WO2019176339A1 - バイオセンサプローブ用保護膜材料 - Google Patents

バイオセンサプローブ用保護膜材料 Download PDF

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WO2019176339A1
WO2019176339A1 PCT/JP2019/002802 JP2019002802W WO2019176339A1 WO 2019176339 A1 WO2019176339 A1 WO 2019176339A1 JP 2019002802 W JP2019002802 W JP 2019002802W WO 2019176339 A1 WO2019176339 A1 WO 2019176339A1
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poly
probe
protective film
vinylpyridine
glucose
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太志 遠藤
純子 池田
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Ｐｈｃホールディングス株式会社
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    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels

Definitions

  • the present disclosure relates to a membrane material for protecting a probe constituting a biosensor. More specifically, a protective film polymer material capable of preventing the outflow of enzymes and mediators constituting a biosensor probe inserted into the body is provided.
  • a biosensor is a system that measures a substance by utilizing or imitating the molecular recognition ability of a living body. For example, one of a combination of enzyme-substrate, antigen-antibody, hormone-receptor, etc., is a specimen (substance to be measured). ), And the other as a receptor, the chemical change generated by the molecular recognition reaction between the specimen and its receptor is converted into an electrical signal by a transducer, and the specimen is analyzed according to the strength of the obtained electrical signal. It is a measuring device which measures the quantity of.
  • biomolecules used in biosensors include genes, sugar chains, lipids, peptides, cells, tissues and the like.
  • biosensors using enzymes have been most developed, and a typical example is a glucose sensor using glucose oxidase (GOx).
  • the electrochemical glucose sensor used for self-blood glucose measurement generally has a structure in which a cover is disposed on an insulating substrate having an electrode formed on the surface thereof via a spacer. Reagents including an analyte responsive enzyme, a redox mediator (electron carrier), and the like are disposed on the electrode, and this portion serves as an analysis unit. One end of a flow channel for introducing blood is communicated with the analysis unit, and the other end of the flow channel is open to the outside, which serves as a blood supply port. For example, blood glucose level measurement using such a sensor is performed as follows. That is, first, the sensor is set in a dedicated measuring device (meter).
  • the fingertip or the like is injured with a lancet to cause bleeding, and the blood supply port of the sensor is brought into contact therewith.
  • the blood is sucked into the flow path of the sensor by capillary action, and is introduced into the analysis section through this, where it comes into contact with the reagent.
  • the analyte-responsive enzyme E eg, GOx, GDH
  • Redox mediator M accepts electrons generated by oxidation.
  • the redox mediator M reduced by accepting electrons is electrochemically oxidized at the electrode. From the magnitude of the current value and the amount of charge obtained by oxidation of the reductant redox mediator M, the glucose concentration in the blood, that is, the blood glucose level is easily detected.
  • Such an electrochemical blood glucose sensor plays an important role in blood glucose level management in the treatment of diabetes, and a diabetic patient can perform appropriate insulin administration and dietary restriction based on the blood glucose level.
  • blood glucose must be measured several times a day, and blood sampling each time can be painful for the patient, so maintain quality of life (QOL) It was difficult.
  • the body 10 of the implantable amperometric glucose sensor 1 is attached to the living body 2 and the probe portion 11 is inserted into the living body to continuously measure the blood glucose level (FIGS. 1 and 2). Thereby, a blood glucose level can be measured over a long time without collecting blood each time.
  • telemedicine can also be used for telemedicine combining videophones, e-mails, social networking services and other information communication devices as long as the parties can be confirmed to be doctors and patients. If useful information about the patient's mental and physical condition that can be substituted for face-to-face medical care is available, it would not immediately violate Article 20 etc. of the Medical Doctor Law.
  • This 2017 notification will further develop telemedicine using information and communication equipment. Therefore, the demand for embedded sensors is expected to increase.
