KR20190133218A - 변형된 홍합 단백질, 이의 용도 및 관련 화합물 - Google Patents

변형된 홍합 단백질, 이의 용도 및 관련 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 홍합 접착 단백질, 이의 용도, 변형된 홍합 접착 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 변형된 홍합 접착 단백질을 제조하는데 적합한 아미노아실-tRNA 신테타제, 및 UV 광 조사에 의해 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기로부터 절단가능한 보호기를 카테콜 모이어티, 특히 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌의 하이드록시 잔기 하나 이상에 포함하는, 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체의 새로운 용도에 관한 것이다.

Description

변형된 홍합 단백질, 이의 용도 및 관련 화합물
본 발명은 제1항의 서문에 따른 변형된 홍합 단백질, 제8항, 제9항, 제11항 및 제12항의 서문에 따른 변형된 홍합 단백질의 여러가지 용도, 제13항의 서문에 따른 변형된 홍합 단백질을 코딩하는 핵산, 제14항의 서문에 따른 변형된 홍합 단백질을 제조하는데 적합한 아미노아실-tRNA 신테타제, 제15항의 서문에 따른 아미노아실-tRNA 신테타제의 용도, 및 제16항의 서문에 따른 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌의 새로운 용도에 관한 것이다.
의학계에서는, 핀과 네일을 사용하는, 현재 존재하는 한정된 치료 방식을 대체하기 위해, 골절의 치료 또는 가속화된 상처 치유를 위해 사용될 수 있는, 생체적합한 접착제 (biocompatible glue)에 대한 필요성이 오랫동안 존재해 왔다.1 생체적합한 바이오-접착제는 우수한 조직 결합 (접착) 강도, 생리학적 습한 조건에서의 높은 안정성 (응집성), 제어가능한 생분해성, 유기체에서의 비-면역원성뿐 아니라 비-독성과 같은 몇가지 요건을 충족해야 한다.2 그러나, 이러한 요건에 맞는 바이오-접착제는 현재 이용가능하지 않다. 피브린과 같은 바이오-접착제는 약한 결합 강도 및 빠른 생분해성을 나타내는 반면, 시아노아크릴레이트와 같은 합성 접착제는 결합 특성은 강하지만, 잠재적으로 유기체에 유해하며3 흡수되지 않아, 내인성 뼈 회복 (endogenous bone repair)에 좋지 않다.1
전술한 요건을 충족시킬 수 있는 생물학적 접착제는, 자신의 단백질-기반의 접착제를 사용해 조간대 (intertidal zones)에서 수중 고체 표면에 자신을 고정시킬 수 있는, 바다 홍합 (marine mussel)에서 발견된다.4 ,5 홍합은 부착하기 위해, 몇가닥 단백질성 실로 구성되고 말단에 접착성 플라크 (adhesive plaque)가 존재하는, 이른바 족사를 만든다. 접착성 플라크는 표면에 직접 접촉하며, 여러가지 홍합 접착 단백질 (mussel adhesive protein, MAP)들로 구성되어, 다양한 유기 및 무기 표면에 강력하고 영구적으로 부착할 수 있다. 인장 강도는 최대 10 MPa6로, 해면골 (약 5 MPa)의 범위 내이다.7 수중 부착을 수행하는 주 플레이어는 티로신으로부터 번역 후 형성되는 카테콜성 아미노산 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 (Dopa)이다. Dopa는 수소 결합, 금속 배위 또는 퀴논-매개 가교와 같은 다양한 기전에 의해 부착에 관여한다.4 홍합 부착에 있어 Dopa의 높은 비중을 반영하여, MAP는 최대 30 mol%의 높은 Dopa 함유율을 특징으로 한다.
홍합으로부터 추출 수율이 낮기 때문에, 홍합-생산 폴리머 (mussel-inspired polymer)를 합성하거나8 ,9 또는 효소적 시험관내 하이드록시화 단계, 티로시나제의 공동-발현 또는 번역 후 티로신 잔기의 하이드록시화를 수행하기 위한 진핵생물 발현 시스템을 이용함으로써 재조합 방식으로 MAP를 생산하기 위해10 ,11, 많은 노력들이 행해졌다. 이러한 방식들은 낮은 결합 강도, 낮은 하이드록시화 효율 또는 낮은 단백질 수율 문제들을 각각 겪고 있지만, 최근 들어 E. coli 티로실 tRNA 신테타제 (TyrRS)의 기질 허용성 (substrate tolerance)을 이용함으로써, 티로신의 잔기-특이적인 Dopa11 치환이 E. coli에서 수행된 바 있다. 그러나, 이러한 방식은 E. coli TyrRS에 의한 Dopa 활성화 비율이 낮을 뿐 아니라 Dopa의 프로테옴-와이드 병합 (proteome-wide incorporation)으로 인해 세포 증식이 손상되는 문제가 있다.
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본 발명의 과제는 Dopa-함유 단백질, 특히 Dopa-함유 홍합 단백질을 생산하기 위한 새로운 시스템 및 적절한 툴뿐 아니라 그에 따라 변형된 홍합 단백질 그 자체를 제공하는 것이다.
이러한 과제는 특히 청구항 제1항의 특징을 가진 변형된 홍합 단백질에 의해 달성된다. 이러한 홍합 단백질은 변형된 홍합 단백질의 대응되는 천연 유사체 (예, 천연 홍합 단백질)에 천연 아미노산 대신 하나 이상의 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기를 포함한다. 이에, 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기는 카테콜 모이어티의 하나 이상의 하이드록시 잔기에 보호기를 포함한다. 또한, 이는 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기로서 언급될 수 있다.
변형된 홍합 단백질은, 일 구현예에서, 변형된 홍합 접착 단백질이다. 이하, 용어 "변형된 홍합 단백질"은 항상 변형된 홍합 접착 단백질을 포괄하며, 이러한 구현예로 제한될 수 있다.
