WO2024005025A1 - センサ及びその製造方法 - Google Patents

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WO2024005025A1
WO2024005025A1 PCT/JP2023/023842 JP2023023842W WO2024005025A1 WO 2024005025 A1 WO2024005025 A1 WO 2024005025A1 JP 2023023842 W JP2023023842 W JP 2023023842W WO 2024005025 A1 WO2024005025 A1 WO 2024005025A1
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WO
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sensor
insulating layer
electrode
working electrode
reagent
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PCT/JP2023/023842
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English (en)
French (fr)
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哲也 則兼
圭吾 羽田
太郎 中野
健 畑山
Original Assignee
Ｐｈｃホールディングス株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems

Definitions

  • the first disclosure relates to, for example, a sensor and a method for manufacturing the same.
  • Electrochemical sensors have conventionally been used to measure target substances in test samples such as cell culture fluids and blood samples.
  • a sensor includes, for example, an insulating base material, a working electrode disposed on the surface of the base material, and further includes a counter electrode and/or a reference electrode.
  • the working electrode typically includes a conductive layer and a reagent layer disposed on the conductive layer and containing a reagent (for example, a redox enzyme and an electron carrier) that participates in a redox reaction.
  • the sensor may further include a protective film that covers only the working electrode or covers the working electrode together with the counter electrode and/or the reference electrode in order to prevent the reagent from flowing out from the reagent layer. .
  • the electrochemical sensor described in Patent Document 1 includes a base material, a first electrode (working electrode) and a second electrode (reference electrode) including a sensing layer (reagent layer) arranged on the base material, A flow-limiting membrane (protective membrane) containing a predetermined polymer compound is provided, covering the entirety thereof.
  • Patent Document 1 describes that the flow-limiting film (protective film) is formed by dip coating or casting.
  • an insulating base material including a working electrode including a conductive layer and a reagent layer is immersed in a solution containing a polymer compound, and dried to form a protective film that covers the entire insulating base material.
  • a reagent layer containing a reagent such as an enzyme is also arranged on the surface of a flat electrode.
  • An object of the first disclosure is to provide a sensor including a working electrode including a reagent layer and a protective film whose characteristics can be easily controlled within a desired range, and a method for manufacturing the same.
  • the sensor according to the first disclosure includes an insulating substrate and a working electrode disposed on the substrate.
  • the working electrode is a conductive layer disposed on the substrate; a first opening that penetrates through the thickness direction and is formed at a position at least partially on the conductive layer and overlaps a part of the conductive layer in a plan view from the thickness direction of the substrate; a first insulating layer having an aqueous surface; Penetration in the thickness direction is disposed on the first insulating layer and is formed at a position that overlaps with a portion of the first insulating layer that includes the entire first opening in a plan view from the thickness direction.
  • a second insulating layer having a second opening and a surface that is liquid repellent to alcohol; a reagent layer disposed within the first opening of the first insulating layer and including an outer periphery defined by an inner periphery of the first opening of the first insulating layer and a reagent involved in a redox reaction; , a protective film disposed within the second opening of the second insulating layer and including an outer periphery defined by an inner periphery of the second opening of the second insulating layer.
  • the method for manufacturing the sensor according to the first disclosure includes: Droplets of liquid composition A containing the reagent are placed in water in the first opening of the first insulating layer of the substrate on which the conductive layer, the first insulating layer, and the second insulating layer are disposed. forming and then drying to form the reagent layer; and After forming the reagent layer, forming droplets of a liquid composition B containing a protective film component in alcohol in the second opening of the second insulating layer and drying the droplets to form the protective film. including. (Effect of the invention)
  • the sensor and manufacturing method according to the first disclosure it is easy to control the characteristics of the reagent layer and protective film of the working electrode of the sensor within a desired range.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which conductive layers and wiring of a first working electrode, a second working electrode, a reference electrode, and a counter electrode are arranged.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which conductive layers and wiring of a first working electrode, a second working electrode, a reference electrode, and a counter electrode are arranged, and a first insulating layer is further arranged thereon.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which conductive layers and wiring of a first working electrode, a second working electrode, a reference electrode, and a counter electrode are arranged, and a first insulating layer and a second insulating layer are further arranged thereon.
  • FIG. 4 is a plan view showing a substrate in which a reagent layer of a working electrode and a silver/silver chloride layer of a reference electrode are further arranged on the substrate of FIG. 3.
  • FIG. FIG. 1 is a plan view of a sensor according to an embodiment of the first disclosure.
  • FIG. 4 is a sectional view taken along line A-A' of a portion of the substrate in FIG. 3 corresponding to the first working electrode. 4 is a cross-sectional view of a droplet of liquid composition A containing a reagent involved in a redox reaction in water, formed in the first opening of the first insulating layer of the first working electrode of the substrate of FIG. 3.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view taken along the line B-B' of the portion of the substrate of FIG. 4 corresponding to the first working electrode, obtained by drying the droplets of the liquid composition A of FIG. 3.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a droplet of the first liquid composition B containing a protective film component in alcohol formed in the second opening of the second insulating layer of the first working electrode of the substrate of FIG. 4.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view of a portion of the protective film in the second opening of the second insulating layer of the first working electrode of the substrate of FIG. 4, obtained by drying the droplets of the first liquid composition B shown in FIG. 9.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view taken along the line B-B' of the portion of the substrate of FIG. 4 corresponding to the first working electrode, obtained by drying the droplets of the liquid composition A of FIG. 3.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a droplet of the first liquid composition B containing a protective film
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of a droplet of the first liquid composition B further formed within the second opening of the second insulating layer of the first working electrode, including a portion of the protective film of FIG. 10.
  • . 5 is a cross-sectional view of a droplet of a second liquid composition B containing a protective film component in alcohol formed in the second opening of the second insulating layer of the second working electrode of the substrate of FIG. 4.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of the second protective film in the second opening of the second insulating layer of the second working electrode of the substrate of FIG. 4, obtained by drying the droplets of the second liquid composition B of FIG. 9.
  • FIG. Cross-sectional view of a droplet of a third liquid composition B containing another protective film component in alcohol formed in the second opening of the second insulating layer of the second working electrode, including the second protective film of FIG. .
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of a sensor of a comparative example in which a droplet of the first liquid composition B containing a protective film component in alcohol is wetted and spread, which is formed in the second opening of the second insulating layer of the first working electrode.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view of a portion of the first protective film formed on the upper surface of the second insulating layer of the first working electrode and within the second opening, obtained by drying the spread first liquid composition B of FIG. 17; A droplet of the first liquid composition B further formed in the second opening of the second insulating layer of the first working electrode of the sensor of the comparative example, which includes a part of the first protective film in FIG. 18, wets and spreads.
  • FIG. 20 is a cross-sectional view of the first protective film formed on the upper surface of the second insulating layer and inside the second opening of the first working electrode, obtained by drying the spread first liquid composition B of FIG. 19;
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a method of measuring a test substance by immersing the sensor of FIG. 5 in a liquid sample.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of a portion of the sensor of FIG. 5, including a reference pole, taken along line E-E'.
  • FIG. 6 is a sectional view taken along line F-F' of a portion of the sensor of FIG. 5 including a counter electrode.
  • FIG. 1 is a control block diagram of an analysis device including a sensor according to an embodiment of the first disclosure.
  • FIG. 1 is a control block diagram of an analysis device including a sensor according to an embodiment of the first disclosure.
  • FIG. 25A shows the measurement results of the current value of the first working electrode (for glucose measurement) of the sensor of the example.
  • FIG. 25B shows the measurement results of the current value of the first working electrode (for glucose measurement) of the sensor of the comparative example.
  • FIG. 26A shows the measurement results of the current value of the second working electrode (for lactic acid measurement) of the sensor of the example.
  • FIG. 26B shows the measurement results of the current value of the second working electrode (for measuring lactic acid) of the sensor of the comparative example.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which a working electrode conductive layer, a reference electrode conductive layer, a counter electrode, and wiring are arranged.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which a working electrode conductive layer, a reference electrode conductive layer, a counter electrode, and wiring are arranged, and a first insulating layer is further arranged thereon.
  • FIG. 2 is a plan view showing a substrate on which a working electrode conductive layer, a reference electrode conductive layer, a counter electrode, and wiring are arranged, and a first insulating layer and a second insulating layer are further arranged thereon.
  • 30 is a plan view showing a substrate in which a reagent layer of a working electrode and a silver/silver chloride layer of a reference electrode are further arranged on the substrate of FIG. 29; FIG. FIG.
  • FIG. 7 is a plan view of a sensor according to an embodiment of the second disclosure in which a tip opening and a flow path are formed in a second insulating layer.
  • FIG. 7 is a plan view of a sensor according to another embodiment of the second disclosure, in which a distal opening and a flow path are formed in a first insulating layer and a second insulating layer.
  • 32 is a cross-sectional view of the sensor of FIG. 31, taken along line J-J', of a portion including a working electrode.
  • 32 is a sectional view taken along line K-K' of a portion of the sensor of FIG. 31 including a reference pole;
  • FIG. 32 is a sectional view taken along line L-L' of a portion of the sensor of FIG. 31 including a counter electrode.
  • FIG. 32 is a cross-sectional view taken along line MM' of a portion of the sensor of FIG. 31 including a counter electrode, a tip opening formed in the second insulating layer, and a flow path;
  • a cross-sectional view of a portion including a tract. 33 is a cross-sectional view taken along line N-N' of a portion of the sensor of FIG. 32, including a counter electrode, a tip opening formed in the first insulating layer and the second insulating layer, and a flow path.
  • FIG. 37 is a schematic cross-sectional view of a portion of the sensor shown in FIGS. 31 and 36, including a counter electrode, a tip opening, and a flow path, immersed in a liquid sample so that the tip of the substrate becomes the bottom end.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view of a portion including a counter electrode of a comparative sensor without a tip opening and a flow path, which is immersed in a liquid sample so that the tip of the substrate becomes the bottom end.
  • a substrate including a main body, a connecting portion, and a base end, a first insulating layer disposed entirely on the first surface of the substrate, and a first insulating layer disposed on the first surface of the substrate closer to the tip than the bent portion.
  • FIG. 7 is a plan view of a sensor according to an embodiment of the second disclosure, including a second insulating layer including an insulating sheet.
  • FIG. 42 is a plan view of a multiple sensor in which a plurality of the sensors of FIG. 41 are connected at the base end of the substrate. In FIG. 42, the insulating layer is omitted.
  • FIG. 42 is a schematic diagram of the sensor of FIG. 41 in which the main body portion of the substrate, on which the detection electrode is arranged, is bent at the bent portion of the connecting portion of the substrate and immersed in a liquid sample. In FIG. 43, the insulating layer is omitted.
  • FIG. 42 is a schematic side view of the sensor of FIG.
  • FIG. 41 in which the main body of the substrate, on which the detection electrode is arranged, is bent at the bend of the connecting portion of the substrate and immersed in a liquid sample.
  • a second insulating layer including an insulating sheet is disposed over the entire first surface of the substrate, and the main body of the substrate on which the detection electrode is arranged, which is bent at the bend of the connecting portion of the substrate, is A schematic diagram from the side of a comparative example sensor immersed in a sample.
  • a substrate including a main body, a connecting portion, and a proximal end, a first insulating layer disposed entirely on the first surface of the substrate, and a first insulating layer disposed on the first surface of the substrate closer to the tip than the bent portion a second insulating layer including a first insulating sheet; and a second insulating layer including a second insulating sheet disposed on the first surface of the proximal end of the substrate, and including the insulating sheet on the bent portion of the substrate.
  • FIG. 7 is a top view of a sensor according to another embodiment of the second disclosure; The sensor shown in FIG.
  • FIG. 46 further includes a plurality of third insulating sheets separated from the first insulating sheet and the second insulating sheet through the notch in the region above the bent portion of the first surface of the substrate.
  • FIG. 6 is a plan view of a sensor according to yet another embodiment of the second disclosure, further disposed with a second insulating layer;
  • FIG. 2 is a control block diagram of an analysis device including a sensor according to an embodiment of the second disclosure.
  • FIG. 3 is a plan view of a sensor S1 of a comparative example.
  • FIG. 3 is a plan view of a sensor S2 of a comparative example.
  • FIG. 3 is a plan view of the sensor S3 of the example.
  • FIG. 3 is a plan view of the sensor S4 of the example.
  • FIG. 3 is a plan view of the sensor S5 of the example.
  • FIG. 50A shows the measurement results of the current value of the working electrode of sensor S1.
  • FIG. 50B shows the measurement results of the current value of the working electrode of sensor S2.
  • FIG. 50C shows the measurement results of the current value of the working electrode of sensor S3.
  • FIG. 50D shows the measurement results of the current value of the working electrode of sensor S4.
  • FIG. 50E shows the measurement results of the current value of the working electrode of sensor S5.
  • FIG. 7 is an exploded perspective view of a sensor unit according to an embodiment of the second disclosure.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing a sensor held between an upper support plate and a lower support plate.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of an adapter unit including a sensor unit.
  • 55 is a sectional view taken along line PP' of a portion including a counter electrode of the sensor shown in FIG. 54.
  • 55 is a cross-sectional view along the QQ' line of a portion of the sensor shown in FIG. 54 including the first working electrode.
  • 55 is a cross-sectional view taken along line RR' of a portion of the sensor shown in FIG. 54 that includes a second working electrode.