  • Patent Document 1 discloses an electrochemical sensor control device that is attached to a patient and inserted into a skin using a wireless transmitter, and transmits data related to the collected specimen amount to a display device using the wireless transmitter. The technology is described. Patent Document 1 also discloses a film containing a heterocyclic nitrogen group such as vinylpyridine attached to such an electrochemical sensor. These membranes limit analyte diffusion to the working electrode in the electrochemical sensor. In a glucose sensor without a membrane, the flow rate of glucose to the sensing layer increases linearly with the glucose concentration, and while all the glucose that reaches the sensing layer is consumed, the measured output signal is the glucose flow rate. However, if glucose consumption is limited in the sensing layer, the measurement signal is not linearly proportional to glucose flow or concentration and saturation occurs.
  • a heterocyclic nitrogen group such as vinylpyridine
  • Patent Document 1 a technique for preventing saturation of the sensor by forming a diffusion limiting film containing a heterocyclic nitrogen group such as polyvinyl pyridine on the detection layer and reducing the flow rate of glucose to the detection layer. Is adopted.
  • Patent document 2 discloses a diffusion barrier comprising a single block copolymer having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block, which, like patent document 1, is an enzyme from outside the electrode system. It controls the diffusion of analytes into the molecule.
  • Such enzyme molecules are immobilized on the electrode to form an enzyme layer.
  • the enzyme layer can be more firmly fixed by immobilizing the enzyme on the working electrode by adsorption or capture and crosslinking with glutaraldehyde or the like. .
  • the implantable sensor inserts its probe into the body for a long time, the chance of the component-responsive enzyme and redox mediator, which are constituent elements, to flow out increases. If the analyte-responsive enzyme or redox mediator flows out of the sensor, the sensor sensitivity is not only deteriorated, but also harms the living body. In addition, if the analyte-responsive enzyme or redox mediator flows out, the durability of the sensor also decreases. Therefore, it is very important to take measures to prevent the specimen-responsive enzyme and redox mediator from flowing out.
  • both the analyte-responsive enzyme and the redox mediator constituting the probe of the implantable biosensor are immobilized to prevent outflow, the combination of the enzyme and mediator polymer that can be used and the structure of the sensor are limited. . Therefore, it is desired to develop a film that can be formed on a detection layer containing an enzyme and / or a redox mediator to prevent the enzyme and the redox mediator from flowing out. Also, such a membrane should not inhibit the entry of a sample such as glucose into the inside. Therefore, the present disclosure provides a protective film that does not inhibit the entry of the specimen into the interior and prevents the enzyme and redox mediator from flowing out to be applied to the probe of the implantable biosensor. Let it be an issue.
  • the present disclosure includes, as a membrane structure useful for a probe of a biosensor, a detection layer including at least an analyte-responsive enzyme and a redox mediator, and a protective film formed on the detection layer, Formula (1):
  • R represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms
  • p and q each represents a repeating unit of two types of monomer units: 4-vinylpyridine, C 1-15 alkyl methacrylate
  • w represents Represents the number average molecular weight.
  • the diagonal lines between the monomers indicate that the three types of monomer units are not in the order of description in the formula, but are bonded randomly if the bias due to the reactivity between the monomer units is excluded.
  • the polymer represented by the formula (1) is a block copolymer composed of poly (4-vinylpyridine) and poly (C 1-15 alkyl methacrylate), and the 4-vinylpyridine constituting poly (4-vinylpyridine)
  • the repeating unit p of the alkyl methacrylate constituting the repeating unit p and the poly (C 1-15 alkyl methacrylate) has a number average molecular weight of each block constituting the polymer of 50 to 200 ⁇ 10 3 , preferably 60 to What is necessary is just to determine so that it may be 100x10 ⁇ 3 >.
  • C 1-15 alkyl poly represents an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, e.g., methyl group, ethyl group, propyl group, Examples thereof include butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group and isomers thereof, preferably C 3- 6 is an alkyl group.
  • the polymer represented by the formula (2) is advantageous for improving biocompatibility, is a random copolymer having 4-vinylpyridine and 2-hydroxyethyl methacrylate as monomer units, and has a mole of 4-vinylpyridine.
  • the fraction s is 40 to 80, preferably 60 to 70, and the molar fraction t of 2-hydroxyethyl methacrylate is 20 to 60, preferably 30 to 40, and the sum of s and t is 100. If it is, it may not be an integer.