3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기는 광케이징된 (photocaged) 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기이다. 보호기는 UV 광을 조사함으로써 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체로부터 절단할 수 있다.
일 구현예에서, 변형된 홍합 접착 단백질은 변형된 fp-5 단백질 (MAP fp-5)이다.
일 구현예에서, 3,4-다이하이드록시페닐알라닌과 비교해 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체의 유일한 변형은 카테콜 모이어티의 하나 이상의 하이드록시 잔기 상에 존재하는 보호기이다. 다른 구현예에서, 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체는 또한 C2 위치에 아미노 기를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 보호기는 카테콜 모이어티의 양쪽 하이드록시 잔기에 화학적으로 결합된다. 이러한 목적에서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자를 가진 알킬 체인이 특히 적합하다.
보호기로서 적합한 예는 6-니트로-1,3-벤조다이옥솔이다. 이 보호기는 365 nm 파장의 광을 조사하였을 때 빠른 디케이징 과정 (decaging process)을 이행하는 것으로 개시된 바 있다. 또한, 1-니트로-3,4-메틸렌다이옥시벤젠 기에서는 니트로 기에서 아민으로의 부적절한 세포내 환원은 관찰되지 않았으며, 즉 전체적인 디케이징 효율이 개선되었다. 결과적으로, 이 보호기는 변형된 홍합 단백질에 병합시킬 광케이징된 Dopa를 제조하는데 매우 적합하다. 이 보호기의 화학적 구조는 아래에 표시되며, 여기서 R은 본 구현예에서 Dopa 유도체 잔기 또는 Dopa 잔기이다:
Figure pct00001
일 구현예에서, 보호기는 카테콜 모이어티의 하이드록시 잔기 하나에 화학적으로 결합한다.
일 구현예에서, 오르토-니트로벤질은, 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체가 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌 (ONB-Dopa)이도록, UV-절단성 보호기로서 사용된다.
오르토-니트로벤질 기 (ONB 기)12는 365 nm에서 UV 광 조사에 의해 쉽게 절단되어 Dopa의 카테콜 작용기를 방출시킬 수 있는 보호기이다.
ONB 기는 단순한 UV 광 조사에 의해 활성화될 수 있는 케이징된 단백질을 제조하기 위해 빈번하게 사용되어 왔다. ONB-티로신12 -14 및 ONB-플루오로티로신15과 같은 비슷한 화합물들도 알려져 있지만, 본 발명자들이 인지하는 한 ONB-Dopa는 기존에 어떠한 실험에서도 사용된 바 없다. 광보호된 Dopa 유사체의 이점은 광활성화 가능한 바이오-접착제 (photoactivatable bio-glue)를 제조할 수 있으며, 접착 특성을 손상시키는 것으로 알려진 도파퀴논으로의 Dopa 자동산화 (autoxidation)를 회피한다는 것이다.16
변형된 홍합 단백질을 합성하기 위해, 본 발명자들은 새로운 아미노아실-tRNA 신테타제 (aaRS) 및 동족 tRNA (cognate tRNA)로 된 시스템을 확립하였다. 최근 수년간, 앰버 정지 코돈 (amber stop codon)에 반응하여, 단백질에서 활성화 및 비-정규 아미노산 (non-canonical amino acid, ncAA)의 병합을 허용하기 위해, aaRS 및 동족 tRNA로 구성된 오르소고날 쌍 (orthogonal pair) (o-쌍)이 조작된 바 있다.17 동일한 접근법을 여기서 취하였다. 사용된 tRNA는, 결과적으로 더 이상 정지 코돈으로 작용하지 않는 앰버 정지 코돈 (TGA)을, 특정 tRNA에 탑재된 아미노산을 코딩하는 코돈으로서 인지한다. 이 아미노산은 신규 개발된 아미노아실-tRNA 신테타제에 의해 결정되며, 본 발명의 경우에는 ONB-Dopa이다. o-쌍의 변형은 또 다른 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기의 병합을 허용할 것이다.
새로운 aaRS는 ONB-Dopa를 단백질의 복수의 부위들에 병합시켜, 365 nm에서 광 조사시 시간 공간적으로 (spatiotemporally) 활성화될 수 있는 접착 특성을 가진 케이징된 홍합 단백질의 생산을 유도할 수 있다. 이러한 광-활성화 가능한 (광 활성화 가능한) 홍합 단백질은 생의학적 목적, 예를 들어 골절 치료에 상당한 잠재성을 가진다.
복수의 Dopa 잔기들의 협력 작용이 홍합의 부착을 크게 향상시키므로, 일 구현예에서, 홍합의 접착력을 모방하기 위해, 변형된 홍합 단백질에 수개의 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 특히 ONB-Dopa 잔기를 동시에 병합시킨다. 즉, 일 구현예에서, 변형된 홍합 단백질은 이러한 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 특히 ONB-Dopa 잔기를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 포함한다. 일 구현예에서, 이는 상기한 잔기를 2-19개, 특히 3-18개, 특히 4-17개, 특히 5-16개, 특히 6-15개, 특히 7-14개, 특히 8-13개, 특히 9-12개, 특히 10-11개 포함한다.
일 구현예에서, 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 특히 ONB-Dopa 잔기는 티로신 잔기를 치환한다. 그에 따라 변형된 홍합 단백질을 제조하기 위해, 하나 이상의 티로신 코딩 코돈은 앰버 정지 코돈으로 유전자 측면에서 치환되며, 이후, ONB-Dopa 또는 또 다른 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체를 단백질 합성시 변형된 홍합 단백질에 도입하기 위해 신규 개발된 aaRS 및 동족 tRNA 오르소고날 쌍에 의해, 이용된다.