  • Experiment 4 of the third disclosure which of the carbon electrode without platinum particles (Experiment 3-1), the carbon electrode containing 1% platinum particles (Experiment 3-2), and the carbon electrode containing 5% platinum particles (Experiment 3-3) The results of a cyclic voltammetry test using this as the working electrode are shown.
  • Experiment 5 of the third disclosure either a carbon electrode without platinum particles (A) or a carbon electrode containing 1% platinum particles (B) was used as a working electrode, and a potential of 0.3 V or -0.2 V was applied. The results of measuring the current value over time are shown.
  • the sensor of Experiment 2-1 (the working electrode conductive layer and the counter electrode are carbon conductive layers containing no platinum particles) and the sensor of Experiment 2-2 (the counter electrode has platinum nanoparticles on the surface)
  • the sensor of Experiment 3-1 (the working electrode conductive layer and the counter electrode were carbon conductive layers containing no platinum particles), the sensor of Experiment 3-2 (the working electrode conductive layer and the counter electrode were platinum-free), Using a carbon conductive layer containing 1% by weight of particles based on carbon) and the sensor of Experiment 3-3 (the working electrode conductive layer and the counter electrode were carbon conductive layers containing 5% by weight of platinum particles based on carbon).
  • shows the results of measuring over time the current value (A) corresponding to the glucose concentration and the current value (B) corresponding to the lactic acid concentration in the liquid sample (N 2).
  • FIG. 7 is a plan view of a sensor according to an embodiment of the fourth disclosure.
  • FIG. 63 is a cross-sectional view of a portion of the sensor shown in FIG. 62, including a counter electrode, taken along line SS'. 63 is a cross-sectional view of a portion of the sensor shown in FIG. 62, including a working electrode, taken along line T-T'.
  • FIG. 65 shows the results of Experiment 8 of the fourth disclosure.
  • FIG. 65A shows the measurement results using the sensor of Experiment 8-1
  • FIG. 65B shows the measurement results using the sensor of Experiment 8-2.
  • FIG. 66 shows the results of Experiment 9 of the fourth disclosure.
  • FIG. 66A shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-1
  • FIG. 66B shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-2
  • FIG. 66C shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-3.
  • FIG. 67 shows the results of Experiment 10 of the fourth disclosure.
  • Embodiments of a sensor and a method for manufacturing a sensor according to the first disclosure will be described below.
  • more detailed explanation than necessary may be omitted.
  • detailed explanations of well-known matters or redundant explanations of substantially the same configurations may be omitted. This is to avoid unnecessary redundancy in the following description and to facilitate understanding by those skilled in the art.
  • the material of the insulating substrate of the sensor according to the first disclosure of the present specification is not particularly limited, but includes, for example, polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyvinyl chloride, polyoxymethylene, monomer cast nylon, Resin materials such as polybutylene terephthalate, methacrylic resin, and ABS resin, or glass materials can be used.
  • dimensions such as the thickness of the substrate are not particularly limited, a substrate having a thickness of, for example, 0.05 mm or more and 2 mm or less, preferably 0.1 mm or more and 1 mm or less can be used.
  • the conductive layer included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification is a layer containing a conductive material such as carbon, gold, platinum, palladium, or the like.
  • the conductive layers of the working electrode, reference electrode, and counter electrode can be manufactured by forming a layer of the conductive material as described above on the surface of the substrate using a sputtering method, vapor deposition method, screen printing method, etc. .
  • the conductive layer can be processed into a predetermined pattern using a laser trimming method, if necessary.
  • the wiring of the sensor according to the embodiment described below can also be made of a similar conductive material.
  • the sensor according to the first disclosure of this specification is immersed in a liquid sample and used to detect a predetermined analyte in the liquid sample.
  • the test substance include amino acids such as glucose, lactic acid, cholesterol, bilirubin, glutamine, and glutamic acid, glycated amino acids, glycated peptides, ketone bodies (3-hydroxybutyric acid), alcohol, and the like.
  • the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification includes a reagent layer containing a reagent involved in a redox reaction.
  • the reagent involved in the redox reaction may be any reagent that is involved in the redox reaction of the test substance, and can be appropriately selected depending on the test substance.
  • Reagents involved in the redox reaction can include a combination of a redox enzyme and a mediator (electron carrier), or a redox enzyme.
  • Oxidoreductases can include coenzymes.
  • oxidoreductases examples include oxidases and dehydrogenases.
  • redox enzymes include glucose oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, bilirubin oxidase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, amino acid oxidase, amino acid dehydrogenase, glutamate oxidase, glutamate dehydrogenase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase. , 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase and the like. These oxidoreductases can be used to detect the test substances exemplified above.
  • Mediators include, but are not limited to, metal complexes (for example, osmium complexes, ruthenium complexes, iron complexes, etc.), quinone compounds (for example, benzoquinone, naphthoquinone, phenanthrenequinone, phenanthrolinequinone, anthraquinone, and derivatives thereof). ), phenazine compounds, viologen compounds, phenothiazine compounds, and phenol compounds.
  • metal complexes for example, osmium complexes, ruthenium complexes, iron complexes, etc.
  • quinone compounds for example, benzoquinone, naphthoquinone, phenanthrenequinone, phenanthrolinequinone, anthraquinone, and derivatives thereof.
  • phenazine compounds for example, osmium complexes, ruthenium complexes, iron complexes, etc.
  • quinone compounds for example
  • mediators include potassium ferricyanide, hexaammineruthenium, ferrocene, poly(1-vinylimidazole)-bis(bipyridine)chloroosmium, hydroquinone, 2-methyl-1,4-benzoquinone, 1,2-naphthoquinone-4 -sulfonate, 9,10-phenanthrenequinone-2-sulfonate, 9,10-phenanthrenequinone-2,7-disulfonate, 1,10-phenanthroline-5,6-dione, anthraquinone-2-sulfone acid salts, phenazine derivatives (1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, 1-methoxy-5-ethyl phenazinium ethyl sulfate, etc.), methyl viologen, benzyl viologen, methylene blue, methylene green, 2-aminophenol, One or more selected from
  • the mediator is preferably a polymerized mediator bonded to a polymer compound from the viewpoint of sensor durability and prevention of leakage outside the sensor.
  • the polymer compound to which the mediator binds can be a homopolymer, a random copolymer, a block copolymer, or a polymer compound in which these are combined or mixed.
  • the weight average molecular weight of the polymer compound is, for example, 10,000 or more, preferably 50,000 or more, more preferably 100,000 or more, and the upper limit of the weight average molecular weight is, for example, less than 10,000,000, preferably Less than 1,000,000.
  • a polymer compound is one in which a plurality of atoms selected from at least one of carbon atoms, nitrogen atoms, oxygen atoms, and sulfur atoms are bonded in a chain to form a main chain, although there are no particular limitations thereto. can be mentioned.
  • Specific examples include natural polymers such as proteins, polypeptides, and polynucleotides, and synthetic polymers such as polyamino acids, polyimines, polyallyl compounds, poly(meth)acrylates, polyalkylene oxides, and copolymers thereof. Mention may be made of molecular compounds.
  • polyamino acids include poly(L-glutamic acid) and poly(L-lysine).
  • examples of the polyimine include polyalkylene imines such as polyethyleneimine and polypropyleneimine.
  • examples of the polyallyl compound include polyallylamine, polydiallylamine, and the like.
  • examples of polyalkylene oxide include polyethylene oxide and polypropylene oxide.
  • it is preferable that the entire polymerized mediator is hydrophilic, and furthermore, it is preferable that the polymer compound to which the mediator is bonded is hydrophilic.
  • the polymerization mediator one in which a mediator and a polymer compound are bonded via a covalent bond can be used.
  • this covalent bond for example, those described in Japanese Patent Publication No. 2003-514924 can be used, and specific examples include ether bond, thioether bond, ester bond, urethane bond, amide bond, etc. can.
  • the covalent bond may be formed from a reactive group originally possessed by a monomer forming the polymer compound, or may be formed from a reactive group possessed by a linker separately introduced into a mediator or polymer compound. .
  • polymerization mediators include those in which a phenazine compound is used as the mediator, poly(L-lysine) is used as the polymer, and the phenazine compound and poly(L-lysine) are bonded via an amide bond. can be mentioned.
  • the reagent layer included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification can be formed by drying a liquid composition A containing a reagent involved in a redox reaction in water.
  • Liquid composition A contains the reagent in water, and may further contain components such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent, if necessary.
  • the hydrophilic polymer compound include cellulose derivatives, and examples of the cellulose derivative include one or more selected from methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, and hydroxypropylmethylcellulose.
  • the conductive carbon filler include one or more selected from carbon black, graphite powder, porous carbon, and nanocarbon.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of the present specification prevents or suppresses leakage of the reagent contained in the reagent layer to the outside of the protective film, and prevents the analyte present outside the protective film from leaking out. It can be a permeable membrane.
  • the protective film having such properties preferably contains a polymer compound. Examples of the polymer compound contained in the protective film include a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit, a polymer compound containing a cation exchange functional group, and the like.
  • polymer compounds containing 4-vinylpyridine as a constituent unit include poly(4-vinylpyridine), a copolymer (preferably a block copolymer) of 4-vinylpyridine and alkyl methacrylate, and styrene, 4-vinylpyridine and oligomer. Copolymers (preferably random copolymers) with propylene glycol methyl ether methacrylate may be mentioned.
  • the methacrylic acid alkyl ester includes tert-butyl methacrylate.
  • examples of the oligopropylene glycol methyl ether methacrylate include tripropylene glycol methyl ether methacrylate.
  • the polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constitutional unit is preferably crosslinked with a crosslinking agent containing two or more epoxy groups, such as polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE).
  • a crosslinking agent containing two or more epoxy groups such as polyethylene glycol diglycidyl ether (PEGDGE).
  • PEGDGE polyethylene glycol diglycidyl ether
  • a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit, which is crosslinked with a crosslinking agent containing two or more epoxy groups, is produced by a reaction between a pyridyl group (tertiary amine) derived from 4-vinylpyridine and an epoxy group. Contains a functional group containing a resulting quaternary ammonium cation.
  • a preferred embodiment of the polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit, which is crosslinked with a crosslinking agent containing two or more epoxy groups, is a “second polymer compound containing a cationic functional group” described in the fourth disclosure.
  • a specific embodiment of "combined compound” is preferred.
  • Examples of the polymer compound containing a cation exchange functional group include a polymer compound containing a structural unit having a sulfonic acid group in the side chain, and preferably a perfluoro compound having a sulfonic acid group in the side chain as the structural unit.
  • a protective membrane comprising a polymeric compound containing a cation exchange functional group is preferably provided on the reagent layer to transport cations such as protons between the reagent layer and the liquid sample.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification can be a laminate of two or more protective films, for example, a cation exchange functional layer provided on the side in contact with the reagent layer. It can be a laminate of a protective film containing a polymer compound containing a group and a protective film provided thereon containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification can be formed by drying liquid composition B containing a protective film component in alcohol.
  • the protective film component include a polymer compound, a crosslinking agent, etc. contained in the protective film.
  • the alcohol in liquid composition B include monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms, with methanol, ethanol or isopropyl alcohol being particularly preferred, and ethanol being most preferred.
  • the first insulating layer included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification includes a water-repellent surface.
  • the water-repellent surface refers to a surface having a contact angle with water of, for example, 90° or more, more preferably 100° or more, and most preferably 110° or more.
  • the upper limit of the water contact angle of the water-repellent surface of the first insulating layer is not particularly limited, but may be, for example, 160° or less (the range of the water contact angle is, for example, 90° or more and 160° or less). .
  • the second insulating layer included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification includes a surface that is liquid repellent to alcohol (alcohol repellent).
  • the surface that is liquid repellent to alcohol refers to a surface that has a contact angle with alcohol of, for example, 45° or more, more preferably 50° or more, and most preferably 55° or more.
  • the upper limit of the contact angle to alcohol of the alcohol-repellent surface of the second insulating layer is not particularly limited, but is, for example, 100° or less (the range of the contact angle to alcohol is, for example, 45° or more and 100° or less).
  • the alcohol includes, for example, a monohydric alcohol having 1 to 5 carbon atoms, with methanol, ethanol or isopropyl alcohol being particularly preferred, and ethanol being most preferred.
  • the contact angle of the surface of the first insulating layer to water and the contact angle of the surface of the second insulating layer to alcohol values measured at 20° C. can be adopted.
  • the contact angle of the surface of the first insulating layer to water and the contact angle of the surface of the second insulating layer to alcohol can be measured using a commercially available analyzer, for example, Handy Contact Angle/Surface manufactured by KRUSS. It can be measured using a free energy analyzer MSA.
  • the contact angle of the surface with respect to water or alcohol is preferably determined by ejecting a 2 ⁇ L droplet of water or alcohol onto the surface of the object to be measured, and measuring the contact angle between the droplet and the surface 2 seconds later.
  • the water-repellent surface of the first insulating layer included in the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification preferably contains a fluororesin.
  • a fluorinated hydrocarbon polymer compound can be used, such as a polymer compound containing one or more selected from vinylidene fluoride, tetrafluoroethylene, hexafluoropropylene, and perfluoro(alkyl vinyl ether).
  • the first insulating layer can be entirely made of fluororesin.
  • the alcohol-repellent surface of the second insulating layer of the working electrode of the sensor according to the first disclosure of this specification preferably contains a compound containing a perfluoroalkyl group.
  • Compounds containing perfluoroalkyl groups include fluorine-based surface modification additives.