  • the number average molecular weight of the polymer is 20 to 500 ⁇ 10 3 , preferably 60 to 300 ⁇ 10 3 .
  • the polymer may be crosslinked with a crosslinking agent such as polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE).
  • a crosslinking agent such as polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE).
  • the protective film may further contain, for example, poly (2-methoxyethyl acrylate) as an additive. Thereby, the biocompatibility of a protective film improves.
  • a protective film is formed using the protective film polymer of the present disclosure on the detection layer containing the enzyme or mediator that constitutes the probe of the implantable biosensor, it prevents the sample such as glucose from entering the inside. In addition, it is possible to prevent the enzymes and mediators contained in the detection layer from flowing out.
  • FIG. 1 Schematic which shows the state by which the implantable biosensor was attached to the biological body (human body). Sectional drawing which shows the implantable biosensor of the state attached to the biological body (human body). Schematic of an implantable biosensor that wirelessly communicates measurement data with a smartphone.
  • a manufacturing process of an implantable biosensor probe according to one specific example of the present disclosure A manufacturing process of an implantable biosensor probe according to one specific example of the present disclosure.
  • Sectional drawing in the C-C 'cutting line in FIG. The graph which shows the glucose response characteristic of the probe which used the copolymer or copolymer mixture of this indication for the protective film.
  • the graph which shows the glucose response characteristic of the probe which used the polymer of the reference example for the protective film, and the probe which used the conventional polymer for the protective film The graph which shows the durability of the probe which used the polymer of the reference example for the protective film, and the probe which used the conventional polymer for the protective film.
  • Method for Producing Implantable Biosensor Probe A method for producing the probe 11 of the implantable biosensor 1 of a specific example to which the membrane structure of the present disclosure is applied will be described.
  • the structure and manufacturing method described below are one specific example of the present disclosure, and are not limited to the configurations described below as long as they can be used as probes.
  • the implantable biosensor 1 includes a main body 10 and a probe 11, and the probe 11 is generally used for electrical connection with a sensing portion to be inserted into a living body and an internal circuit of the biosensor main body 10. It is a key shape consisting of a terminal part.
  • the sensing part is thinly formed so as to be inserted into the body, and the terminal part has a certain size so as to be inserted into the biosensor body 10 to form an electrical connection. Therefore, first, a key-shaped insulating substrate 111 is prepared (FIG. 4a).
  • the top view shows a top view seen from the front side, and the bottom shows a top view seen from the back side (hereinafter the same).
  • the insulating substrate 111 is not particularly limited as long as it is a material and thickness that can be used as a probe inserted into a living body, and for example, polyethylene terephthalate (PET) having a thickness of about 200 ⁇ m can be used.
  • PET polyethylene terephthalate
  • a conductive metal material selected from the group consisting of metals such as carbon, gold, silver, platinum or palladium is formed on both surfaces of the insulating substrate 111 by sputtering, vapor deposition, ion plating, etc.
  • a conductive thin film 112 is formed by depositing (FIG. 4b). The preferred thickness of the conductive thin film is 10 nm to several hundred nm.
  • Electrode Lead A groove 113 having a depth reaching the surface of the insulating substrate 111 is formed by drawing a laser on the conductive thin film 112 formed on the front side of the insulating substrate 111, and the working electrode lead 112a is referred to. Separated into electrode leads 112b for electrical insulation (FIG. 5c).
  • An insulating resist film 116a having an opening is formed on the portion by sputtering, screen printing, or the like, and a region used as a counter electrode 117a for electrically connecting the counter electrode 117 and the main body 10 on the back side of the insulating substrate 111
  • An insulating resist film 116b having an opening is formed by a sputtering method, a screen printing method, or the like (FIG. 5d).
  • a preferable thickness of the insulating resist film is 5 to 40 ⁇ m.
  • Formation of Reference Electrode Ag / AgCl is deposited by the screen printing method or the ink jet method on the reference electrode opening of the resist film 116a formed on the front side of the insulating substrate 111 to form the reference electrode 115 (FIG.