일 구현예에서, 변형된 홍합 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19와 적어도 95%, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%, 특히 적어도 99.5% 동일한, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 1은 ONB-Dopa 잔기 5개를 가진 변형된 홍합 단백질이다. 서열번호 2는 ONB-Dopa 잔기 10개를 가진 변형된 홍합 단백질이다. 서열번호 3은 ONB-Dopa 잔기 19개를 가진 변형된 홍합 단백질, 즉 야생형 홍합 단백질 (fp-5)의 티로신 잔기 19개 모두 ONB-Dopa로 치환된 것이다. 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 처음에 오는 아미노산 77개와 동일하지만, C-말단 His6 태그를 포함하진 않는다. 일 구현예에서, 변형된 홍합 단백질은 상기한 아미노산 서열을 포함할 뿐 아니라 이러한 아미노산 서열로 구성된다.
서열번호 14는 광케이징된 Dopa 잔기 5개를 가진 변형된 홍합 단백질이다 (ONB-Dopa 및 6-니트로-1,3-벤조다이옥솔-Dopa는 광케이징된 Dopa 잔기의 예들임). 서열번호 15는 광케이징된 Dopa 잔기 10개를 가진 변형된 홍합 단백질이다. 서열번호 16은 광케이징된 Dopa 잔기 19개를 가진 변형된 홍합 단백질이며, 즉 야생형 홍합 단백질 (fp-5)의 티로신 잔기 19개가 모두 광케이징된 Dopa 잔기로 치환된 것이다. 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19는 각각 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 처음에 오는 아미노산 77개와 동일하지만, C-말단 His6 태그를 포함하진 않는다. 일 구현예에서, 변형된 홍합 단백질은 상기한 아미노산 서열을 포함할 뿐 아니라 이러한 아미노산 서열로 구성된다.
일 구현예에서, 변형된 홍합 단백질은 상기 단락 3개에서 정의된 바와 같이 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 서열번호 4와 적어도 95 %, 특히 적어도 96%, 특히 적어도 97%, 특히 적어도 98%, 특히 적어도 99%, 특히 적어도 99.5% 동일한, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 4의 서열을 가진 단백질은 TEV (Tobacco Etch Virus) 프로테아제 절단부를 가진 말토스-결합 단백질 (MBP)이며, 이는 또한 MBP-TEV로서 언급될 수 있다. 이는, TEV 프로테아제를 처리함으로써 융합된 단백질로부터 쉽게 분리할 수 있다. 이러한 처리 후, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질이 수득된다.
일 측면에서, 본 발명은 생분해성 접착제로서 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 용도, 특히 그에 따른 시험관내 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질을 포함하는 생분해성 접착제를 사용해 2가지 요소를 서로 접착시킴으로써 2가지 요소를 조합 (combining)하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 변형된 홍합 단백질에 공유 결합된 기능성 물질 (functional entity)로 표면을 코팅하기 위한 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 특히 시험관내 용도에 관한 것이다. 변형된 홍합 단백질의 상기한 용도에 의해, 적절한 기능성 물질을 선택함으로써 다수의 여러가지 기질의 표면 특성을 임의의 적절한 방식으로 조정할 수 있다. 기능성 물질은 예를 들어 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 기능성 물질은 항미생물 특성을 나타낸다. 이러한 구현예에서, 물건 (article)의 항미생물 표면 코팅을 확립할 수 있다. 예를 들어, 보철기 또는 다른 의학적 물건과 같은 임플란트를 알맞게 기능화된 변형된 홍합 단백질로 코팅할 수 있다. 즉, 항미생물 펩타이드는 변형된 홍합 단백질과 융합되는 것이 매우 적절하다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질을 포함하는 기능화된 (functionalized) 변형된 홍합 단백질 및 변형된 홍합 단백질에 공유 결합된 기능성 물질로 물건의 표면을 코팅하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 의학, 특히 외과 또는 테라피 (제1 의학적 용도)에서의 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 용도에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 생분해성 접착제로서 외과 또는 테라피에 있어 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질을 포함하는 생분해성 접착제를 연결시킬 파트들 중 하나 이상, 특히 연결시킬 양쪽 파트에 적용함으로써, 필요한 인간 또는 동물의 신체의 양쪽 파트를 기밀하게 연결하는 치료학적 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 골절 치료 또는 상처 치유 강화 (제2 또는 추가적인 의학적 용도)에 있어 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 용도에 관한 것이다. 상처 치유는, 예를 들어, 변형된 홍합 단백질을 항미생물 펩타이드와 같은 항미생물성 물질과 커플링하고, 이러한 기능화된 변형된 홍합 단백질을 상처 감염을 방지 또는 완화하기 위해 상처 위 또는 상처 내부에 적용 (applying)함으로써, 강화할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 기능화된 변형된 홍합 단백질은 상처 치료 용도로 의도된 드레싱에 적용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질을 이를 필요로 하는 인간 또는 동물에 적용함으로써, 특히 변형된 홍합 단백질을 치료할 상처에 또는 골절된 뼈에 적용함으로써, 골절을 치료하거나 또는 상처 치유를 강화하는 방법에 관한 것이다.