  • Such a second insulating layer is formed by applying a composition containing an insulating matrix resin and a compound containing a perfluoroalkyl group (fluorine-based surface modification additive) in a solvent onto the first insulating layer. It can be formed by drying. At this time, a compound containing a perfluoroalkyl group is segregated on the surface, forming a surface that is liquid repellent to alcohol.
  • the second insulating layer thus formed is preferably a layer of an insulating matrix resin containing a compound containing a perfluoroalkyl group on its surface.
  • the type of insulating matrix resin is not particularly limited, but may be, for example, a polyester resin.
  • the number of carbon atoms in the perfluoroalkyl group is not particularly limited, but may range from 2 to 20 carbon atoms, for example.
  • the perfluoroalkyl group can contain a trifluoromethyl group at the end.
  • the sensor 1 of the present embodiment includes an insulating substrate 2, a first working electrode 10a, a second working electrode 10b, a reference electrode 20, a counter electrode 30, and a second working electrode 10b arranged on the substrate 2.
  • the wiring 50 is electrically connected to each of the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 30.
  • the sensor 1 of this embodiment includes two working electrodes, in another embodiment not shown, there may be only one working electrode, or three or more working electrodes.
  • the first working electrode 10a and the second working electrode 10b when they are not distinguished, they may be expressed as working electrodes 10a and 10b. Further, the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 30 may be collectively referred to as electrodes. Furthermore, although the sensor 1 of this embodiment is a three-electrode sensor that includes a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode as electrodes, it may be a bipolar sensor that does not include a reference electrode and only includes a working electrode and a counter electrode. Although not shown, the reference electrode and/or the counter electrode may be provided on a substrate different from the substrate on which the working electrode is arranged.
  • the sensor 1 is used to detect a predetermined test substance in the liquid sample X by being immersed in the liquid sample X, as shown in FIG.
  • the liquid sample X include a culture solution containing cells C as shown in the figure, and a liquid sample prepared using blood obtained from a living body.
  • Specific examples of the test substance are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the working electrodes 10a and 10b of the sensor 1 have reagent layers 15a and 15b containing a reagent involved in the redox reaction of the test substance in the liquid sample X on the conductive layers 11a and 11b.
  • Preferred embodiments of the reagents involved in the redox reaction are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the reagent layers 15a and 15b of the working electrodes 10a and 10b of the sensor 1 contain a reagent that oxidizes the analyte in the liquid sample Electrons move from there to the conductive layers 11a and 11b.
  • the reagent layers 15a and 15b contain a reagent that reduces the analyte in the liquid sample X, electrons move from the conductive layers 11a and 11b to the analyte. Since the amount of moving electrons depends on the concentration of the analyte, the concentration or concentration change of the analyte in the liquid sample can be measured.
  • An example of an analysis device 100 for analyzing a test substance in a liquid sample, which includes the sensor 1, will be described with reference to FIG. 24.
  • the analysis device 100 includes a sensor 1, an analysis unit 102, and a control unit 104.
  • Working electrodes 10a, 10b, reference electrode 20, and counter electrode 30 of sensor 1 are connected to analysis unit 102 via wiring 50, respectively.
  • Analysis unit 102 is in communication with control unit 104 .
  • the analysis unit 102 includes an electrochemical measurement section 111, a control section 112, a storage section 113, and a communication section 114.
  • the electrochemical measuring section 111 is a potentiostat that measures the concentration of the analyte by applying a predetermined voltage to each electrode of the sensor 1, and includes a voltage applying section 111a and a current measuring section 111b, Preferably, it further includes a voltage measuring section (counter electrode terminal voltage measuring section) 111c.
  • the voltage application unit 111a applies a predetermined voltage to the electrodes of the sensor 1 in order to measure the concentration of the test substance contained in the liquid sample X.
  • the current measurement unit 111b measures the value of the current flowing between the working electrodes 10a, 10b and the counter electrode 30 of the sensor 1, or its change, which is measured while a voltage is applied to the electrode of the sensor 1 from the voltage application unit 111a. Detect. As described above, the current value or the change in the current value detected by the current measuring section 111b serves as an index of the concentration of the test substance in the liquid sample X or the change in concentration.
  • the voltage measurement unit 111c measures the terminal voltage of each electrode of the sensor 1.
  • the control section 112 is connected to the voltage application section 111a, the current measurement section 111b, the voltage measurement section 111c, the storage section 113, and the communication section 114.
  • the control unit 112 controls the voltage application unit 111a to apply a predetermined voltage to each electrode of the sensor 1, and transmits the measurement results in the current measurement unit 111b and voltage measurement unit 111c to the control unit 104.
  • the communication unit 114 is controlled as follows.
  • the storage unit 113 is connected to the control unit 112, and stores, for example, applied voltage values preset for each measurement target, measured values in the current measurement unit 111b and voltage measurement unit 111c, and pre-measured calibration curves. Save data.
  • the communication section 114 is controlled by the control section 112 and transmits data such as measurement results in the current measurement section 111b and the voltage measurement section 111c to the analysis section 142 of the control unit 104.
  • the control unit 104 can communicate with the analysis unit 102 via the communication section 114, and includes a display section 141 and an analysis section 142.
  • the display section 141 displays the concentration of the test substance in the liquid sample X based on the current value detected by the current measurement section 111b as a result of the analysis performed by the analysis section 142, for example.
  • the analysis unit 142 is, for example, a PC (Personal Computer), and calculates the concentration of the test substance based on the current value flowing between the working electrodes 10a, 10b and the counter electrode 30, which is measured in the current measurement unit 111b. do.
  • PC Personal Computer
  • FIG. 12 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1 including the first working electrode 10a, taken along line CC' in FIG.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1 including the second working electrode 10b, taken along line DD' in FIG.
  • the first working electrode 10a includes a conductive layer 11a, a first insulating layer 3a, a second insulating layer 4a, a reagent layer 15a, and a protective film 16a (FIG. 12).
  • the second working electrode 10b includes a conductive layer 11b, a first insulating layer 3b, a second insulating layer 4b, a reagent layer 15b, and a protective film 16b (FIG. 16).
  • the conductive layers 11a, 11b, the first insulating layers 3a, 3b, the second insulating layers 4a, 4b , reagent layers 15a, 15b, and protective films 16a, 16b when each element of the first working electrode 10a and the second working electrode 10b is referred to without distinction, the conductive layers 11a, 11b, the first insulating layers 3a, 3b, the second insulating layers 4a, 4b , reagent layers 15a, 15b, and protective films 16a, 16b.
  • the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b are arranged on an insulating substrate 2.
  • the main surface on the side where the conductive layers 11a and 11b are formed is referred to as a first surface 2a.
  • Preferable materials for the substrate 2 and the conductive layers 11a and 11b are as described in the ⁇ Material> column.
  • the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b are at least partially disposed on the conductive layers 11a, 11b. As shown in FIGS. 12 and 16, part of the first insulating layers 3a, 3b may be disposed on the conductive layers 11a, 11b, or, although not shown, the entire first insulating layers 3a, 3b are conductive. It may be placed on layers 11a and 11b.
  • the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b are the conductive layers of the working electrodes 10a, 10b of the first insulating layer 3 that covers almost the entire first surface 2a of the substrate 2. 11a and 11b.
  • the present invention is not limited to this embodiment, and the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b may be arranged only in the vicinity of the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b.
  • the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b are formed at positions overlapping with parts of the conductive layers 11a, 11b in a plan view from the thickness direction T of the substrate 2, and penetrated in the thickness direction T. It is characterized by having first openings 3a1 and 3b1 and water-repellent surfaces 3a2 and 3b2.
  • the shape of the inner circumferential edges 3a10, 3b10 of the first openings 3a1, 3b1 in a plan view from the thickness direction T is circular in the illustrated example, but is not limited to this, and may be a polygon (quadrangular, triangular, etc.). ) or any other shape.
  • the thickness of the portions of the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b that cover the conductive layers 11a, 11b is not particularly limited, but can be, for example, 0.5 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, preferably 2 ⁇ m or more, The thickness can be set to 20 ⁇ m or less.
  • the opening width of the first openings 3a1, 3b1 of the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 5 mm or less, preferably 1 mm or more and 2 mm or less. can.
  • the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b have water-repellent surfaces 3a2, 3b2.
  • the reagent layers 15a and 15b of the working electrodes 10a and 10b contain a reagent involved in a redox reaction in water in the first openings 3a1 and 3b1 of the first insulating layers 3a and 3b of the working electrodes 10a and 10b.
  • the liquid composition A is formed by forming droplets of the liquid composition A and then drying the droplets.
  • the surfaces 3a2 and 3b2 of the first insulating layers 3a and 3b of the working electrodes 10a and 10b are water repellent, so the droplets of liquid composition A are easily held without collapsing.
  • the characteristics of the reagent layers 15a, 15b after drying for example, the thickness of the reagent layers 15a, 15b, the amount of reagent constituting the reagent layers 15a, 15b) within a designed range.
  • Preferred embodiments of the materials constituting the first insulating layers 3a and 3b having water-repellent surfaces 3a2 and 3b2 are as described in the ⁇ Material> column.
  • the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b are arranged on the first insulating layers 3a, 3b.
  • the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b are the conductive layers of the working electrodes 10a, 10b of the second insulating layer 4 that covers almost the entire first surface 2a of the substrate 2. 11a and 11b.
  • the present invention is not limited to this embodiment, and the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b may be arranged only in the vicinity of the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b.
  • the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b are the portions of the first insulating layers 3a, 3b that enclose the entire first openings 3a1, 3b1 when viewed in plan from the thickness direction T of the substrate 2. It has second openings 4a1, 4b1 formed at positions overlapping with 3a3, 3b3 and penetrating in the thickness direction T, and surfaces 4a2, 4b2 that are liquid repellent to alcohol.
  • the shape of the inner peripheral edges 4a10, 4b10 of the second openings 4a1, 4b1 of the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b in plan view from the thickness direction T is circular in the illustrated example;
  • the shape is not limited to this, and may be a polygon (quadrangular, triangular, etc.) or any other arbitrary shape. As shown in FIG.
  • the inner peripheral edges 3a10, 3b10 of the first openings 3a1, 3b1 of the first insulating layers 3a, 3b, the inner peripheral edges 4a10, 3b10 of the second openings 4a1, 4b1 of the second insulating layers 4a, 4b, 4b10 preferably has a parallel shape in plan view from the thickness direction T, but is not limited thereto.
  • the second openings 4a1, 4b1 of the second insulating layers 4a, 4b have, at their bottoms, the first openings 3a1, 3b1 of the first insulating layers 3a, 3b and the reagent layers 15a, 15b inside the first insulating layers 3a, 3b. This is a recess that includes a region surrounding the first openings 3a1 and 3b1 on the water-repellent surfaces 3a2 and 3b2 of the layers 3a and 3b.
  • the thickness of the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b is not particularly limited, but can be, for example, 5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • the opening widths of the second openings 4a1 and 4b1 of the second insulating layers 4a and 4b of the working electrodes 10a and 10b are not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 5 mm or less, preferably 1 mm or more and 3 mm or less. can.
  • the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b have surfaces 4a2, 4b2 that are liquid repellent to alcohol (alcohol repellent).
  • the protective films 16a and 16b of the working electrodes 10a and 10b are formed using a liquid containing a protective film component in alcohol in the second openings 4a1 and 4b1 of the second insulating layers 4a and 4b of the working electrodes 10a and 10b. It is formed by forming droplets of composition B and then drying them.
  • the surfaces 4a2 and 4b2 of the second insulating layers 4a and 4b of the working electrodes 10a and 10b are liquid repellent to alcohol, so the droplets of liquid composition B do not collapse. It is easy to hold without Therefore, it is easy to set the characteristics of the protective films 16a, 16b after drying (for example, the thickness of the protective films 16a, 16b, the amount of components constituting the protective films 16a, 16b) within a designed range.
  • Preferred embodiments of the materials constituting the second insulating layers 4a, 4b having surfaces 4a2, 4b2 that are liquid repellent to alcohol (alcohol repellent) are as described in the ⁇ Material> column.
  • the reagent layers 15a, 15b of the working electrodes 10a, 10b are arranged in the first openings 3a1, 3b1 of the first insulating layers 3a, 3b, and are arranged in the first openings 3a1, 3b1 of the first insulating layers 3a, 3b. It includes outer peripheral edges 15a10 and 15b10 defined by the peripheral edges 3a10 and 3b10, and a reagent involved in the redox reaction.
  • the thickness of the reagent layers 15a and 15b is not particularly limited, but as shown in the figure, the thickness of the first insulating layers 3a and 3b covering the conductive layers 11a and 11b should be approximately the same or smaller than that. is preferred.
  • Preferred embodiments of the reagents involved in the redox reaction in the reagent layers 15a and 15b are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the protective films 16a, 16b of the working electrodes 10a, 10b are arranged in the second openings 4a1, 4b1 of the second insulating layers 4a, 4b, and are arranged in the second openings 4a1, 4b1 of the second insulating layers 4a, 4b. It includes outer peripheral edges 16a10 and 16b10 defined by peripheral edges 4a10 and 4b10. Although the thickness of the protective films 16a and 16b is not particularly limited, it is preferable that the thickness be approximately the same as or smaller than the thickness of the second insulating layers 4a and 4b as shown in the figure.
  • Preferred embodiments of the protective films 16a and 16b are as described in the ⁇ Material> column.
  • the former is referred to as the "first reagent layer 15a" of the first working electrode 10a. ”, the latter may be expressed as “second reagent layer 15b” of second working electrode 10b.