  • analyte responsive enzyme means a biochemical substance that can specifically catalyze the oxidation or reduction of an analyte. Any biochemical substance may be used as long as it can be used for the detection purpose of the biosensor.
  • suitable sample-responsive enzymes include glucose oxidase (GOx) and glucose dehydrogenase (GDH).
  • the “redox mediator” means a redox substance that mediates electron transfer, and is responsible for transmission of electrons generated by a redox reaction of a specimen (analyte) in a biosensor.
  • a specimen analyte
  • phenazine derivatives and the like are included, but the present invention is not limited to this, and any redox substance may be used as long as it can be used for biosensor detection purposes.
  • the preferred thickness of the sensing layer is 5 to 80 ⁇ m.
  • the sensing portion is immersed in a solution containing the protective film polymer to form the protective film 119 on both sides, side surfaces, and the tip of the sensing portion (FIG. 6g).
  • the protective film 119 covers at least the working electrode 114, the reference electrode 115, the counter electrode 117, and the detection layer 118 without covering the working electrode terminal 114a, the reference electrode terminal 115a, and the counter electrode terminal 117a. It is formed longer than the length to be inserted.
  • the preferred thickness of the protective film is 5 to 200 ⁇ m.
  • FIG. 8 shows a cross-sectional view taken along the line A-A ′ of FIG.
  • Conductive thin films 112 are formed on both sides of the insulating substrate 111.
  • the conductive thin film 112 on the front side is separated into two leads, a working electrode lead 112a and a reference electrode lead 112b, by a groove 113, and is electrically insulated.
  • a part of the working electrode lead 112a functions as the working electrode 114, and the detection layer 118 is formed on the working electrode 114.
  • a reference electrode 115 is formed in the opening of the insulating resist film 116a and is electrically connected to the reference electrode lead 112b.
  • the conductive thin film 112 on the back side serves as a counter electrode lead 112c, and a part thereof functions as the counter electrode 117.
  • FIG. 9 shows a cross-sectional view taken along the line B-B ′ of FIG.
  • a working electrode 114 is formed on the front side of the insulating substrate 111, a detection layer 118 is formed thereon, and a counter electrode 117 is formed on the back side. Furthermore, it can be seen that the entire periphery of the sensing portion is covered with the protective film 119 of the present disclosure.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view taken along the line C-C ′ of FIG.
  • a working electrode lead 112a and a reference electrode lead 112b electrically separated by the groove 113 are formed on the front side of the insulating substrate 111, and an insulating resist film 116a is formed thereon.
  • a reference electrode 115 is formed in the opening of the insulating resist film 116a.
  • a counter electrode lead 112c is formed on the back side of the substrate 111, and an insulating resist film 116b is formed thereon. Furthermore, it can be seen that the entire periphery of the sensing portion is covered with the protective film 119 of the present disclosure.
  • Example 1 ⁇ Preparation of probe> (1) Preparation of Insulating Substrate As shown in FIG. 5a, polyethylene terephthalate (PET) (Lumirror R E20 # 188; 189 ⁇ m thickness, manufactured by Toray Industries, Inc.) was cut to prepare a key-shaped insulating substrate.
  • PET polyethylene terephthalate
  • a conductive thin film (thickness 30 nm) was formed on both surfaces of the insulating substrate by depositing gold by sputtering.
  • a groove having a depth reaching the surface of the insulating substrate is formed by drawing a laser on a conductive thin film formed on the front side of the insulating substrate, thereby forming a working electrode lead. And separated into a reference electrode lead and electrically separated.
  • an insulating resist film having an opening is formed by screen printing in a portion excluding a region used as a terminal, and a portion excluding a region used as a counter electrode and a counter electrode terminal for electrical connection to the back side of the insulating substrate
  • An insulating resist film (thickness: 10-15 ⁇ m) having an opening was formed by screen printing.
  • sensing layer As shown in FIG. 6f, the conductive thin film exposed from the opening of the insulating resist film formed on the front side of the insulating substrate is used as a working electrode, and carbon particles are formed thereon as conductive particles.