전술한 모든 용도 및 해당되는 모든 방법들은, ONB 보호기를 절단하여 Dopa 잔기를 노출하기 위해, 해당되는 변형된 홍합 단백질을 UV 광, 특히 360 - 370 nm, 특히 365 nm 파장의 UV 광에 의해 활성화한 후, 특히 잘 이용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7과 99% 이상, 특히 99.5% 이상 동일한, 특히 100% 동일한 서열을 가진, 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 서열번호 5를 가진 핵산은 특이적인 아미노아실-tRNA 신테타제에 의해 ONB-Dopa가 로딩되는 특이적인 tRNA에 의해 인지되는 TAG 트리플렛 (TAG triplet) 5개를 포함한다. 즉, 이들 TAG 트리플렛은 단백질 합성 중에 합성할 변형된 홍합 단백질에 ONB-Dopa를 병합하기 위해 사용된다. 즉, 이 핵산은 서열번호 1에 따른 변형된 홍합 단백질을 코딩한다. 서열번호 6을 가진 핵산은 TAG 트리플렛을 10개 포함하며; 이는 서열번호 2에 따른 변형된 홍합 단백질을 코딩한다. 서열번호 7을 가진 핵산은 TAG 트리플렛을 19개 포함하며; 이는 서열번호 3에 따른 변형된 홍합 단백질을 코딩한다. 각각의 경우에, TAG 트리플렛은 기본이 되는 비-변형된 홍합 단백질에서 티로신을 코딩하는 트리플렛을 치환한다.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 98% 이상, 특히 99% 이상, 특히 99.5% 이상 동일한, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 아미노아실-tRNA 신테타제에 관한 것이다. 일 구현예에서, 아미노아실-tRNA 신테타제는 아미노산 서열들로 구성된다. 서열번호 8에 따른 단백질은 또한 ONB-DopaRS-1으로도 지칭되며, 서열번호 9에 따른 단백질은 또한 ONB-DopaRS-2로도 지칭되며, 서열번호 10에 따른 단백질은 또한 ONB-DopaRS-3으로도 지칭된다. 이러한 아미노아실-tRNA 신테타제는 대응되는 tRNA에 ONB-Dopa를 로딩할 수 있다. 즉, 합성할 펩타이드에 ONB-Dopa를 병합하기 위해 사용하기 매우 적합하다. 아미노아실-tRNA 신테타제의 기질 결합부는 아미노산 약 30개를 포함하므로, 가능한 서열 2030
Figure pct00002
1039개가 만들어진다. 동족 tRNA에 ONB-Dopa를 로딩하는데 매우 적합한 서로 다른 (그러나 매우 유사함) 3개의 아미노아실-tRNA 신테타제를 동정한 것은, 본 발명의 발명자들에게 매우 놀라운 발견이었다.
본 발명은 일 측면에서 합성할 펩타이드에 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌을 병합하기 위한 전술한 단락에 따른 아미노아실-tRNA 신테타제의 용도에 관한 것이다. 이에, 용어 "펩타이드"는 본원에서 다이펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서, 아미노아실-tRNA 신테타제는 합성할 단백질에 ONB-Dopa를 병합하기 위한 목적으로 사용된다. 합성은 박테리아, 효모 세포, 식물 세포, 완전 식물 (whole plant) 또는 세포-프리 단백질 합성 시스템 (cell-free protein synthesis system)에서 이루어질 수 있다.
본 발명자가 알고 있는 한, 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 예를 들어 ONB-Dopa가 펩타이드 합성에 사용된 바는 없다. 본 발명은, 따라서, 펩타이드 합성에서의 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 특히 ONB-Dopa의 용도에 관한 것이다. 용어 "펩타이드" 및 적합한 합성 시스템의 의미에 대해서는 선행 단락을 참조한다.
ONB-Dopa는 입체이성질체 형태로, 즉 D 형태 및 L 형태로서 존재할 수 있다. 일 구현예에서, ONB-Dopa는 ONB-L-Dopa이다. 이러한 구현예는 ONB-Dopa가 존재하는 본원에 기술된 단백질 서열에 명확하게 적용가능하다.
ONB 기는 Dopa에 메타(m) 또는 파라 (p) 위치로 결합될 수 있다. 일 구현예에서, ONB-Dopa는 m-ONB-Dopa, 특히 m-ONB-L-Dopa이다. 이 구현예는 또한 ONB-Dopa가 존재하는 본원에 기술된 단백질 서열에 명확하게 적용가능하다.
m-ONB-L-Dopa의 화학적 구조는 식 (I)이며, UV 조사에 의해 m-ONB-L-Dopa로부터 유도될 수 있는 ONB-L-Dopa의 화학 구조는 식 (II)이:
Figure pct00003
Figure pct00004
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 설명에 따른 변형된 홍합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 제조 방법은 후술한 단계를 특징으로 한다.
먼저, 합성할 변형된 홍합 단백질을 코딩하는 유전자 변형된 핵산 서열을 제공한다. 즉, 이 변형된 핵산 서열은 천연 트리플렛 대신 하나 이상의 앰버 정지 코돈 (TAG 트리플렛)을 동일한 핵산 위치에 포함한다. 일 구현예에서, 티로신을 코딩하는 트리플렛 (TAT 또는 TAC 트리플렛)이 TAG 트리플렛으로 치환된다.
일 구현예에서, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7과 99% 이상, 특히 99.5% 이상, 특히 100% 동일한 핵산 서열이 제공될 수 있다.
이후, 주형으로서 제공된 핵산을 이용하여 단백질 합성을 수행한다. 단백질 합성은, 예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 식물 세포, 완전 식물 또는 세포-프리 단백질 합성 시스템에서 수행할 수 있다. 이에, 단백질을 합성하는데 사용되는 시스템은 특정 아미노아실-tRNA 신테타제와 대응되는 tRNA로 된 오르소고날 쌍을 포함한다. 이에, 아미노아실-tRNA 신테타제는 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기, 특히 ONB-Dopa를 해당 tRNA에 로딩할 수 있다. 이러한 기능 - 특히, ONB-Dopa가 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기로서 선택된다면 - 은, 아미노아실-tRNA 신테타제가 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 98% 이상, 특히 99% 이상, 특히 99.5% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다면, 최상으로 달성될 수 있다.