  • the reagent included in the reagent layer 15a of the first working electrode 10a may be referred to as a "first reagent”
  • the reagent included in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b may be referred to as a "second reagent”.
  • the senor 1 includes a plurality of working electrodes 10a and 10b, and a first reagent contained in the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a among the plurality of working electrodes 10a and 10b;
  • the second reagents contained in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b, which is different from the working electrode 10a, are different from each other.
  • the first reagent is involved in the redox reaction of the first analyte in the liquid sample X
  • the second reagent is involved in the redox reaction of the first analyte in the liquid sample can be involved in the redox reaction of different second analytes, so it can be used to detect multiple analytes including the first analyte and the second analyte in liquid sample X. Can be done.
  • the first reagent preferably contains an enzyme involved in the redox reaction of glucose, more preferably glucose dehydrogenase or glucose oxidase;
  • the two reagents preferably include an enzyme involved in the redox reaction of lactic acid, more preferably lactate oxidase or lactate dehydrogenase.
  • the sensor 1 according to this aspect can detect glucose and lactic acid.
  • FIG. 22 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1 including the reference pole 20, taken along line EE' in FIG.
  • the reference electrode 20 includes a reference electrode conductive layer 21 disposed on the first surface 2a of the insulating substrate 2, a silver/silver chloride layer 22 disposed on the reference electrode conductive layer 21, and a silver/silver chloride layer. 22, and a reference electrode protective film 23 disposed on the reference electrode protection film 22.
  • the reference electrode conductive layer 21 can be formed of the material described for the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b.
  • the reference electrode protective film 23 can be formed of the material described in the ⁇ Material> column regarding the protective films 16a, 16b of the working electrodes 10a, 10b.
  • a part of the first insulating layer 3 disposed on the first surface 2a of the substrate 2 is disposed on the reference electrode conductive layer 21, and the reference electrode conductive layer 3 is partially disposed on the reference electrode conductive layer 21 in a plan view from the thickness direction T of the substrate 2.
  • the reference electrode includes a reference electrode first opening 301 that is formed at a position overlapping a part of the reference electrode 21 and penetrates in the thickness direction T.
  • the silver/silver chloride layer 22 of the reference electrode 20 is arranged within the reference electrode first opening 301 of the first insulating layer 3 .
  • the second insulating layer 4 disposed on the first insulating layer 3 is located at a position overlapping with a portion of the first insulating layer 3 that includes the entire reference electrode first opening 301 in a plan view from the thickness direction T.
  • a reference electrode second opening 401 penetrating in the thickness direction T is included.
  • the reference electrode protective film 23 of the reference electrode 20 is arranged within the reference electrode second opening 401 of the second insulating layer 4 .
  • FIG. 23 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1 including the counter electrode 30, taken along line FF' in FIG.
  • the counter electrode 30 includes a counter electrode conductive layer 31 disposed on the first surface 2a of the insulating substrate 2.
  • the counter electrode conductive layer 31 can be formed of the material described for the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b.
  • the first insulating layer 3 disposed on the first surface 2 a of the substrate 2 is partially disposed on the counter electrode conductive layer 31
  • the first insulating layer 3 disposed on the first surface 2 a of the substrate 2 is partially disposed on the counter electrode conductive layer 31 .
  • a counter electrode first opening 302 penetrating in the thickness direction T is formed at a position partially overlapping with the other electrode.
  • the second insulating layer 4 disposed on the first insulating layer 3 is formed at a position in the first insulating layer 3 that overlaps with the counter electrode first opening 302 when viewed from the thickness direction T. It includes a counter electrode second opening 402 penetrating therethrough.
  • the counter electrode conductive layer 31 of the counter electrode 30 is exposed to the outside through the counter electrode first opening 302 of the first insulating layer 3 and the counter electrode second opening 402 of the second insulating layer 4. Therefore, when the sensor 1 is immersed in the liquid sample X as shown in FIG. 21, the counter electrode conductive layer 31 of the counter electrode 30 comes into direct contact with the liquid sample X.
  • the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b, the reference electrode conductive layer 21 of the reference electrode 20, and the counter electrode conductive layer 31 of the counter electrode 30 are placed on the first surface 2a of the insulating substrate 2, the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b, the reference electrode conductive layer 21 of the reference electrode 20, and the counter electrode conductive layer 31 of the counter electrode 30 are placed. , and wiring 50 electrically connected to each of them.
  • a first layer is deposited on the first surface 2a of the substrate 2 on which the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b, the reference electrode conductive layer 21, the counter electrode conductive layer 31, and the wiring 50 are arranged.
  • An insulating layer 3 is further laminated. The portions of the first insulating layer 3 near the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b are the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b. Parts of the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b are arranged on the conductive layers 11a, 11b, and cover the upper surfaces of the conductive layers 11a, 11b.
  • the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b have first openings 3a1, 3b1 of the working electrodes 10a, 10b at positions that overlap with parts of the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b.
  • the first insulating layer 3 further has a reference electrode first opening 301 at a position overlapping with a part of the reference electrode conductive layer 21 and a counter electrode first opening 302 at a position overlapping with a part of the counter electrode conductive layer 31. .
  • a second insulating layer 4 is further laminated on the first insulating layer 3.
  • the portions of the second insulating layer 4 near the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b are the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b.
  • the second insulating layers 4a, 4b of the working electrodes 10a, 10b are located at positions overlapping portions 3a3, 3b3 of the first insulating layers 3a, 3b of the working electrodes 10a, 10b, which include the entire first openings 3a1, 3b1. It has second openings 4a1 and 4b1 formed therein.
  • the second insulating layer 4 further has a reference electrode second opening 401 at a position overlapping with the reference electrode first opening 301 of the first insulating layer 3 , and a reference electrode second opening 401 overlapping with the counter electrode first opening 302 of the first insulating layer 3 A counter electrode second opening 402 is provided at the position.
  • the second insulating layer 4 is formed by coating an ink containing an insulating matrix resin and a compound containing a perfluoroalkyl group (fluorine-based surface modification additive) in a solvent on the first insulating layer. It can be formed by drying.
  • the substrate 2 shown in FIG. 3 On which the conductive layers 11a, 11b of the working electrodes 10a, 10b, the reference electrode conductive layer 21, the counter electrode conductive layer 31, the wiring 50, the first insulating layer 3, and the second insulating layer 4 are arranged.
  • a cross section along line AA' of a portion corresponding to the first working electrode 10a is shown in FIG.
  • the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the working electrode 10a is a recess that includes the conductive layer 11a of the working electrode 10a at its bottom.
  • the first insulating layer 3a of the working electrode 10a has a water-repellent surface 3a2.
  • droplets of liquid composition A containing a reagent involved in a redox reaction are formed in water in the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the working electrode 10a.
  • the droplet of the liquid composition A is formed at an internal angle ⁇ a (as shown in FIG. 7) at the contact point with the surface 3a2 of the first insulating layer 3a. ) is maintained without collapsing until it reaches the water contact angle of the surface 3a2 of the first insulating layer 3a.
  • droplets of the liquid composition A in the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the working electrode 10a in this way they are dried to form a reagent layer 15a as shown in FIG.
  • droplets of the liquid composition A containing a reagent involved in a redox reaction in water are held without collapsing within the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a having the water-repellent surface 3a2. Therefore, it is easy to set the characteristics of the reagent layer 15a after drying (for example, the thickness of the reagent layer 15a, the amount of reagent constituting the reagent layer 15a) within a designed range.
  • the surface of the first insulating layer 3a does not have water repellency, when a droplet of the liquid composition A is formed in the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a, the droplet may collapse.
  • the liquid composition A is likely to wet the outside of the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a, and it is not easy to adjust the properties of the reagent layer obtained by drying to a designed range.
  • composition of liquid composition A containing a reagent involved in a redox reaction in water is as described in the ⁇ Materials> column.
  • droplets of liquid composition B containing a protective film component in alcohol are formed in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of the working electrode 10a. .
  • the droplet of the liquid composition B forms an internal angle ⁇ b (FIG. 9) at the point of contact with the surface 4a2 of the second insulating layer 4a. ) is maintained without collapsing until it reaches the contact angle with the alcohol on the surface 4a2 of the second insulating layer 4a.
  • the droplets of the liquid composition B in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of the working electrode 10a in this manner are dried to form a protective film 16a as shown in FIG.
  • the droplets of the liquid composition B containing the protective film component in alcohol do not collapse within the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a having the surface 4a2 that is liquid repellent to alcohol. Since it is easily retained, it is easy to set the characteristics of the protective film 16a after drying (for example, the thickness of the protective film 16a, the amount of components constituting the protective film 16a) within a designed range.
  • the surface of the second insulating layer 4a does not have liquid repellency to alcohol, when a droplet of the liquid composition B is formed in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a, the droplet There is a high possibility that the liquid composition B will wet the outside of the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a, and it is not easy to adjust the properties of the protective film obtained by drying to the designed range. (See Comparative Examples described below with reference to FIGS. 17 to 20).
  • a preferred embodiment of the composition of liquid composition B containing a protective film component in alcohol is as described in the ⁇ Materials> column.
  • FIGS. 9 to 12 show an example in which the protective film 16a is formed in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of the working electrode 10a in two steps.
  • a liquid composition B containing a protective film component in alcohol is poured into the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a. After forming the droplets, they are dried to form a part of the protective film 16a in the thickness direction, as shown in FIG. Subsequently, as shown in FIG.
  • droplets of the liquid composition B are further formed in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a, and then dried to form a protective film 16a, as shown in FIG. form the whole.
  • the present invention is not limited to this example, and the protective film may be formed in one step, or may be formed in three or more steps.
  • the senor 1 includes a plurality of working electrodes 10a, 10b, and a first reagent contained in the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a among the plurality of working electrodes 10a, 10b. and the second reagent contained in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b, which is different from the first working electrode 10a, are different from each other.
  • the method for manufacturing the sensor 1 includes, as a step of forming a reagent layer,
  • the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a included in the plurality of working electrodes 10a, 10b is placed in the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the first working electrode 10a, and the first reagent is contained in water.
  • forming droplets of the first liquid composition A and then drying them see FIGS. 6 to 8
  • a second action different from the first working electrode 10a included in the plurality of working electrodes 10a, 10b are examples of the first reagent layer.
  • the second reagent layer 15b of the pole 10b is placed in the first opening 3b1 of the first insulating layer 3b of the second working electrode 10b with a second liquid composition A containing a second reagent different from the first reagent in water. Forming a droplet and then drying it (not shown, but the same process as in FIGS. 6 to 8) It is preferable to include.
  • the reagent layers 15a and 15b of the plurality of working electrodes 10a and 10b can be formed individually and independently, so that the composition of the liquid composition A containing the reagent in water can be changed. By adjusting, it is easy to form reagent layers 15a and 15b containing different reagents on the plurality of working electrodes 10a and 10b.
  • the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a contains, for example, glucose dehydrogenase or glucose oxidase. a first reagent containing the first reagent;
  • the first working electrode 10a includes a first protective film 16a containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit, as shown in FIG.
  • first protective film 16a Formation of such a first protective film 16a is as follows: After forming the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a, a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit in alcohol is added to the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of the first working electrode 10a.
  • the first protective film 16a may be formed by forming droplets of the first liquid composition B containing and then drying the droplets.
  • the first protective film 16a may be formed in two steps as shown in FIGS. 9 to 12, or may be formed in one step or three or more steps (not shown).
  • the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b contains, for example, lactate oxidase or lactate dehydrogenase. and a second reagent containing the second reagent.
  • the protective film 16b of the second working electrode 10b is, as shown in FIG.
  • a third protective film 16bb containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit is disposed on the second protective film 16ba.
  • the formation of the protective film 16b including the second protective film 16ba and the third protective film 16bb is as follows: After forming the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b, a polymer compound containing the cation exchange functional group in alcohol is added to the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the second working electrode 10b. forming droplets of the second liquid composition B containing and then drying to form a second protective film 16ba (see FIGS. 13 and 14); and after forming the second protective film 16ba, performing a second action.
  • Droplets of a third liquid composition B containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit in alcohol are formed in the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the pole 10b, and then dried. to form a third protective film 16bb (see FIGS. 15 and 16).
  • a third protective film 16bb can include.
  • the protective films 16a and 16b of the plurality of working electrodes 10a and 10b can be formed individually and independently, so the composition of the liquid composition B containing the protective film component in alcohol can be adjusted. By doing so, it is easy to form protective films 16a and 16b having different compositions optimized according to the reagent layers 15a and 15b on the reagent layers 15a and 15b containing different reagents of the plurality of working electrodes 10a and 10b. It is.
  • the method according to this embodiment can include a step of forming the reference electrode 20.
  • the step of forming the reference electrode 20 is as follows: In the substrate 2 shown in FIG. 3 on which the reference electrode conductive layer 21, the first insulating layer 3, and the second insulating layer 4 are arranged, the reference electrode conductive layer 21 in the reference electrode first opening 301 of the first insulating layer 3 placing a silver/silver chloride layer 22 on top (FIG. 4); and after placing the silver/silver chloride layer 22, the silver/silver chloride in the reference electrode second opening 401 of the second insulating layer 4 of the substrate 2; Arranging the reference electrode protective film 23 on the layer 22 (FIG. 5, FIG. 22) can include.
  • Example of the first disclosure As an example of the first disclosure, a sensor 1 having the configuration shown in FIG. 5 was manufactured. An outline of the materials and manufacturing method used for the sensor 1 having the configuration shown in FIG. 5 is shown below.
