ab Improved coating comprising a bioadhesive polyphenolic protein derived from a byssus-forming mussel
KR100916722B1 (ko) 2007-10-13 2009-09-14 민병호 홍합본드를 이용한 인공치아 형성방법
US8722617B2 (en) 2007-12-31 2014-05-13 Postech Academy-Industry Foundation Mussel adhesive protein derived vectors for gene delivery
JP2012526155A (ja) 2009-08-25 2012-10-25 ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーション イガイ接着蛋白質またはその変異体に陰イオン性高分子が含まれたコアセルベート
EP2593519B1 (en) * 2010-07-16 2016-10-26 Biopolymer Technology Of Sweden AB The use of cerium oxide and a polypeptide extracted from a byssus-forming mussel for the manufacture of a corrosion inhibiting coating
CN102344488A (zh) * 2010-07-30 2012-02-08 浙江海洋学院 厚壳贻贝足腺多酚蛋白的提取方法及快速检测方法
EP2798027A4 (en) 2011-11-28 2015-10-07 Boxin Zhao METHOD AND APPARATUS FOR COLLAGE ASSEMBLY IN AQUEOUS MEDIUM
CN102433357A (zh) * 2011-12-21 2012-05-02 西北大学 植物表达贻贝粘合蛋白Mefp-5的方法
DE102012110664A1 (de) * 2012-11-07 2014-05-08 Henkel Ag & Co. Kgaa In Beschichtungsmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen für oxidische Oberflächen einsetzbare Peptide
US9359547B2 (en) 2013-01-31 2016-06-07 Halliburton Energy Services, Inc. Wellbore servicing compositions and methods of making and using same
US20140271500A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Safewhite Llc Methods and materials for providing teeth with a white appearance
JP6202669B2 (ja) * 2013-04-26 2017-09-27 国立研究開発法人国立循環器病研究センター ペプチド及びその複合体、組織修復用スキャフォールド及びその表面処理方法、並びに表面処理液又は処理液のセット
CN103520766A (zh) * 2013-09-25 2014-01-22 高敏 贻贝粘蛋白液体产品、其制备方法及其应用
US10449267B2 (en) 2013-11-13 2019-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling underwater adhesives
KR101652263B1 (ko) * 2014-06-13 2016-08-30 (주)콜로디스 바이오사이언스 항균 펩티드를 포함하는 접착 단백질 및 이를 포함하는 항균 코팅 조성물
US9801972B2 (en) 2014-10-02 2017-10-31 Postech Academy-Industry Foundation Mussel-inspired bioactive surface coating composition generating silica nanoparticles
CN104446311B (zh) * 2014-12-11 2016-06-08 山东瑞国环保科技有限公司 一种耐候高强度彩钢板用水性涂料及制备方法
EP3275893A4 (en) * 2015-03-23 2018-09-26 The Chugoku Electric Power Co., Inc. Adhesive molecule
EP3275890A4 (en) * 2015-03-23 2018-09-05 The Chugoku Electric Power Co., Inc. Adhesive molecule
KR102424889B1 (ko) * 2015-06-08 2022-07-25 콜로디스 바이오사이언스, 인코포레이티드 생리기능성 접착제 조성물
KR101865451B1 (ko) 2015-08-26 2018-07-13 윤원준 무기물 표면 접착 또는 코팅용 단백질 접착제
WO2017075308A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 E Ink Corporation Methods for sealing microcell containers with phenethylamine mixtures
CA2914315C (en) * 2015-12-09 2023-04-25 Nova Chemicals Corp. Hot fill process with closures made from high density unimodal polyethylene
CA2914353C (en) * 2015-12-10 2023-01-24 Nova Chemicals Corp. Hot fill process with closures made from high density polyethylene compositions
WO2018052245A1 (ko) * 2016-09-13 2018-03-22 윤원준 세포접착용 조성물 및 방법
KR102601138B1 (ko) 2016-10-28 2023-11-10 주식회사 포스코 항균 접착 필름용 조성물 및 이를 이용한 항균 접착 필름의 제조방법
CN106916564B (zh) * 2017-03-15 2018-08-10 吉林大学 一种基于氧化型谷胱甘肽与无机多金属氧簇的复合仿生黏合剂及其制备方法