합성할 변형된 홍합 단백질에 ONB-Dopa를 병합하기 위해 사용하기 적합한 tRNA는 기존에 문헌에 기술된 tRNA이다.23 단백질 합성 시스템은 적절한 단백질 합성을 수행하기 위해 "통상적인" 아미노산 tRNA-신테타제 및 대응되는 tRNA를 더 포함할 수 있다.
합성된 변형된 홍합 단백질은 이후 아가로스 수지, 자기 비드 또는 적합한 컬럼을 사용한 방법과 같이 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 공지된 기법에 의해 정제할 수 있다. 이에, His6 태그가 정제하기 위한 목적으로 사용하는데 적합할 수 있다 (예, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16 참조).
여러가지 물질, 용도 및 방법들에 대해 기술된 모든 구현예들은 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있으며, 임의의 다른 물질, 용도 또는 방법으로 임의의 적절한 조합으로 전환될 수 있다. 즉, 물질에 대한 구현예들은 용도 및 방법으로 전환될 수 있으며, 용도 구현예는 물질 및 방법으로 전환될 수 있으며, 방법 구현예는 물질 및 용도로 전환될 수 있다.
본 발명의 측면들이 예시적인 구현예 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다. 도면에서:
도 1a는 B95.ΔA23에서 발현된 MBP-fp-5 변이체의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고;
도 1b는 m-ONB-Dopa의 존재 하에 발현된 fp-5 변이체의 NBT 염색 결과를 나타낸 것이고;
도 1c는 건조한 조건에서의 표면-코팅 분석 결과를 나타낸 것이고;
도 2는 m-ONB-Dopa의 병합 후 MBP-fp-5(5TAG)의 디콘볼루션 ESI-MS 스펙트럼 (deconvoluted ESI-MS spectrum)을 나타낸 것이고;
도 3a는 MBP-fp-5(5TAG)의 MALDI-TOF 스펙트럼이고;
도 3b는 MBP-fp-5(10TAG)의 MALDI-TOF 스펙트럼이고;
도 4a는 AFM 분석을 통해 수득한, 운모 (mica) 표면과 fp-5(5TAG)의 상호작용을 나타낸 F-D 곡선을 나타낸 것이고;
도 4b는 AFM 분석을 통해 수득한, fp-5 WT 및 fp-5(5TAG)를 가진 2개의 기능성 팁 (functionalized tip)들의 힘 값 (force value)을 나타낸 것이다.
예시적인 제1 구현예
통상적으로 공지된 수종의 보호기들을 사용해 보호된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체를 제조할 수 있으며, Dopa의 접착 특성의 시공간적인 활성화를 달성할 수 있다.
명쾌한 전략은 쉽게 이용가능한 저렴한 전구체 분자로부터 보호된 L-Dopa 유사체를 제조하기 위해 박테리아 세포의 대사를 조작하는 것을 포함한다. 이들 전구체를 아미노산으로 변환하기 위해, 새로운 조작된 페닐알라닌-암모니아 리아제 (PAL) 또는 티로신-암모니아 리아제 (TAL)를 발현하는 재조합 균주를 구축할 수 있다.
O-쌍, 예컨대 MjTyrRS에 기반한 o-쌍은 이러한 보호된 L-Dopa 유도체를 이용한 생체내 tRNA 아미노아실화를 달성하기 위해 설계된다. 탈보호는 광-노출과 같은 여러가지 방식을 통해 또는 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 산성 가수분해를 통해 달성될 수 있으며, 최종적으로 수중 접착 단백질을 수득할 수 있다.
Figure pct00005
반응식 1: 이소프로필리덴으로서 카테콜 작용기를, 토실산 (TsOH) 중에 투입된 2,2-다이메톡시프로판 (DMP)으로 보호하여, 보호된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체를 수득한다. 번역 후 수득된 펩타이드는 산성 가수분해에 의해 번역 후 탈보호하여, 접착 펩타이드를 노출시킨다.
예시적인 제2 구현예
본 구현예에서는 ONB-Dopa를 보호된 (광케이징된) 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기로서 사용하였다.
Dopa 함유율이 높은 천연 단백질에 ONB-Dopa의 멀티-부위 병합 (보다 구체적으로, ONB 기를 카테콜 모이어티의 meta 하이드록시 기에 부착시킴)이 실현가능한지를 테스트하기 위해, fp-5가 홍합의 습한 조건에서 부착하는 기능을 수행하는 주 성분이므로 이 MAP 타입 5 (fp-5)를 선택하였다. Fp-5는 Dopa 함유율이 ~30 mol%로 가장 높아, Dopa 유사체의 멀티-부위 병합을 수행하기에 특히 매력적이다. 발현 검사를 위해, 부가적인 TEV 절단부를 가진 N-말단 말토스 결합 단백질 (MBP) 및 His6 태그가 첨부된 진주담치 (M. galloprovincialis) 유래의 C-말단 fp-5 서열로 구성된 융합 구조체를 사용하였다.
새로운 ONB-Dopa-특이 aaRS (ONB-DopaRS-1, 서열번호 8)를 사용해, m-ONB-Dopa의 부위-특이적인 병합을 가능하게 하기 위해, 5곳 또는 10곳에서 티로신 코돈을 앰버 코돈으로 치환하였다. 단백질을 발현하기 위해, RF1이 제거된 E. coli BL21(DE3) 균주 유도체 B-95.ΔA23를 선택하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 따르면, m-ONB-Dopa가 fp-5(앰버 코돈 5개; 5TAG) 및 fp-5(앰버 코돈 10개; 10TAG)에 삽입된 것으로 확인된다. 그 결과는 도 1a에 나타낸다. WT MBP-fp-5 (레인 1), MBP-fp-5(5TAG) (레인 3) 및 MBP-fp-5(10TAG) (레인 5)를 TEV 프로테아제로 절단하고, fp-5 (레인 2), fp-5(5TAG) (레인 4) 및 fp-5(10TAG) (레인 6)의 불용성 분획들을 분석하였다. ONB-Dopa 함유율에 따르면, MBP-fp-5 변이체의 예상되는 분자량은 ~51-54 kDa이고, TEV 절단 후 fp-5 변이체의 경우에는 ~10-12 kDa이다.