  • substrate As the insulating substrate 2, a 188 ⁇ m thick substrate made of polyethylene terephthalate and having the shape shown in FIG. 1 etc. was used.
  • the conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b and the reference electrode are formed in the shape shown in FIG.
  • the conductive layer 21, the counter conductive layer 31, and the wiring 50 electrically connected to each of them were formed of a carbon conductive layer with a thickness of 5 ⁇ m.
  • first insulating layer (first insulating layer) Subsequently, as shown in FIG. 2, a first layer of the substrate 2 made of a fluororesin containing a copolymer containing vinylidene fluoride and hexafluoropropylene is placed on the first surface 2a of the substrate 2 on which the carbon conductive layer is disposed. A first insulating layer 3 covering the surface 2a and the carbon conductive layer and having a thickness of 5 ⁇ m on the carbon conductive layer was laminated. The first insulating layer 3 was formed by applying a composition that forms the fluororesin by curing onto the first surface 2a of the substrate 2 on which the carbon conductive layer is disposed, and heating the composition at 140° C. for 1 hour.
  • the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the first working electrode 10a was circular with a diameter of 1.2 mm.
  • the first opening 3b1 of the first insulating layer 3b of the second working electrode 10b was circular with a diameter of 1.4 mm.
  • the reference electrode first opening 301 was a circle with a diameter of 1.1 mm, and the counter electrode first opening 302 was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • the water contact angle of the surface of the first insulating layer 3 was 134.2°.
  • To measure the water contact angle use a handy contact angle/surface free energy analyzer MSA manufactured by KRUSS Co., Ltd. at 20°C. This was done by measuring the contact angle between the drop and the surface.
  • the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of the first working electrode 10a and the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the second working electrode 10b were each circular with a diameter of 2 mm.
  • the second opening 401 of the reference electrode was a circle with a diameter of 2 mm, and the second opening 402 of the counter electrode was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • the contact angle of the surface of the second insulating layer 4 (including the surfaces 4a2 and 4b2 of the second insulating layers 4a and 4b of the working electrodes 10a and 10b) with respect to ethanol was 60.7°.
  • the contact angle for ethanol was measured using a handy contact angle/surface free energy analyzer MSA manufactured by KRUSS, at 20°C, a droplet of 2 ⁇ L of ethanol was discharged onto the surface of the object to be measured, and after 2 seconds, This was done by measuring the contact angle between the droplet and the surface.
  • the first opening 3a1 of the first insulating layer 3a of the first working electrode 10a contains a sodium phosphate buffer (pH 7.4), a carbon black dispersion, a polymer-bonded mediator, glucose oxidase, and a crosslinking agent in water.
  • a 0.4 ⁇ L droplet of the first liquid composition A was formed and dried to form a first reagent layer 15a containing glucose oxidase and a mediator.
  • a carbon black dispersion, hydroxypropyl cellulose, a polymer-bonded mediator, lactic acid oxidase, polyimidazole, poly-L-lysine and a crosslinking agent are placed in water.
  • a 0.6 ⁇ L droplet of the second liquid composition A was formed and dried to form a second reagent layer 15b containing lactate oxidase and a mediator.
  • a first liquid composition B (P4VP-tBuMA polymer dispersion) was prepared by mixing the following reagents in ethanol to the following final concentrations and reacting for about 1 hour.
  • ⁇ P4VP-tBuMA Mn of poly-4-vinylpyridine: 74,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 87,000, Mw/Mn: 1.16, manufactured by NARD
  • final concentration 3.55 wt% ⁇ Random copolymer of tripropylene glycol methyl ether methacrylate-styrene-4-vinylpyridine manufactured by Nard
  • final concentration 4.45 wt% ⁇ PEGDGE poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich
  • final concentration 7mM A droplet of 0.65 ⁇ L of the first liquid composition B is formed in the second opening 4a1 of the second insulating layer 4a of
  • a dispersion liquid was prepared.
  • the resulting Nafion (registered trademark) dispersion having a concentration of 16.12 wt % was designated as a second liquid composition B.
  • This second liquid composition B includes Nafion® in a solvent containing a lower alcohol.
  • a droplet of 0.60 ⁇ L of the second liquid composition B was formed in the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the second working electrode 10b and dried to form a second protective film 16ba. (See Figure 14).
  • the same composition as the first liquid composition B (P4VP-tBuMA polymer dispersion) was used as a third liquid composition B in the following treatment. That is, a droplet of 0.65 ⁇ L of the third liquid composition B is formed in the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the second working electrode 10b on which the second protective film 16ba is formed, and then dried. Thus, a third protective film 16bb was formed (see FIG. 16).
  • a reference electrode protective film 23 was placed on the silver/silver chloride layer 22 in the reference electrode second opening 401 of the second insulating layer 4 to form the reference electrode 20 (FIG. 22).
  • first insulating layer 3 On the first insulating layer 3, a composition containing the same polyester resin as in the example in a solvent but not containing a fluorine-based surface modification additive was coated and heated at 140° C. for 1 hour to form a thickness of 38 ⁇ m. A second insulating layer was formed.
  • the contact angle of the surface of the second insulating layer of the sensor of the comparative example thus obtained with respect to ethanol was 11.2°.
  • the first liquid composition B P4VP-tBuMA polymer dispersion
  • a droplet of .65 ⁇ L was formed, as shown in FIG. 17, the droplet did not remain in the second opening 4a1, but the first liquid composition B wetted and spread to the upper surface of the second insulating layer 4a.
  • this droplet was dried, as shown in FIG. 18, a part of the first protective film 16a was formed not only inside the second opening 4a1 but also on the upper surface of the second insulating layer 4a.
  • the first liquid composition B After drying, a droplet of 0.65 ⁇ L of the first liquid composition B was formed, and as shown in FIG. 19, the first liquid composition B wetted the upper surface of the second insulating layer 4a. It expanded. When it was dried, a part of the first protective film 16a was formed not only inside the second opening 4a1 but also on the upper surface of the second insulating layer 4a, as shown in FIG.
  • the second liquid composition B (Nafion (registered trademark)), which is the same as that used in the example, was placed in the second opening 4b1 of the second insulating layer 4b of the second working electrode 10b of the sensor of the comparative example.
  • the second protective film 16ba was irregularly formed not only within the second opening 4b1 but also on the upper surface of the second insulating layer 4b.
  • the third protective film 16bb was formed only in the second opening 4b1. Instead, they were also irregularly formed on the upper surface of the second insulating layer 4b.
  • ⁇ Glucose and lactic acid measurement experiment> (Culture solution) In a solution of RPMI-1640 Medium (R1383, manufactured by Sigma-Aldrich), MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid monohydrate) (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) and MOPS (3-Morpholinopropanesul) were added as buffer components. fonic acid) (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) A culture solution was prepared by adding each to a final concentration of 25mM, and adjusting the glucose concentration to 30mM, the lactic acid concentration to 15mM, and the pH to 7.4.
  • the sensor 1 of the above example and the sensor of the comparative example were immersed in the above culture solution, and a voltage of 100 mV was applied to the first working electrode and the second working electrode with respect to the reference electrode.
  • FIG. 25A shows the measurement results of the current value of the first working electrode (for glucose measurement) of the sensor 1 of the example.
  • the measurement results of the current value of the first working electrode (for glucose measurement) of the sensor of the comparative example are shown in FIG. 25B.
  • the current value in the sensor 1 of the example was stable, whereas the current value in the sensor of the comparative example decreased over time.
  • the glucose permeability was high from the beginning and that the reagent containing glucose oxidase leaked.
  • FIG. 26A shows the measurement results of the current value of the second working electrode (for lactic acid measurement) of the sensor 1 of the example.
  • FIG. 26B shows the measurement results of the current value of the second working electrode (for measuring lactic acid) of the sensor of the comparative example.
  • the current value in the sensor 1 of the example was stable, whereas the current value in the sensor of the comparative example decreased over time.
  • the material of the insulating substrate of the sensor according to the second disclosure of this specification is not particularly limited, but, for example, the same material as the material of the insulating substrate of the sensor of the first disclosure of this specification can be used.
  • the conductive layer included in the working electrode, reference electrode, and counter electrode of the sensor according to the second disclosure of this specification is a layer containing a conductive material such as carbon, gold, platinum, palladium, or the like.
  • the conductive layer can be manufactured by forming a layer of the conductive material as described above on the surface of the substrate using a sputtering method, a vapor deposition method, a screen printing method, or the like.
  • the conductive layer can be processed into a predetermined pattern using a laser trimming method, if necessary.
  • the wiring of the sensor according to the second disclosure of this specification can also be made of the same conductive material as the conductive layer.
  • the sensor according to the second disclosure of this specification is used to detect a predetermined analyte in the liquid sample by being immersed in the liquid sample.
  • the liquid sample contains water as a solvent.
  • the liquid sample include a cell culture solution and a liquid sample prepared using blood obtained from a living body.
  • the analyte are as described with respect to the analyte by the sensor of the first disclosure herein.
  • the working electrode of the sensor according to the second disclosure of this specification includes a reagent layer containing a reagent involved in a redox reaction.
  • the reagent involved in the redox reaction may be any reagent that is involved in the redox reaction of the test substance, and can be appropriately selected depending on the test substance.
  • Reagents involved in the redox reaction can include a combination of a redox enzyme and a mediator (electron carrier), or a redox enzyme.
  • Oxidoreductases can include coenzymes.
  • oxidoreductases examples include oxidases and dehydrogenases. Specific examples of oxidoreductases are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein.
  • the mediator is not particularly limited, and examples thereof are as described with respect to the sensor of the first disclosure of this specification.
  • the reagent layer included in the working electrode of the sensor according to the second disclosure of the present specification can further contain components such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • a buffer such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • hydrophilic polymer compounds and conductive carbon fillers are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor according to the second disclosure of this specification prevents or suppresses the reagent contained in the reagent layer from leaking out of the protective film, and prevents the analyte present outside the protective film from leaking out. It can be a permeable membrane.
  • the protective film having such properties preferably contains a polymer compound. Examples of the polymer compound contained in the protective film include a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit, a polymer compound containing a cation exchange functional group, and the like.
  • Examples of the polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constitutional unit and the polymer compound containing a cation exchange functional group are as described with respect to the sensor disclosed in the first disclosure of this specification.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor of the second disclosure herein can be a laminate of two or more protective films, an example of which is as described with respect to the sensor of the first disclosure herein. That's right.
  • Another suitable example of the protective film included in the working electrode of the sensor according to the second disclosure of this specification is a protective film containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit.
  • the reference electrode of the sensor according to the second disclosure of this specification can be provided with a protective film.
  • the protective film of the reference electrode can be made of the material described above for the protective film of the working electrode.
  • a sensor 1101 according to an embodiment of the second disclosure will be described with reference to the drawings.
  • the sensor 1101 of this embodiment as shown in FIG. 31 and its cross-sectional views, FIGS. 33, 34, 35, and 36, an insulating substrate 1200 including a tip 1201 immersed in a liquid sample; a detection electrode 1300 that is disposed near the tip 1201 on the first surface 1202 of the substrate 1200 and includes a working electrode 1310, a reference electrode 1320, and a counter electrode 1330; Wiring 1005 arranged on the first surface 1202 of the substrate 1200 and connected to the detection electrode 1300; an insulating layer 1050 disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200 and formed to cover at least a portion of the detection electrode 1300 and the wiring 1005; a tip opening 1061 formed in the insulating layer 1050 and communicating with the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 and opening toward the tip 1201 of the substrate 1200;
  • the insulating layer 1050 includes a channel
  • the sensor 1101 of this embodiment includes two working electrodes 1310, in another embodiment not shown, there may be only one working electrode, or there may be three or more working electrodes.
  • the sensor 1101 is used to detect a predetermined test substance in the liquid sample X1 by being immersed in the liquid sample X1, as shown in FIGS. 39 and 43. Specific examples of the liquid sample and test substance are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the working electrode 1310 of the sensor 1101 includes a working electrode conductive layer 1311 and a reagent disposed on the working electrode conductive layer 1311 that participates in the redox reaction of the test substance in the liquid sample X1.
  • a reagent layer 1315 containing the reagent layer 1315 is included. Preferred embodiments of the reagents involved in the redox reaction are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the reagent layer 1315 of the working electrode 1310 contains a reagent that oxidizes the analyte in the liquid sample Electrons move. Similarly, when the reagent layer 1315 includes a reagent that reduces the analyte in the liquid sample X1, electrons move from the working electrode 1310 to the analyte. Since the amount of moving electrons depends on the concentration of the test substance, the concentration or change in concentration of the test substance in the liquid sample X1 is measured based on the current value or change in the current value flowing through the working electrode 1310 of the sensor 1101. be able to.
  • the analysis device 1100 includes a sensor 1101, an analysis unit 1102, and a control unit 1104.
  • Detection electrodes 1300 including working electrode 1310, reference electrode 1320, and counter electrode 1330 of sensor 1101 are each connected to analysis unit 1102 via wiring 1005.
  • Analysis unit 1102 is in communication with control unit 1104.
  • the analysis unit 1102 includes an electrochemical measurement section 1111, a control section 1112, a storage section 1113, and a communication section 1114.
  • the electrochemical measurement section 1111 is a potentiostat that measures the concentration of a test substance by applying a predetermined voltage to the detection electrode 1300 of the sensor 1101, and includes a voltage application section 1111a and a current measurement section 1111b. , preferably further includes a voltage measuring section (counter electrode terminal voltage measuring section) 1111c.