WO2018174307A1 (ko) * 2017-03-20 2018-09-27 콜로디스 바이오사이언스, 인코포레이티드 홍합 접착 단백질의 분리정제 방법
EP3381932A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-03 Technische Universität Berlin Modified mussel proteins, uses thereof and related compounds
KR102488119B1 (ko) 2017-05-17 2023-01-12 삼성전자주식회사 바이오 센서 및 그의 제작 방법
WO2019017658A1 (ko) 2017-07-18 2019-01-24 주식회사 포스코 항균성 접착 단백질, 항균성 나노입자, 이를 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법
US10610458B2 (en) 2017-09-08 2020-04-07 Ormco Corporation Orthodontic adhesives and methods of using same
KR102010051B1 (ko) 2017-09-20 2019-08-12 주식회사 포스코 카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법
CN108395483A (zh) * 2018-02-13 2018-08-14 天津大学 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用
CN108503712A (zh) * 2018-03-14 2018-09-07 天津大学 具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法
US11530245B2 (en) 2018-08-31 2022-12-20 Washington University Split intein mediated polymerization and production of mussel foot adhesive protein materials
CN114430771A (zh) * 2019-09-30 2022-05-03 丝芭博株式会社 蛋白质粘合剂、接合体及其制备方法
KR102386849B1 (ko) * 2019-10-14 2022-04-13 포항공과대학교 산학협력단 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법
KR102372226B1 (ko) 2019-12-19 2022-03-08 주식회사 포스코 폴리페놀이 결합된 홍합 접착 단백질 및 그의 용도
CN110959562B (zh) * 2019-12-25 2021-11-09 上海海洋大学 牡蛎肽在促进海洋希瓦氏菌诱导厚壳贻贝稚贝附着上的应用
US11753567B2 (en) 2020-01-08 2023-09-12 Nano And Advanced Materials Institute Limited Adhesive material with improved bonding performance to a wet substrate and methods for preparing the same
CN112409974B (zh) * 2020-11-19 2021-12-21 江南大学 一种双亲性生物基可降解水下粘合剂及其制备方法和应用
CN112898900A (zh) * 2021-01-20 2021-06-04 中国科学院海洋研究所 一种钢材表面涂层及其制备方法
CN114349836B (zh) * 2022-01-20 2024-02-09 成都英普博集生物科技有限公司 一种粘附力强的类贻贝粘蛋白及其制备方法
CN117447611B (zh) * 2023-12-26 2024-04-05 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202236A (en) 1984-09-13 1993-04-13 Enzon Labs Inc. Method of producing bioadhesive protein
JPS6323670A (ja) 1986-04-25 1988-01-30 バイオ−ポリマ−ズ　インコ−ポレ−テツド 接着・被覆組成物とその使用方法
JPH08266281A (ja) 1995-03-31 1996-10-15 Kaiyo Bio Technol Kenkyusho:Kk イガイ接着蛋白質遺伝子
RU2218405C2 (ru) 1995-09-13 2003-12-10 Дайити Файн Кемикал Ко., Лтд. Белок, обладающий активностью d-пантолактонгидролазы, нуклеиновая кислота, его кодирующая, вектор, штамм, способ получения белка, способ получения d-пантолактона
AU5910099A (en) 1998-09-09 2000-04-03 United States Surgical Corporation Recombinant bioadhesive protein analogs comprising hydroxyproline
WO2001044401A1 (en) * 1999-12-17 2001-06-21 Magnus Qvist New use of a bioadhesive composition comprising a polyphenolic protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession ID: AY521220 (2004.02.01.)*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101412773B1 (ko) * 2011-04-06 2014-06-30 포항공과대학교 산학협력단 티로시나아제 동시발현에 의해 제조된 홍합 접착 단백질
KR101578522B1 (ko) 2012-08-23 2015-12-17 포항공과대학교 산학협력단 홍합 접착 단백질 기반의 생체접착 하이드로젤
KR20190067123A (ko) 2017-12-06 2019-06-14 주식회사 아모라이프사이언스 홍합접착단백질의 생산 방법

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