SDS PAGE 분석에서 ONB-Dopa를 함유한 정제된 fp-5(5TAG) 및 fp-5(10TAG) 변이체의 밴드가 여러개 나타난 것은, 기존에 보고된 바와 같이, ONB의 니트로 기가 아민으로 부분 환원된 것이 이유일 수 있다.21 m-ONB-Dopa의 존재 하에 정제된 fp-5(5TAG) 또는 fp-5(10TAG) 약 ~6 mg l-1 및 ~1 mg l-1이 수득되었으며, 이와 비교해 야생형 (WT) fp-5 (Tyr 잔기 19개 함유)의 경우 ~18 mg l-1이었다.
Dopa 또는 도파퀴논 함유 단백질을 선택적으로 염색하는 레독스-사이클링 니트로 블루 테트라졸륨 (NBT, redox-cycling nitro blue tetrazolium)를22 사용함으로써, TEV 절단 후, ONB-Dopa를 함유한 fp-5(5TAG) 및 fp-5(10TAG) 변이체들의 제조 및 디케이징이 검증되었다. 광 조사 처리된 (+) Fp-5(5TAG) 및 Fp-5(10TAG) 샘플에서는 뚜렷한 염색이 관찰되었지만, 광 조사하지 않은 경우 (-)에는 발색이 거의 관찰되지 않았다 (도 1b). 이는 UV 조사에 의한 ONB-Dopa의 성공적인 디케이징을 의미한다.
Dopa-매개 부착에 대한 원리 검증 검사로서, fp-5 변이체의 표면 부착력을 건조한 조건 하에 직접 표면 코팅 분석을 이용해 검사하였다 (도 1c).11 도 1c의 상단 패널은 코마시-염색된 점들의 사진을 도시한 것이다. 동량의 소 혈청 알부민 (BSA) 및 fp-5 변이체를 폴리스티렌 표면에 365 nm에서 광 조사 (+)하거나 또는 광 조사 없이 (-) 6회 이상 스팟팅하였다. 점의 세기를 정량적으로 나타낸 도 1c의 하단 패널은 광 조사 후 부착력이 증가함을 보여준다. 데이터는 평균 ± s.d.으로 나타낸다.
수득한 데이터는 UV 조사 후 Dopa 함량 증가로 인한 폴리스티렌 표면에의 부착 증가를 나타내며, 이는 재조합 방식으로 제조된 광케이징된 홍합 단백질의 부착 가능성을 입증해준다. 요컨대, 이들 결과는, ONB-DopaRS-1이 홍합 단백질 fp-5에 ONB-Dopa를 효율적으로 멀티-부위 병합시킬 수 있으며, 따라서 접착력을 가진 광케이징된 MAP를 재조합에 의해 제조할 수 있다는 것을, 보여준다.
제조된 단백질의 특성을 질량 분석법으로 더욱 분석하였다 (도 2 및 도 3). 도 2는 ONBYRS-1을 이용해 m-ONB-Dopa를 삽입한 후 MBP-fp-5(5TAG)의 디컨볼루션 ESI-MS 스펙트럼을 도시한 것이다. 분자량 실측치 및 예상치는 다음과 같다: MBP-fp-5 (5 ONB-Dopa), 실측치: 52114.7 Da, 예상치: 52115.8 Da.
도 3a는, m-ONB-Dopa 병합, TEV 절단 및 UV 광 조사 후, MBP-fp-5(5TAG)의 MALDI-TOF 스펙트럼이고, 도 3b는 MBP-fp-5(10TAG)의 MALDI-TOF 스펙트럼이다. 분자량 실측치 및 예상치는 다음과 같다: fp-5(5 Dopa), 실측치: 9807.9 Da (M+H+), 예상치: 9807.7 Da (M+H+). fp-5(10 Dopa), 실측치: 9887.5 Da (M+H+), 예상치: 9887.7 Da (M+H+).
광케이징된 MAP의 수중 접착 가능성을 입증하기 위해, Dopa-매개 습식 부착을 실험하기 위해 사용되는 원자력 현미경 (AFM)에 기반한 힘 현미경 (force spectroscopy)을 사용하였다. 이를 위해, 2 작용성 아세탈-폴리에틸렌글리콜 (PEG)-N-하이드록시-숙신이미드 (NHS) 링커 분자24 ,25를 라이신 잔기를 통해 MAP에 공유 결합시킬 수 있다.
기능화된 AFM 팁 (functionalized AFM tip)의 힘-거리 (F-D) 커브를, UV 광 조사 전과 조사 후, 운모 표면 상에서 소듐 아세테이트 완충제 (10 mM, pH 4.6) 중에 측정하였다 (도 4a 및 4b 참조). 도 4a는 접근 및 후퇴 (retraction) 신호를 나타낸다. 도 4b는 광 조사 전 (백색 막대) 및 광 조사 후 (검정색 막대), 여러가지 fp-5 변이체 (즉, fp-5 WT, fp-5(5TAG) 및 fp-5(10TAG))로 기능화된, 2개의 팁 (a, b)들의 힘 값을 나타낸다. 데이터는 F-D 커브 100개의 평균 ± s.d.이고; 유의성은 기호로 표시한다 *p<10-3, **p<10-6, ***p<10-6. fp-5 WT의 부착 힘은 어떠한 측정에서도 UV 광 조사에 의해 유의하게 변동되지 않았지만, fp-5(5TAG) 및 fp-5(10TAG)의 경우 UV 광 노출시 부착 힘이 유의하게 증가하였다 (각각 최대 12배 또는 6.5배).