  • the voltage application unit 1111a applies a predetermined voltage to the detection electrode 1300 of the sensor 1101 in order to measure the concentration of the test substance contained in the liquid sample X1.
  • the current measurement unit 1111b measures the value of the current flowing between the working electrode 1310 and the counter electrode 1330 of the sensor 1101, or its change, which is measured while a voltage is applied from the voltage application unit 1111a to the detection electrode 1300 of the sensor 1101. Detect. As described above, the current value or the change in the current value detected by the current measurement unit 1111b serves as an index of the concentration or concentration change of the test substance in the liquid sample X1.
  • the voltage measurement unit 1111c measures the terminal voltage of the counter electrode 1330 of the sensor 1101.
  • the control section 1112 is connected to the voltage application section 1111a, the current measurement section 1111b, the voltage measurement section 1111c, the storage section 1113, and the communication section 1114.
  • the control unit 1112 controls the voltage application unit 1111a to apply a predetermined voltage to the detection electrode 1300 of the sensor 1101, and transmits the measurement results in the current measurement unit 1111b and voltage measurement unit 1111c to the control unit 1104.
  • the communication unit 1114 is controlled so as to do so.
  • the storage unit 1113 is connected to the control unit 1112, and stores, for example, applied voltage values preset for each measurement target, measured values in the current measurement unit 1111b and voltage measurement unit 1111c, and pre-measured calibration curves. Save data.
  • the communication section 1114 is controlled by the control section 1112 and transmits data such as measurement results in the current measurement section 1111b and the voltage measurement section 1111c to the analysis section 1142 of the control unit 1104.
  • the control unit 1104 can communicate with the analysis unit 1102 via the communication section 1114, and includes a display section 1141 and an analysis section 1142.
  • the display unit 1141 displays the concentration of the test substance in the liquid sample X1 based on the current value detected by the current measurement unit 1111b as a result of the analysis in the analysis unit 1142, for example.
  • the analysis unit 1142 is, for example, a PC (Personal Computer), and calculates the concentration of the test substance based on the value of the current flowing between the working electrode 1310 and the counter electrode 1330, which is measured by the current measurement unit 1111b.
  • PC Personal Computer
  • the substrate 1200 of the sensor 1101 of this embodiment includes a tip 1201 that is immersed in a liquid sample.
  • the substrate 1200 may be a plate-shaped body.
  • the tip 1201 is a portion of the peripheral edge of the substrate 1200 that becomes the tip when the sensor 1101 is immersed in the liquid sample X1 (see FIG. 43).
  • Preferred embodiments of the substrate 1200 are as described in the ⁇ Material> column.
  • a detection electrode 1300 including a working electrode 1310, a reference electrode 1320, and a counter electrode 1330 is arranged near the tip 1201 on the first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the wiring 1005 of the sensor 1101 is arranged on the first surface 1202 of the substrate 1200 and is electrically connected to each electrode of the detection electrode 1300 (working electrode 1310, reference electrode 1320, and counter electrode 1330). Preferred embodiments of the material of the wiring 1005 are as described in the ⁇ Material> column.
  • the insulating layer 1050 of the sensor 1101 is placed on the first surface 1202 of the substrate 1200 and is formed to cover at least a portion of the detection electrode 1300 and the wiring 1005.
  • the insulating layer 1050 includes a first insulating layer 1051 disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200 and a second insulating layer 1052 disposed on the first insulating layer 1051.
  • the insulating layer 1050 may consist of only one layer, or may include three or more layers.
  • the insulating layer 1050 may be any insulating layer, and the material thereof is not particularly limited.
  • the insulating layer 1050 may be an insulating layer containing an insulating cured resin, an insulating layer containing an insulating sheet, or a plurality of insulating layers. It may be a combination of
  • An insulating layer containing an insulating cured resin can be formed by curing a curable resin composition.
  • a curable resin composition a composition that can be polymerized and/or crosslinked by irradiation with active energy rays to produce an insulating cured resin can be used.
  • active energy rays include ultraviolet rays, electron beams, X-rays, infrared rays, and visible rays, with ultraviolet rays or electron beams being preferred.
  • a negative resist composition can be used as the curable resin composition.
  • fluororesin is preferable.
  • the fluororesin may be any resin containing a polymer containing fluorine atoms on the main chain carbon and/or side chain, such as poly(meth)acrylate resin containing fluorine atoms on the main chain carbon and/or side chain, Examples include polyester resin.
  • the thickness of the insulating layer containing the insulating cured resin is not particularly limited, but may be, for example, 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • the insulating layer including the insulating sheet can include the insulating sheet and a bonding layer including an adhesive or adhesive disposed on one side of the insulating sheet.
  • An insulating layer including an insulating sheet can be formed by attaching an insulating sheet including a bonding layer onto the first surface 1202 of the substrate 1200 directly or via another insulating layer.
  • the insulating sheet can be an insulating resin sheet, such as a polyethylene terephthalate sheet.
  • a bonding layer for example, a double-sided tape or a layer of adhesive or adhesive can be used.
  • the outer surface of the insulating sheet is preferably a water-repellent surface, and may be a water-repellent surface imparted with water repellency by, for example, water-repellent coating or surface roughening treatment.
  • the thickness of the insulating layer including the insulating sheet is not particularly limited, but the thickness of the insulating sheet can be, for example, 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, preferably 20 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and one of the insulating sheets
  • the thickness of the bonding layer disposed on the surface can be, for example, 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, preferably 5 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • a preferred embodiment of the insulating layer 1050 includes a first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200, and a first insulating layer 1051 containing an insulating sheet disposed on the first insulating layer 1051. 2 insulating layers 1052.
  • the second insulating layer 1052 can include an insulating sheet and a bonding layer disposed on the surface of the insulating sheet on the first insulating layer 1051 side, and the insulating sheet is connected to the first insulating layer through the bonding layer. Preferably, it is pasted on layer 1051.
  • the thickness of the first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin is not particularly limited; )
  • the thickness of the portion covering the surface can be, for example, 0.5 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, preferably 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • Examples of the thickness of the second insulating layer 1052 including the insulating sheet are as described in the previous paragraph.
  • FIG. 33 is a cross-sectional view of a portion including the working electrode 1310 of the sensor 1101 shown in FIG. 31, taken along line JJ' in FIG.
  • the working electrode 1310 includes a working electrode conductive layer 1311 disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200 and a reagent layer 1315 disposed on the working electrode conductive layer 1311.
  • Working electrode 1310 preferably further includes a working electrode protective film 1316 disposed on reagent layer 1315 as shown.
  • Preferred materials for the working electrode conductive layer 1311, the reagent layer 1315, and the working electrode protective film 1316 are as described in the ⁇ Material> column.
  • a wiring 1005 is connected to the working electrode conductive layer 1311 of the working electrode 1310 (see FIGS. 27 and 31).
  • the working electrode 1310 includes the working electrode protective film 1316
  • the working electrode protective film 1316 suppresses leakage of reagent from the reagent layer 1315. Further, since the working electrode protective film 1316 is porous, the liquid sample X1 can permeate therein. Therefore, when the sensor 1101 is immersed in the liquid sample X1, the liquid sample X1 can easily reach the working electrode 1310, and immersion of the liquid sample X1 into the working electrode 1310 is less likely to be inhibited.
  • the insulating layer 1050 includes a working electrode opening 1501 that penetrates in the thickness direction T1 and is formed at a position overlapping with at least a portion of the working electrode 1310 when viewed in plan from the thickness direction T1 of the substrate 1200.
  • the working electrode opening 1501 is located on the working electrode conductive layer 1311, and the reagent layer 1315 and the working electrode protective film 1316 are arranged within the working electrode opening 1501.
  • the outer periphery of each of the reagent layer 1315 and the working electrode protective film 1316 is defined by the inner periphery of the working electrode opening 1501.
  • the shape of the inner peripheral edge of the working electrode opening 1501 of the insulating layer 1050 when viewed from the thickness direction T1 is circular in the illustrated example, but is not limited to this, and may be polygonal (quadrangular, triangular, etc.). or any other arbitrary shape.
  • the opening width (the width of the widest part) of the working electrode opening 1501 of the insulating layer 1050 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less, preferably 1 mm or more and 5 mm or less.
  • the working electrode opening 1501 of the insulating layer 1050 is constituted by a working electrode first opening 1511 of the first insulating layer 1051 and a working electrode second opening 1521 of the second insulating layer 1052.
  • the working electrode first opening 1511 is formed in the first insulating layer 1051 at a position that overlaps with a part of the working electrode conductive layer 1311 when viewed from the thickness direction T1, and penetrates in the thickness direction T1.
  • the second working electrode opening 1521 is formed at a position that overlaps a portion of the first insulating layer 1051 that includes the entire first working electrode opening 1511 in the second insulating layer 1052 when viewed in plan from the thickness direction T1. It penetrates in the thickness direction T1.
  • the reagent layer 1315 is disposed within the working electrode first opening 1511 of the first insulating layer 1051 and includes an outer peripheral edge defined by an inner peripheral edge of the working electrode first opening 1511.
  • the working electrode protective film 1316 is disposed within the second working electrode opening 1521 of the second insulating layer 1052 and includes an outer peripheral edge defined by an inner peripheral edge of the second working electrode opening 1521.
  • the shape of the inner periphery of the working electrode first opening 1511 of the first insulating layer 1051 and the working electrode second opening 1521 of the second insulating layer 1052 in plan view from the thickness direction T1 is circular in the illustrated example. However, the shape is not limited to this, and each can be a polygon (quadrangular, triangular, etc.) or any other arbitrary shape.
  • the opening width (the width of the widest part) of the working electrode first opening 1511 of the first insulating layer 1051 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 5 mm or less, preferably 1 mm or more and 2 mm or less.
  • the opening width (the width of the widest part) of the working electrode second opening 1521 of the second insulating layer 1052 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less, preferably 1 mm or more and 5 mm or less. .
  • FIG. 34 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1101 in FIG. 31 including the reference pole 1320, taken along the line K-K' in FIG.
  • the reference electrode 1320 includes a reference electrode conductive layer 1321 disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200 and a silver/silver chloride layer 1322 disposed on the reference electrode conductive layer 1321.
  • Reference electrode 1320 preferably further includes a reference electrode overcoat 1326 disposed over silver/silver chloride layer 1322 as shown.
  • Preferred materials for the reference electrode conductive layer 1321 and the reference electrode protective film 1326 are as described in the ⁇ Material> column.
  • a wiring 1005 is connected to the reference electrode conductive layer 1321 of the reference electrode 1320 (see FIGS. 27 and 31).
  • Reference electrode protective film 1326 suppresses leakage of silver from silver/silver chloride layer 1322. Further, since the reference electrode protective film 1326 is porous, the liquid sample X1 can permeate therein. Therefore, when the sensor 1101 is immersed in the liquid sample X1, the liquid sample X1 can easily reach the reference electrode 1320, and immersion of the liquid sample X1 into the reference electrode 1320 is less likely to be inhibited.
  • the insulating layer 1050 includes a reference electrode opening 1502 that penetrates in the thickness direction T1 and is formed at a position overlapping at least a portion of the reference electrode 1320 when viewed in plan from the thickness direction T1 of the substrate 1200.
  • a part of the reference electrode conductive layer 1321, a silver/silver chloride layer 1322, and a reference electrode protective film 1326 are arranged within the reference electrode opening 1502. By disposing the reference electrode protective film 1326 within the reference electrode opening 1502, leakage of silver from the silver/silver chloride layer 1322 is more effectively suppressed.
  • the outer periphery of each of the silver/silver chloride layer 1322 and the reference electrode protective film 1326 is defined by the inner periphery of the reference electrode opening 1502.
  • the shape of the inner periphery of the reference electrode opening 1502 of the insulating layer 1050 in a plan view from the thickness direction T1 is circular in the illustrated example, but is not limited to this, and may be a polygon (quadrangular, triangular, etc.) or any other arbitrary shape.
  • the opening width (the width of the widest part) of the reference electrode opening 1502 of the insulating layer 1050 is not particularly limited, but can be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less, preferably 1 mm or more and 5 mm or less.
  • the reference electrode opening 1502 in the insulating layer 1050 is constituted by a reference electrode first opening 1512 in the first insulating layer 1051 and a reference electrode second opening 1522 in the second insulating layer 1052.
  • the reference electrode first opening 1512 is formed in the first insulating layer 1051 at a position that overlaps with a part of the reference electrode conductive layer 1321 when viewed from the thickness direction T1, and penetrates in the thickness direction T1.
  • the reference electrode second opening 1522 is formed at a position that overlaps a portion of the first insulating layer 1051 that includes the entire reference electrode first opening 1512 in the second insulating layer 1052 when viewed in plan from the thickness direction T1. It penetrates in the thickness direction T1.
  • a portion of the reference electrode conductive layer 1321 and the silver/silver chloride layer 1322 are arranged in the reference electrode first opening 1512 of the first insulating layer 1051 and are defined by the inner peripheral edge of the reference electrode first opening 1512. Including the outer periphery.
  • the reference electrode protective film 1326 is disposed in the reference electrode second opening 1522 of the second insulating layer 1052 and includes an outer peripheral edge defined by an inner peripheral edge of the reference electrode second opening 1522.
  • the shapes of the inner peripheral edges of the reference electrode first opening 1512 of the first insulating layer 1051 and the reference electrode second opening 1522 of the second insulating layer 1052 in a plan view from the thickness direction T1 are each circular in the illustrated example.