  • glucose oxidase GOx
  • a phenazine derivative as a redox mediator
  • the sensing portion is immersed in an ethanol solution containing a crosslinking agent and a protective film polymer, and a protective film (thickness 5- 40 ⁇ m) was formed. More specifically, formula (3):
  • Probe A was attached to an implantable amperometric glucose sensor, and the probe was placed in 37 ° C. phosphate buffered saline (PBS, pH 7). Glucose was added to this PBS solution every 50 seconds at 50, 100, 200, 300, 400, and 500 mg / dL, and the current response value (nA) was continuously measured. When the glucose concentration was 0 to 500 mg / dL, high linearity was exhibited and the glucose responsiveness was good. The results are shown in FIG. 11 and summarized in Table 2.
  • Probe A was stored in phosphate buffered saline (PBS, pH 7) at 37 ° C. Before storage (day 0) and 7 days after storage, probe A was attached to an implantable amperometric glucose sensor, and the probe was placed in 37 ° C. phosphate buffered saline (PBS, pH 7). Glucose was added to this PBS solution every 50 seconds at 50, 100, 200, 300, 400, and 500 mg / dL, and the current response value (nA) was continuously measured. The response rate (%) at each concentration was calculated with the current response value at the glucose concentration of 500 mg / dL on day 0 as 100%. The response characteristics on the 7th day after storage showed high linearity at glucose concentrations of 0 to 500 mg / dL, almost no change from the 0th day, and the durability was good. The results are shown in FIG. 12 and summarized in Table 2.
  • Example 2 ⁇ Preparation of probe>
  • a probe was prepared in the same manner as in Example 1 except that the protective film polymer was changed and the number of immersions in the crosslinking agent solution was increased.
  • a protective film was formed and probe C was obtained in the same manner as in Example 1 except that the film was immersed 9 times at intervals.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 1.
  • a protective film was formed and probe D was obtained in the same manner as in Example 1 except that the film was immersed 9 times at intervals.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 1.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 3.
  • solvent ethanol 95%
  • 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (10 mM, pH8) 5%
  • the probe produced above was immersed eight times at 10 minute intervals. After that, by drying at room temperature for 48 hours, a crosslinked protective film was formed, and Probe H was obtained.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 5.
  • poly (4-vinylpyridine-ran-2-hydroxyethyl methacrylate) represented by formula (6) [random copolymer (6)] 800 mg, polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE) ( Mn 1000) 62 mg dissolved in 1 mL of solvent (ethanol 95%, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (10 mM, pH8) 5%)
  • solvent ethanol 95%
  • the probe produced above was immersed eight times at 10 minute intervals. Thereafter, by drying at room temperature for 48 hours, a crosslinked protective film was formed, and Probe I was obtained.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 5.
  • poly (4-vinylpyridine-ran-2-hydroxyethyl methacrylate) represented by formula (5) [random copolymer (5)] 400 mg and poly (4-vinyl represented by formula (6) Pyridine-ran-2-hydroxyethyl methacrylate) [Random copolymer (6)] 400 mg, Polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE) (Mn 1000) 62 mg as solvent (ethanol 95%, 4- (2- The probe produced above was immersed 8 times at 10-minute intervals in a solution of 1 mL of hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (10 mM, pH 8) 5%). Thereafter, by drying at room temperature for 48 hours, a crosslinked protective film was formed, and Probe J was obtained.
  • the conditions for forming the protective film are summarized in Table 5.
  • the membrane structure including a detection layer containing at least an analyte-responsive enzyme and a redox mediator and a protective film formed on the detection layer according to the present disclosure is useful as a probe for an implantable biosensor.