Dopa가 접착성 증가의 원인인지를 검증하기 위해, 비-변형된 팁 및 아미노-기능화된 팁을 조사하였다. 이 둘다 낮은 pN 범위의 부착성을 나타내었으며, 각 경우에 UV 광 노출에 영향을 받지 않았다. 예를 들어, m-ONB-Dopa가 5개 또는 10개 병합된 fp-5의 데이터는, Dopa-매개 접착의 시공간적인 제어 가능성 및 재조합에 의해 제조된 광케이징된 MAP의 높은 잠재성에 대해 확실한 증거를 제공해준다.
SEQUENCE LISTING <110> Technische Universitat Berlin <120> Modified mussel proteins, uses thereof and related compounds <130> TU135WO <150> EP17163362.1 <151> 2017-03-28 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 5 ONB-Dopa residues <220> <221> misc_feature <222> (5)..(36) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 1 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 2 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 10 ONB-Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 2 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Xaa Tyr Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Tyr Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 3 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 19 ONB-Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 3 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Xaa Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Xaa His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Xaa 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Xaa Gly Lys Ala Lys Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Xaa Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Xaa His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Xaa Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 4 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maltose binding protein and TEV cleavage site <400> 4 Met Ala Gly Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly 1 5 10 15 Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys 20 25 30 Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala 65 70 75 80 Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala 100 105 110 Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro 115 120 125 Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr 145 150 155 160 Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn 165 170 175 Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys 180 185 190 Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn 195 200 205 Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu 210 215 220 Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr 225 230 235 240 Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln 245 250 255 Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala 260 265 270 Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu 275 280 285 Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala 290 295 300 Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile 305 310 315 320 Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile 325 330 335 Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn 340 345 350 Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln 355 360 365 Thr Asn Ser Ser Ser Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 370 375 380 <210> 5 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 5 in-frame TAG sites <400> 5 atggccggca aaatcgaaga aggtaaactg gtaatctgga ttaacggcga taaaggctat 60 aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc gagaaagata ccggaattaa agtcaccgtt 120 gagcatccgg ataaactgga agagaaattc ccacaggttg cggcaactgg cgatggccct 180 gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt ggtggctacg ctcaatctgg cctgttggct 240 gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc cgtttacctg ggatgccgta 300 cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg aagcgttatc gctgatttat 360 aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag agatcccggc gctggataaa 420 gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc tgcaagaacc gtacttcacc 480 tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt atgaaaacgg caagtacgac 540 attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg gtctgacctt cctggttgac 600 ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact ccatcgcaga agctgccttt 660 aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg catggtccaa catcgacacc 720 agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca agggtcaacc atccaaaccg 780 ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc cgaacaaaga gctggcaaaa 840 gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg aagcggttaa taaagacaaa 900 ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt tggcgaaaga tccacgtatt 960 gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc cgaacatccc gcagatgtcc 1020 gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg ccagcggtcg tcagactgtc 1080 gatgaagccc tgaaagacgc gcagactaat tcgagctcgg gcagcgagaa cctgtacttc 1140 caaagcagcg aagaatagaa aggtggttag tatccgggta acagcaacca ttagcatagc 1200 ggtggtagct atcatggtag cggttagcat ggtggttata aaggtaaata gtatggcaaa 1260 gccaaaaaat actactacaa atacaaaaac agcgggaaat acaaatatct gaaaaaagcc 1320 cgtaaatatc atcgtaaagg ctacaaaaaa tactatggtg gcagcagcgg cagccatcat 1380 catcatcatc actaa 1395 <210> 6 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 10 in-frame TAG sites <400> 6 atggccggca aaatcgaaga aggtaaactg gtaatctgga ttaacggcga taaaggctat 60 aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc gagaaagata ccggaattaa agtcaccgtt 120 gagcatccgg ataaactgga agagaaattc ccacaggttg cggcaactgg cgatggccct 180 gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt ggtggctacg ctcaatctgg cctgttggct 240 gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc cgtttacctg ggatgccgta 300 cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg aagcgttatc gctgatttat 360 aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag agatcccggc gctggataaa 420 gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc tgcaagaacc gtacttcacc 480 tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt atgaaaacgg caagtacgac 540 attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg gtctgacctt cctggttgac 600 ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact ccatcgcaga agctgccttt 660 aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg catggtccaa catcgacacc 720 agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca agggtcaacc atccaaaccg 780 ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc cgaacaaaga gctggcaaaa 840 gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg aagcggttaa taaagacaaa 900 ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt tggcgaaaga tccacgtatt 960 gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc cgaacatccc gcagatgtcc 1020 gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg ccagcggtcg tcagactgtc 1080 gatgaagccc tgaaagacgc gcagactaat tcgagctcgg gcagcgagaa cctgtacttc 1140 caaagcagcg aagaatagaa aggtggttag tatccgggta acagcaacca ttagcatagc 1200 ggtggtagct atcatggtag cggttagcat ggtggttata aaggtaaata gtatggcaaa 1260 gccaaaaaat actagtacaa atagaaaaac agcgggaaat acaaatagct gaaaaaagcc 1320 cgtaaatatc atcgtaaagg ctagaaaaaa tactagggtg gcagcagcgg cagccatcat 1380 catcatcatc actaa 1395 <210> 7 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 19 in-frame TAG sites <400> 7 atggccggca aaatcgaaga aggtaaactg gtaatctgga ttaacggcga taaaggctat 60 aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc gagaaagata ccggaattaa agtcaccgtt 120 gagcatccgg ataaactgga agagaaattc ccacaggttg cggcaactgg cgatggccct 180 gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt ggtggctacg ctcaatctgg cctgttggct 240 gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc cgtttacctg ggatgccgta 300 cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg aagcgttatc gctgatttat 360 aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag agatcccggc gctggataaa 420 gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc tgcaagaacc gtacttcacc 480 tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt atgaaaacgg caagtacgac 540 attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg gtctgacctt cctggttgac 600 ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact ccatcgcaga agctgccttt 660 aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg catggtccaa catcgacacc 720 agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca agggtcaacc atccaaaccg 780 ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc cgaacaaaga gctggcaaaa 840 gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg aagcggttaa taaagacaaa 900 ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt tggcgaaaga tccacgtatt 960 gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc cgaacatccc gcagatgtcc 1020 gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg ccagcggtcg tcagactgtc 1080 gatgaagccc tgaaagacgc gcagactaat tcgagctcgg gcagcgagaa cctgtacttc 1140 caaagcagcg aagaatagaa aggtggttag tagccgggta acagcaacca ttagcatagc 1200 ggtggtagct agcatggtag cggttagcat ggtggttaga aaggtaaata gtagggcaaa 1260 gccaaaaaat agtagtagaa atagaaaaac agcgggaaat agaaatagct gaaaaaagcc 1320 cgtaaatagc atcgtaaagg ctagaaaaaa tagtagggtg gcagcagcgg cagccatcat 1380 catcatcatc actaa 1395 <210> 8 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ONB-Dopa aminoacyl-tRNA synthetase 1 <400> 8 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Ile Leu Ala Asp Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Ala Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ala His 145 150 155 160 Tyr Met Gly Val Asp Val Asn Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Gln Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ONB-Dopa aminoacyl-tRNA synthetase 2 <400> 9 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ser 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Ile Leu Ala Asp Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Ala Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Gly His 145 150 155 160 Tyr Met Gly Ala Asp Val Asn Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Gln Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ONB-Dopa aminoacyl-tRNA synthetase 3 <400> 10 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ser 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Ile Leu Ala Asp Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Ala Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Gly His 145 150 155 160 Tyr Met Gly Val Asp Val Ser Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Gln Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Gln Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 11 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 5 ONB-Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(36) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 11 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75 <210> 12 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 10 ONB-Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 12 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Xaa Tyr Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Tyr Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75 <210> 13 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 19 ONB-Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is ortho-nitrobenzyl-3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 13 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Xaa Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Xaa His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Xaa 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Xaa Gly Lys Ala Lys Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Xaa Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Xaa His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Xaa Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75 <210> 14 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 5 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(36) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 14 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 15 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 10 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 15 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Xaa Tyr Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Tyr Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 16 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 19 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 16 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Xaa Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Xaa His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Xaa 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Xaa Gly Lys Ala Lys Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Xaa Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Xaa His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Xaa Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser His His His 65 70 75 80 His His His <210> 17 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 5 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(36) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 17 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75 <210> 18 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 10 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 18 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Xaa Tyr Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Tyr Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75 <210> 19 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Contains 19 photocaged Dopa residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(71) <223> Xaa is a photocaged 3,4-dihydroxyphenylalanine <400> 19 Ser Ser Glu Glu Xaa Lys Gly Gly Xaa Xaa Pro Gly Asn Ser Asn His 1 5 10 15 Xaa His Ser Gly Gly Ser Xaa His Gly Ser Gly Xaa His Gly Gly Xaa 20 25 30 Lys Gly Lys Xaa Xaa Gly Lys Ala Lys Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Xaa Lys Xaa Leu Lys Lys Ala Arg Lys Xaa His Arg 50 55 60 Lys Gly Xaa Lys Lys Xaa Xaa Gly Gly Ser Ser Gly Ser 65 70 75

Claims (17)

  1. 변형된 홍합 접착 단백질 (modified mussel adhesive protein)로서,
    카테콜 모이어티의 하이드록시 기 하나 이상에 보호기를 포함하는 광케이징된 (photocaged) 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 하나 이상을 포함하고,
    상기 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기가 천연 아미노산을 치환하며,
    상기 보호기가 UV 광 조사에 의해 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기로부터 절단될 수 있는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    변형된 fp-5 단백질인 것을 특징으로 하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기가 티로신 잔기를 치환하는 것을 특징으로 하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체 잔기가 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌 잔기인 것을 특징으로 하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19에 대해 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    제5항 또는 제6항에 정의된 아미노산 서열의 N-말단에 융합되는 서열번호 4와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 홍합 접착 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 변형된 홍합 접착 단백질의, 시험관내 생분해성 접착제 (biodegradable glue)로서의 용도.
  9. 표면을 변형된 홍합 단백질에 공유 결합된 기능성 물질 (functional entity)로 시험관내에서 코팅하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 변형된 홍합 접착 단백질의, 용도.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 기능성 물질이 항미생물 특성을 발휘하는 것을 특징으로 하는, 용도.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    외과 (surgery)에서 또는 테라피 (therapy)에서, 특히 생분해성 접착제로서 사용하기 위한 것인, 변형된 홍합 접착 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    골절 치료 또는 상처 치유를 강화하는데 사용하기 위한 것인, 변형된 홍합 접착 단백질.
  13. 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7과 99% 이상 동일한 서열을 가진, 제7항에 따른 변형된 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산.
  14. 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 아미노아실-tRNA 신테타제 (aminoacyl-tRNA synthetase).
  15. 합성할 펩타이드에 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌을 병합함에 있어, 제14항에 따른 아미노아실-tRNA 신테타제의 용도.
  16. 펩타이드 합성에서, 카테콜 모이어티의 하이드록시 잔기 하나 이상에 UV 광 조사에 의해 절단가능한 보호기를 포함하는 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체의, 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 광케이징된 3,4-다이하이드록시페닐알라닌 유도체가 오르토-니트로벤질-3,4-다이하이드록시페닐알라닌인 것을 특징으로 하는, 용도.
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