  • the shape is not limited to this, and each can be a polygon (quadrangular, triangular, etc.) or any other arbitrary shape.
  • the opening width (the width of the widest part) of the reference electrode first opening 1512 of the first insulating layer 1051 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 5 mm or less, preferably 1 mm or more and 2 mm or less.
  • the opening width (the width of the widest part) of the reference electrode second opening 1522 of the second insulating layer 1052 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less, preferably 1 mm or more and 5 mm or less. .
  • FIG. 35 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1101 in FIG. 31 including the counter electrode 1330, taken along the line L-L' in FIG.
  • the counter electrode 1330 is placed on the first surface 1202 of the substrate 1200.
  • counter electrode 1330 consists entirely of a conductive layer. In order to specifically refer to the conductive layer portion of the counter electrode, it may be referred to as a "counter electrode conductive layer” or "counter electrode conductive layer.”
  • a preferred embodiment of the material of the counter electrode 1330 is as described in the ⁇ Material> column as the material of the conductive layer of the counter electrode.
  • a wiring 1005 is connected to the counter electrode 1330 (see FIGS. 27 and 31).
  • the insulating layer 1050 includes a counter electrode opening 1503 that penetrates in the thickness direction T1 and is formed at a position overlapping at least a part of the counter electrode 1330 when viewed from the thickness direction T1 of the substrate 1200.
  • the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 is exposed through the counter electrode opening 1503.
  • the shape of the inner periphery of the counter electrode opening 1503 of the insulating layer 1050 in a plan view from the thickness direction T1 is a quadrilateral in the illustrated example, but is not limited to this, and may be a circle, a polygon other than a quadrangle (a triangle) etc.) or any other shape.
  • the opening width (the width of the widest part) of the counter electrode opening 1503 of the insulating layer 1050 is not particularly limited, but may be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less, preferably 1 mm or more and 5 mm or less.
  • a portion of the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 is exposed through the counter electrode opening 1503, but the present invention is not limited thereto.
  • the counter electrode opening 1503 may have a shape that includes the entire counter electrode 1330, and the entire upper surface 1331 of the counter electrode 1330 may be exposed through the counter electrode opening 1503.
  • the counter electrode opening 1503 of the insulating layer 1050 is constituted by a counter electrode first opening 1513 of the first insulating layer 1051 and a counter electrode second opening 1523 of the second insulating layer 1052.
  • the counter electrode first opening 1513 is formed in the first insulating layer 1051 at a position overlapping a part of the counter electrode 1330 when viewed in plan from the thickness direction T1, and penetrates in the thickness direction T1.
  • the counter electrode second opening 1523 is formed in the second insulating layer 1052 at a position that coincides with the counter electrode first opening 1513 of the first insulating layer 1051 in a plan view from the thickness direction T1. penetrate through.
  • the counter-electrode first opening 1513 of the first insulating layer 1051 and the counter-electrode second opening 1523 of the second insulating layer 1052 match, and it is sufficient that they at least partially overlap.
  • the inner peripheral shape and opening width of the counter electrode first opening 1513 of the first insulating layer 1051 and the counter electrode second opening 1523 of the second insulating layer 1052 are not particularly limited. may be within the ranges stated above.
  • FIG. 36 is a cross-sectional view of a portion of the sensor 1101 in FIG. 31 including the counter electrode 1330, the tip opening 1061, and the flow path 1062, taken along the line M-M' in FIG.
  • the tip opening 1061 is formed in the insulating layer 1050, communicates with the upper surface 1331 of the counter electrode 1330, and opens toward the tip 1201 of the substrate 1200.
  • the flow path 1062 is formed in the insulating layer 1050 and connects the tip opening 1061 and the upper surface 1331 of the counter electrode 1330.
  • Channel 1062 guides liquid sample X1 from tip opening 1061 to upper surface 1331 of counter electrode 1330.
  • the channel 1062 can guide the liquid sample X1 from the tip opening 1061 to the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 by capillary action.
  • FIG. 39 is a schematic cross-sectional view corresponding to FIG. 36 of the sensor 1101 of this embodiment, which is immersed in the liquid sample X1 from the tip 1201 of the substrate 1200 and includes a tip opening 1061 and a flow path 1062.
  • FIG. 40 is a schematic cross-sectional view of a sensor 1150 of a comparative example that is immersed in liquid sample X1 and has the same structure as the sensor 1101 of this embodiment except that it does not include the tip opening 1061 and the flow path 1062.
  • the liquid sample X1 flows from the tip opening 1061 through the channel 1062 to the counter electrode 1330. It is guided to the upper surface 1331.
  • the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 of the sensor 1101 can sufficiently contact the liquid sample X1.
  • this is preferable because the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 of the sensor 1101 can sufficiently contact the liquid sample X1 even if the depth of the liquid sample X1 is not sufficient. Therefore, by using the sensor 1101 of this embodiment, the measurement accuracy of the analyte in the liquid sample X1 is increased.
  • the counter electrode 1330 and the tip 1201 on the first surface 1202 of the substrate 1200 are The region in between is covered with an insulating layer 1050.
  • the sensor 1150 of the comparative example with this structure is immersed in the liquid sample X1 so that the tip 1201 of the substrate 1200 becomes the tip, the liquid sample It is easy to keep away from the counter electrode 1330 due to liquid repellency.
  • the sensor 1150 of the comparative example contact between the counter electrode 1330 and the liquid sample X1 is likely to be inhibited, and the test substance in the liquid sample X1 may not be normally measured.
  • the counter electrode 1330 is a carbon conductive layer
  • the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 has high water repellency, so that contact of the liquid sample X1 containing water as a solvent with the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 is particularly likely to be inhibited.
  • This problem of the sensor 1150 of the comparative example can be solved by the sensor 1101 of this embodiment in which the tip opening 1061 and the flow path 1062 are formed in the insulating layer 1050.
  • the sensor 1101 of this embodiment shown in FIGS. 31 and 36 has a portion of the insulating layer 1050 between the counter electrode 1330 and the tip portion 1201 of the substrate 1200 when viewed in plan from the thickness direction T1 of the substrate 1200.
  • a tip opening 1061 and a flow path 1062 are formed.
  • the flow path 1062 is connected to the counter electrode opening 1503 of the insulating layer 1050, and the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 is exposed through the counter electrode opening 1503, so that it cannot be immersed in the liquid sample X1.
  • the effect of the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 coming into contact with the liquid sample X1 is particularly high.
  • the tip opening 1061 and flow path 1062 of the sensor 1101 shown in FIGS. 31 and 36 are recesses formed in the insulating layer 1050, which are closed on the side where the substrate 1200 is present and open on the top surface 1053 side of the insulating layer 1050.
  • it is not limited to this embodiment.
  • the tip opening 1061 and the flow path 1062 may be surrounded.
  • the flow path 1062 included in the sensor 1101 shown in FIGS. 31 and 36 has an expanded portion 1062A that expands the flow path width W (see FIG. 31) toward the tip opening 1061.
  • the passage 1062 having the expanded portion 1062A facilitates the movement of the liquid sample X1 from the tip opening 1061 to the upper surface 1331 of the counter electrode 1330 when the sensor 1101 is immersed in the liquid sample X1.
  • the channel width W is perpendicular to the direction from the counter electrode 1330 to the tip 1201 of the substrate 1200 (MM' direction in FIG. 31) when the sensor 1101 is viewed from the thickness direction T1 of the substrate 1200. It refers to the width of the flow path 1062 in the direction (LL' direction in FIG. 31).
  • the insulating layer 1050 includes a first insulating layer 1051 disposed on the first surface 1202 of the substrate 1200, and a second insulating layer 1052 disposed on the first insulating layer 1051.
  • a tip opening 1061 and a flow path 1062 are formed in the second insulating layer 1052.
  • the first insulating layer 1051 includes an insulating cured resin
  • the second insulating layer 1052 includes an insulating sheet.
  • the first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin can be formed by applying a curable resin composition to the first surface 1202 of the substrate 1200 and curing the coating by irradiating the coating with active energy rays.
  • the second insulating layer 1052 including an insulating sheet can be formed by attaching an insulating sheet to the first insulating layer 1051 including an insulating cured resin via a bonding layer. After forming the second insulating layer 1052 including an insulating sheet, a portion of the insulating sheet between the counter electrode 1330 and the tip 1201 of the substrate 1200 is peeled off to form a tip opening 1061 and a flow path in the second insulating layer 1052. 1062 can be formed.
  • a second insulating layer 1052 including an insulating sheet in which a tip opening 1061 and a flow path 1062 are formed can be formed.
  • the tip opening 1061 and the flow path 1062 are further formed in the first insulating layer 1051 in the sensor 1101 shown in FIGS. 31 and 36. ing.
  • the sensor 1101'' shown in FIGS. 32 and 38 has a portion 1515 of the first insulating layer 1051 between the counter electrode 1330 and the tip 1201 of the substrate 1200 (see FIG. 36). ) in which a tip opening 1061 and a flow path 1062 are further formed. Since the sensor 1101'' shown in FIGS.
  • the first insulating layer 1051 is a layer containing an insulating cured resin
  • the second insulating layer 1052 is a layer containing an insulating sheet.
  • the sensor 1101'' has an insulating layer 1050 including a first insulating layer 1051 including an insulating cured resin and a second insulating layer 1052 including an insulating sheet by the procedure described in the previous paragraph.
  • the portion 1515 (see FIG. 36) of the first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin is peeled off.
  • the first insulating layer 1051 lacking the portion 1515 may be formed.
  • the sensor 1101'' can also be manufactured by forming the second insulating layer 1052 thereon.
  • a first insulating layer 1051 is laminated on the first surface 1202 of the substrate 1200 on which the working electrode conductive layers 1311, 1311, the reference electrode conductive layer 1321, the counter electrode 1330, and the wiring 1005 are arranged.
  • the first insulating layer 1051 has working electrode first openings 1511, 1511 at a position overlapping with a part of the working electrode conductive layer 1311, 1311, and a reference electrode first opening 1512 at a position overlapping with a part of the reference electrode conductive layer 1321.
  • the first insulating layer 1051 includes an insulating cured resin.
  • the first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin can be formed by applying a curable resin composition to the first surface 1202 of the substrate 1200 and curing the coating by irradiating the coating with active energy rays. can.
  • a second insulating layer 1052 is further laminated on the first insulating layer 1051 of the substrate 1200 in FIG. 28.
  • the second insulating layer 1052 includes a second working electrode opening 1521 having a shape that completely encloses the first working electrode opening 1511 , 1511 at a position overlapping with the first working electrode opening 1511 , 1511 of the first insulating layer 1051 .
  • a reference electrode second opening 1522 having a shape that encloses the entire reference electrode first opening 1512 at a position overlapping with the reference electrode first opening 1512, and a counter electrode first opening 1522 at a position overlapping with the counter electrode first opening 1513.
  • the second insulating layer 1052 further has a tip opening 1061 and a flow path 1062 in a portion between the counter electrode 1330 and the tip 1201 of the substrate 1200 when viewed in plan from the thickness direction T1 of the substrate 1200.
  • the second insulating layer 1052 includes an insulating sheet.
  • the second insulating layer 1052 including the insulating sheet can further include a bonding layer including an adhesive or adhesive disposed on one side of the insulating sheet.
  • the second insulating layer 1052 including an insulating sheet can be formed by attaching an insulating sheet onto the first insulating layer 1051 via a bonding layer.
  • a reagent layer 1315 is placed in the working electrode first openings 1511, 1511 of the first insulating layer 1051, and a reagent layer 1315 is placed in the reference electrode first opening 1512 of the first insulating layer 1051.
  • a silver/silver chloride layer 1322 is disposed.
  • working electrode protective films 1316, 1316 are placed in the working electrode second openings 1521, 1521 of the second insulating layer 1052 to form working electrodes 1310, 1310, and the second insulating layer A reference electrode protective film 1326 is disposed within the reference electrode second opening 1522 of the layer 1052 to form the reference electrode 1320.
  • the order of formation of each layer in FIGS. 30 and 31 is not particularly limited, and may be performed in a different order.
  • the substrate 1200 is A main body 1210 including a tip 1201 and a first end 1211 opposite to the tip 1201, in which a detection electrode 1300 is arranged; A second end 1222 connected to the first end 1211 of the main body 1210 and a third end 1223 opposite to the second end 1222, from the second end 1222 to the third end 1223.
  • the connecting portion 1220 of the substrate 1200 includes a bending portion 1225 near the third end 1223 that bends the substrate 1200 so that the first surface 1202 side of the substrate 1200 protrudes.
  • FIGS. 41, 42, 46, and 47 show plan views of the sensor 1101 before the substrate 1200 is bent at the bending portion 1225.
  • the wiring 1005 is preferably arranged on the first surface 1202 of the substrate 1200 from the main body part 1210 to the base end part 1230 via the connecting part 1220.
  • the terminal 1006 is arranged on the first surface 1202 of the proximal end portion 1230, and the wiring 1005 is connected to one of the detection electrodes 1300 on the first surface 1202 of the main body portion 1210 and the proximal end.
  • the portion 1230 is electrically connected to one of the terminals 1006 on the first surface 1202.
  • the substrate 1200 of the sensor 1101 shown in FIG. 41 is bent at the bending portion 1225 so that the first surface 1202 side on which the detection electrode 1300 and the like are arranged protrudes.
  • the substrate 1200 bent at the bending portion 1225 has a shape in which the main body portion 1210 and a portion of the connecting portion 1220 closer to the second end portion 1222 than the bending portion 1225 protrude from the base end portion 1230.