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Abstract

本発明は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用な膜構造体として、検体応答性酵素を含む検知層と、前記検知層上に形成した保護膜と、を備え、前記保護膜は架橋剤およびポリ(スチレンran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)および、ポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)またはポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)を含む、膜構造体を用いる。

Description

バイオセンサプローブ用保護膜材料
　本開示は、バイオセンサを構成するプローブを保護するための膜材料に関する。より詳しくは、体内に挿入されるバイオセンサプローブを構成する酵素やメディエータの流出を防止することができる保護膜用ポリマー材料が提供される。
　バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用あるいは模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素－基質、抗原－抗体、ホルモン－レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として、検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。
　バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは最も開発が進んでおり、その代表例が、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）を用いたグルコースセンサである。
　自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。
　このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。
　すでに埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ部分11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。
　厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。
　特許文献１は、無線送信機を使用して、患者に取り付けて皮膚に挿入する電気化学センサ制御装置を開示し、無線送信機を使用して、収集した検体量に関するデータを表示装置に伝送する技術を記載している。また、特許文献１は、このような電気化学センサに取り付けるビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む膜も開示する。これらの膜は、電気化学センサ中の作用電極への検体の拡散を制限する。膜を有さないグルコースセンサでは、グルコースの検知層への流量がグルコース濃度とともに直線的に増加し、検知層に到達する全てのグルコースが消費されるうちは、測定される出力信号はグルコースの流量に線形比例するが、グルコースの消費が検知層中で制限された場合、測定信号はグルコースの流量または濃度に線形比例せず、飽和が起こる。そこで、特許文献１では、ポリビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む拡散制限膜を検知層上に形成して、グルコースの検知層への流量を減少させることによって、センサの飽和を防止する技術を採用している。
　特許文献２は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する単一のブロックコポリマーを含む拡散バリアを開示し、この拡散バリアは特許文献１と同様に、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御するものである。また、このような酵素分子は、電極に固定化され酵素層を形成する。このような酵素層の製造は、例えば、特許文献３に開示されているように、作用電極に吸着や捕捉によって酵素を固定化し、グルタルアルデヒドなどで架橋することによってより強固に固定することができる。
特表第２０１０－５１７０５４号明細書 特表第２０１５－５１５３０５号明細書 国際公開第２００７／１４７４７５号
　埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。
　埋め込み型バイオセンサのプローブを構成する検体応答性酵素およびレドックスメディエータの双方を固定化して流出を防止しようとすれば、用いることができる酵素およびメディエータポリマーの組合せや、センサの構造が限定されてしまう。したがって、酵素および／またはレドックスメディエータを含む検知層の上に形成して、酵素およびレドックスメディエータが外部へ流出することを防止できる膜の開発が望まれる。また、このような膜は、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害するものであってはならない。そこで、本開示では、埋め込み型バイオセンサのプローブに適用するために、検体の内部への侵入は阻害せず、かつ、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出を防止する保護膜を提供することを課題とする。
　本開示は、バイオセンサのプローブに有用な膜構造体として、少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、
式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒは、炭素数１～１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)；または
式（１）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)と、
式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、を含むコポリマー混合物を含む膜構造体を提供する。なお、式中、モノマー間の斜線は、３種のモノマー単位が式中の記載順ではなく、モノマー単位間の反応性に起因する偏りを除外すれば無秩序に結合することを示している。
　前記式（１）で示されるポリマーは、ポリ(4-ビニルピリジン)およびポリ(C1-15アルキルメタクリレート)からなるブロックコポリマーであり、ポリ(4-ビニルピリジン)を構成する4-ビニルピリジンの繰り返し単位pおよびポリ(C1-15アルキルメタクリレート)を構成するアルキルメタクリレートの繰り返し単位ｑは、それぞれ、前記ポリマーを構成する各ブロックの数平均分子量が、５０～２００×１０３、好ましくは６０～１００×１０３であるように定めればよい。
　前記式（１）で示されるポリマー中、ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)のC1-15アルキルは、炭素数１～１５のアルキル基を表し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基およびそれらの異性体が挙げられ、好ましくは、C3-6アルキル基である。
　前記式（２）で示されるポリマーは、生体適合性を向上するためには有利であり、4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートをモノマー単位とするランダムコポリマーであり、4-ビニルピリジンのモル分率sは４０～８０、好ましくは６０～７０、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率tは２０～６０、好ましくは３０～４０であって、sおよびtの合計が１００になるように定めれば、整数でなくてもよい。また、前記ポリマーの数平均分子量は、２０～５００×１０３、好ましくは６０～３００×１０３である。
　上記ポリマーは、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよい。
　前記保護膜は、添加剤として、例えば、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有してもよい。これにより、保護膜の生体適合性が向上する。
　埋め込み型バイオセンサのプローブを構成する酵素やメディエータを含む検知層の上に、本開示の保護膜用ポリマーを用いて保護膜を形成すれば、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害せず、かつ、検知層に含まれる酵素やメディエータが外部に流出することを防止することができる。
埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。 生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。 スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。 本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。 図７におけるA-A’切断線での断面図。 図８におけるB-B’切断線での断面図。 図８におけるC-C’切断線での断面図。 本開示のコポリマーまたはコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。 本開示のコポリマーまたはコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。 比較例のポリマーを保護膜に用いたプローブおよび従来のポリマーを保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。 比較例のポリマーを保護膜に用いたプローブおよび従来のポリマーを保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。 参考例のポリマーを保護膜に用いたプローブおよび従来のポリマーを保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。 参考例のポリマーを保護膜に用いたプローブおよび従来のポリマーを保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
　本開示の膜構造体を適用するある具体例の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、プローブとして用いることができれば、下記した構成に限定されるものではない。
（１）絶縁性基板の準備
　埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
（２）導電性薄膜の形成
　絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜112を形成する（図４ｂ）。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm～数百nmである。
（３）電極リードの形成
　絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極リード112aと参照電極リード112bに分離して電気的絶縁する（図５ｃ）。
（４）絶縁性レジスト膜の形成
　絶縁性基板111の表側に、作用電極114および参照電極115ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子114aおよび参照電極用端子115aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極117および本体10と電気接続するための対極用端子117aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116bを形成する（図５ｄ）。絶縁性レジスト膜の好ましい厚さは、5～40 μmである。
（５）参照電極の形成
　絶縁性基板111の表側に形成したレジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により堆積させて、参照電極115を形成する（図５ｅ）。参照電極の好ましい厚さは、5～40 μmである。
（６）検知層の形成
　作用電極114の上に、カーボン粒子などの導電性粒子の懸濁液、検体応答性酵素の水溶液およびレドックスメディエータの水溶液を塗布乾燥して、導電性粒子、検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層118を形成する（図６ｆ）。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素(Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。検知層の好ましい厚さは、5～80 μmである。
（７）保護膜の形成
　センシング部分を、保護膜用ポリマーを含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜119を形成する（図６ｇ）。保護膜119は、作用電極用端子114a、参照電極用端子115aおよび対極用端子117aを被覆することなく、少なくとも、作用電極114、参照電極115、対極117および検知層118を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5～200 μmである。
２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
　本開示の膜構造体を適用する埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造をさらに説明する。
　図７のA-A’切断線での断面図を図８に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜112が形成されている。表側の導電性薄膜112では、溝113によって作用電極リード112aと参照電極リード112bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード112aの一部が作用電極114として機能し、作用電極114上に検知層118が形成されている。また、絶縁性レジスト膜116aの開口部分に参照電極115が形成されて、参照電極リード112bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜112は対極リード112cとなり、その一部が対極117として機能する。
　図８のB-B’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の表側に作用電極114が形成され、その上に検知層118が形成され、裏側に対極117が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
　図８のC-C’切断面での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側に、溝113で電気的に分離された作用電極リード112aと参照電極リード112bとが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116aが形成されている。絶縁性レジスト膜116aの開口部に参照電極115が形成されている。基板111の裏側に対極リード112cが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
　図５ａに示すように、ポリエチレンテレフタレート (PET)（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を裁断して、鍵形状の絶縁性基板を準備した。
（２）導電性薄膜の形成
　図５ｂに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。
（３）電極リードの形成
　図５ｃに示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。
（４）絶縁性レジスト膜の形成
　図５ｄに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜（厚さ10-15 μm）をスクリーン印刷法により形成した。
（５）参照電極の形成
　図５ｅに示すように、絶縁性基板の表側に形成したレジスト膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ10-15 μm）を形成した。
（６）検知層の形成
　図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁性レジスト膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、導電性粒子としてカーボン粒子の懸濁液、グルコースに対する検体応答性酵素としてグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）の水溶液およびレドックスメディエータとしてフェナジン誘導体の水溶液を適量塗布し乾燥して、検知層（厚さ15 μm）を形成した。
（７）保護膜の形成
　図６ｇに示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
　より具体的には、式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］600 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で６回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブAを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブAを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサに取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、100、200、300、400、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値 (nA)を測定した。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。
［耐久性］
　プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管前(0日目)および保管後7日目に、プローブAを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサに取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、100、200、300、400、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値 (nA)を測定した。0日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。
［実施例２］
＜プローブの作製＞
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、実施例１において、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］600 mgの代わりに、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］300 mgおよび式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（４）］300 mgを用いた溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した以外は、実施例１と同様に、保護膜を形成して、プローブBを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブBのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。
［耐久性］
　プローブBの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて直線性を維持し、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。
［実施例３］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、実施例１において、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］600 mgの代わりに、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］300 mgおよび式（５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.2) ［ランダムコポリマー（５）］300 mgを用いた溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した以外は、実施例１と同様に、保護膜を形成し、プローブCを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブCのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。
［耐久性］
　プローブCの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて直線性を維持し、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。
［実施例４］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、実施例１において、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］600 mgの代わりに、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］300 mgおよび式（６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.6) ［ランダムコポリマー（６）］300 mgを用いた溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した以外は、実施例１と同様に、保護膜を形成し、プローブDを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブDのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。
［耐久性］
　プローブDの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて直線性を維持し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。
［比較例１］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、式（３）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（３）］300 mgおよびポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）［P4VP］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブEを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブEのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。
［耐久性］
　プローブEの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度500 mg/dLでも48%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。
［比較例２］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、ポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）［P4VP］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブFを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブFのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。
［耐久性］
　プローブFの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度100 mg/dLを超えると22%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。
［参考例１］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、式（４）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（４）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で１２回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブGを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブGのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。
［耐久性］
　プローブGの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると46%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。
［参考例２］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、式（５）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) ［ランダムコポリマー（５）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブHを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブHのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。
［耐久性］
　プローブHの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると25%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。
［参考例３］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（６）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブIを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブIのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。
［耐久性］
　プローブIの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると32%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。
［参考例４］
　保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
　より具体的には、式（５）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) ［ランダムコポリマー（５）］400 mgおよび式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（６）］400 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブJを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
　プローブJのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　グルコース濃度0～500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。
［耐久性］
　プローブJの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
　保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると30%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本開示の保護膜用ポリマーを用いた保護膜をプローブのセンシング部分に用いれば、グルコース応答性は良好で、かつ、従来のポリマーと比較して、耐久性が向上することが確認された。
　本開示の少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用である。
１　　　　埋め込み型バイオセンサ
１０　　　本体
１１　　　プローブ
１１１　　絶縁性基板
１１２　　導電性薄膜
１１２ａ　作用電極リード
１１２ｂ　参照電極リード
１１２ｃ　対極リード
１１３　　溝
１１４　　作用電極
１１５　　参照電極
１１６　　絶縁性レジスト
１１７　　対極
１１８　　検知層
１１９　　保護膜
２　　　　生体
３　　　　情報通信機器

Claims (3)

  1. 　少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、
    式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒは、炭素数１～１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)；または
    式（１）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)と、
    式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
    を含むコポリマー混合物
    を含む膜構造体。
  2. 　前記保護膜は、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有する、請求項１の膜構造体。
  3. 　絶縁性基板、前記絶縁性基板の両面に形成された導電性薄膜、前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、前記作用電極上に形成された検知層ならびに前記作用電極、参照電極、対極および検知層を被覆する保護膜を備えるバイオセンサ用プローブであって、前記検知層は検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含み、前記保護膜は、
    式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒは、炭素数１～１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)；または
    式（１）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)と、
    式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
    を含むコポリマー混合物
    を含むバイオセンサ用プローブ。
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