  • the main body 1210 of the substrate 1200 and the portion of the connecting portion 1220 closer to the second end 1222 than the bent portion 2125 has a substantially vertically protruding shape.
  • the sensor 1101 shown in FIG. 41 which includes the substrate 1200 bent at the bending portion 1225 of the connecting portion 1220, does not require tilting the proximal end portion 1230 of the substrate 1200 (for example, FIG. 43), as shown in FIGS. 44), the main body 1210 of the substrate 1200 on which the detection electrode 1300 is arranged is oriented so that the distal end 1201 is the lower end. , it is possible to immerse it in the liquid sample X1 for the measurement of the test substance.
  • a multiple sensor 1105 shown in FIG. 42 is one in which the base end portions 1230 of the substrate 1200 of the four sensors 1101 are integrated.
  • the insulating layer 1050 is disposed in a region of the first surface 1202 of the substrate 1200 that is closer to the second end 1222 than the bent portion 1225 of the main body 1210 and the connecting portion 1220.
  • the second insulating layer 1052 includes a first insulating sheet.
  • the portion of the connecting portion 1220 closer to the second end 1222 than the bent portion 1225 refers to the portion of the connecting portion 1220 from the end of the connecting portion 1220 on the second end 1222 side to the second end 1222. It is a part.
  • the insulating layer 1050 further includes a first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin formed over the entire first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the second insulating layer 1052 including the first insulating sheet includes, in addition to the first insulating sheet, a bonding layer (not shown) including a pressure-sensitive adhesive or an adhesive. and is attached to the above region of the first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the part immersed in the liquid sample is achieved, and the tip opening 1061 and the flow path 1062 can be easily formed in the first insulating sheet of the second insulating layer 1052, which is preferable.
  • the insulating layer 1050 of the sensor 1101 shown in FIG. 41 includes a non-insulating region 1055 that does not include an insulating sheet on the first surface 1202 of the substrate 1200 in the region of the bent portion 1225 of the connecting portion 1220. The effects produced by this configuration will be explained with reference to FIGS. 44 and 45.
  • FIG. 44 is a schematic side view of the sensor 1101 shown in FIG. 41 in which the main body 1210 including the tip 1201 of the substrate 1200 is immersed in the liquid sample X1.
  • the first surface 1202 side of the substrate 1200 protrudes at the bent portion 1225 of the connecting portion 1220, and the bent portion of the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 The portion closer to the second end portion 1222 than 1225 is bent so as to be approximately vertical.
  • the insulating layer 1050 includes a first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin that covers the entire first surface 1202 of the substrate 1200, and A second insulating layer 1052 including a first insulating sheet covers a region of the first surface 1202 of the substrate 1200 that is closer to the second end 1222 than the bent portion 1225 of the main body 1210 and the connecting portion 1220; including.
  • the insulating layer 1050 has a non-insulating region on the first surface 1202 of the substrate 1200, which does not include an insulating sheet but includes a first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin, on the area of the bent portion 1225 of the connecting portion 1220. Contains 1055.
  • the second insulating layer 1052 including the first insulating sheet is flat and not deformed. Therefore, the substrate 1200 is not affected by contraction or expansion that occurs after deforming the first insulating sheet, and the portions of the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 closer to the second end portion 1222 than the bent portion 1225 have a flat shape. Retained. As a result, as shown in FIG. 44, the main body 1210 of the substrate 1200 of the sensor 1101 is held in a vertical position with the tip 1201 as the lower end in the liquid sample X1, and the detection electrode 1300 measures the analyte. can be performed successfully.
  • FIG. 45 shows the same structure as FIGS. 41 and 44 except that the second insulating layer 1052 including the first insulating sheet is formed on the entire first surface 1202 of the substrate 1200, including the area above the bent portion 1225.
  • a comparative example sensor 1151 having the same structure as sensor 1101 is shown.
  • the second insulating layer 1052 including the insulating sheet on the first surface 1202 of the substrate 1200 is stretched by bending the substrate 1200 at the bending portion 1225 . Since the second insulating layer 1052 including the stretched insulating sheet tends to contract, warping as shown in FIG. 45 occurs in the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 of the substrate 1200.
  • the main body portion 1210 of the substrate 1200 that has been warped is inclined with the first surface 1202 side on which the detection electrode 1300 is disposed facing upward. For this reason, as shown in FIG. 45, contact between the liquid sample X1 and the detection electrode 1300 on the first surface 1202 of the main body 1210 is inhibited, and the accuracy of measurement of the analyte by the detection electrode 1300 is reduced.
  • the sensor 1101 shown in FIGS. 41 and 44 overcomes this problem of the sensor 1151 of the comparative example because the insulating layer 1050 includes a non-insulating region 1055 in the region above the bent portion 1225 of the first surface 1202 of the substrate 1200. Eliminate.
  • an insulating layer 1050 is formed on a region of the first surface 1202 of the substrate 1200 that is closer to the second end portion 1222 than the bent portion 1225 of the main body portion 1210 and the connecting portion 1220.
  • a second insulating layer 1052a including a first insulating sheet is disposed, and a second insulating layer 1052b including a second insulating sheet is disposed on a region of the proximal end portion 1230 of the first surface 1202 of the substrate 1200. including.
  • the insulating layer 1050 further includes a first insulating layer 1051 containing an insulating cured resin formed over the entire first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the insulating layer 1050 includes a non-insulating region 1055 that does not include an insulating sheet but includes the first insulating layer 1051 on the first surface 1202 of the substrate 1200 in a region of the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 .
  • the second insulating layer 1052a including the first insulating sheet and the second insulating layer 1052b including the second insulating sheet are respectively arranged in the above region of the first surface 1202 of the substrate 1200 from above the first insulating layer 1051. According to this embodiment, a decrease in detection accuracy due to warping of the substrate 1200 of the sensor 1101 can be suppressed, and the insulation between the wiring 1005 and the terminal 1006 on the base end portion 1230 of the substrate 1200 can be improved.
  • the first insulating sheet of the second insulating layer 1052a and the second insulating sheet of the second insulating layer 1052b are connected to the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 on the first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the regions are separated via a notch 1056 formed in a direction intersecting the direction in which the connecting portion 1220 extends.
  • a plurality of insulating layers 1050 are provided on the first surface 1202 of the substrate 1200 in the region of the bent portion 1225 of the connecting portion 1220, and are separated from the second insulating layers 1052a and 1052b via the notch 1056.
  • a second insulating layer 1052c including a third insulating sheet According to this embodiment, a decrease in detection accuracy due to warping of the substrate 1200 of the sensor 1101 can be suppressed, and the insulation between the wirings 1005 on the bent portion 1225 of the connection portion 1220 of the substrate 1200 can be improved.
  • ⁇ Sensor unit 900> The sensor unit 900 will be described with reference to FIGS. 51, 52, and 53.
  • the illustrated sensor unit 900 is used to position the main body 1210 of the substrate 1200 including the detection electrode 1300 of the sensor 1101 with respect to each well of the 24-well plate 925.
  • the sensor unit 900 includes a lower support plate 957, six sets of multiple sensors 1105 (see FIG. 42), and a port 961 for supplying additives, which are arranged in order from the bottom.
  • An upper support plate 959 and a gasket sheet 960 are provided.
  • the multi-sensor 1105 is formed by connecting four sensors 1101 shown in FIG. 42 at the base end 1230 of the substrate 1200 and integrating them.
  • the first surface 1202 side of the substrate 1200 protrudes at the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 of the substrate 1200, and the side of the first surface 1202 of the substrate 1200 protrudes from the bent portion 1225 of the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 with respect to the base end portion 1230.
  • the portion on the second end 1222 side is bent vertically.
  • six sets of multiple sensors 1105 including four sensors 1101 are attached to the lower support plate 957.
  • the lower support plate 957 is provided with through holes 957b at positions corresponding to the main body portion 1210 and the connection portion 1220 of the substrate 1200 of each of the 24 sensors 1101 included in the 6 sets of multiple sensors 1105.
  • the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 of the substrate 1200 of each of the 24 sensors 1101 are inserted into each of the through holes 957b of the lower support plate 957.
  • the sensor 1101 is inserted into the through hole 957b of the lower support plate 957, as shown in FIG. becomes.
  • bent portion 1225 of the connecting portion 1220 of the substrate 1200 is inserted downward into the portion of the inner peripheral wall of the through hole 957b of the lower support plate 957 that engages with the inside of the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 of the substrate 1200 of the sensor 1101.
  • a first engaging portion 957d is provided to support the first engaging portion 957d.
  • the lower side of the upper support plate 959 is provided with pin-shaped second engaging portions 959a that are inserted into each of the 24 through holes 957b of the lower support plate 957.
  • the first engaging portion 957d of the lower support plate 957 has a curved upper surface shape including a curved upper surface.
  • the second engaging portion 959a of the upper support plate 959 has a lower curved portion shape including a curved lower surface.
  • the sensor 1101 is supported such that the distal end 1201 of the substrate 1200 is the lower end, and the portion of the substrate 1200 on the distal side of the main body 1210 and the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 is vertical.
  • the posture of the main body portion 1210 of the substrate 1200 of the sensor 1101 with respect to the liquid sample contained in each well of the well plate can be stabilized, and the accuracy of detection by the sensor 1101 can be improved.
  • a gasket sheet 960 having through holes is stacked on the upper surface of the upper support plate 959 to complete the sensor unit 900.
  • the sensor unit 900 can be combined with other members to configure an adapter unit 920. As shown in FIG. 53, in the adapter unit 920, an adapter bottom (culture container installation part) 924, a well plate (culture container) 925, an adapter top 926, and a sensor unit 900 are placed in this order from the bottom. In this embodiment, the well plate 925 has 24 4 ⁇ 6 wells.
  • the adapter top 926 is provided to adjust the height of the well plate 925, and different adapter tops 926 are used depending on the height of the well plate 925. This is to adjust the height relationship between the sensor unit 900 and the well plate 925 when the sensor unit 900 is placed on the adapter top 926.
  • the sensor unit 900 placed on the adapter top 926 has four legs (support bodies) 940 provided on its lower surface that pass through the through holes 941 of the lower adapter top 926 and serve as a culture container installation part. is inserted into the positioning hole 942 provided in the adapter bottom 924 of the adapter.
  • the main body 1210 of the substrate 1200 including the detection electrode 1300 of the sensor 1101 is held in a stable posture within each well of the well plate 925. ing.
  • the terminal 1006 on the base end 1230 of the substrate 1200 of the sensor 1101 included in the sensor unit 900 is connected to the external analysis unit 1102 through the through hole of the gasket sheet 960. It can be electrically connected to the chemical measurement section 1111 (see FIG. 48). That is, the adapter unit 920 provided with the sensor unit 900 can configure the analysis apparatus 1100 shown in FIG. 48 by combining with the external analysis unit 1102 and control unit 1104.
  • Example of second disclosure The following five sensors were created as examples or comparative examples of the second disclosure. Note that the sensors S1 to S5 used in the following experiments were not provided with the reagent layers 1315, 1315 and the working electrode protective films 1316, 1316 of the working electrodes 1310, 1310, and the reference electrode protective film 1326 of the reference electrode 1320.
  • Sensor S1 is a comparative example of the structure shown in FIG. 49A.
  • a first insulating layer 1051 and a second insulating layer 1052 including an insulating sheet are laminated over the entire first surface 1202 of the substrate 1200.
  • the tip opening 1061 and the flow path 1062 are not formed, and the portion of the first surface 1202 of the substrate 1200 between the counter electrode 1330 and the tip 1201 is also formed with the first insulating layer 1051 and the second insulating layer. It is covered with an insulating layer 1050 including 1052.
  • the senor S1 does not have the non-insulated region 1055 of the insulating layer 1050 to prevent warping of the substrate 1200, and the tip opening 1061 and flow path 1062 for guiding the liquid sample to the upper surface 1331 of the counter electrode 1330. .
  • the sensor S2 includes a second insulating layer 1052a that includes a first insulating sheet disposed at a portion of the substrate 1200 closer to the tip than the bent portion 1225 of the connecting portion 1220, instead of the second insulating layer 1052 that covers the entire sensor S1. and a second insulating layer 1052b including a second insulating sheet disposed on the base end portion 1230 of the substrate 1200, and an insulating sheet including the first insulating layer 1051 on the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 of the substrate 1200.
  • a non-insulating region 1055 that does not include is arranged.
  • the senor S2 has a non-insulated region 1055 of the insulating layer 1050 to prevent warping of the substrate 1200, but also has a tip opening 1061 and a channel 1062 for guiding the liquid sample to the upper surface 1331 of the counter electrode 1330. do not have.
  • sensor S3 Sensor S3 is an example of sensor 1101 having the structure shown in FIG. 49C. Similar to the sensor 1101 shown in FIG. 46, the sensor S3 includes a non-insulating region 1055 of the insulating layer 1050 to prevent warping of the substrate 1200, and a tip opening 1061 and a flow path 1062 formed only in the second insulating layer 1052. (See FIG. 36).
  • sensor S4 Sensor S4 is an example of sensor 1101 having the structure shown in FIG. 49D.
  • the second insulating layer 1052a including the first insulating sheet of the insulating layer 1050 and the second insulating layer 1052b including the second insulating sheet are integrated into an integrated structure that covers the entire first surface 1202 of the substrate 1200.
  • a second insulating layer 1052 including an insulating sheet is substituted, and a portion 1515 (see FIGS. 36 and 49C) of the first insulating layer 1051 between the counter electrode 1330 and the tip 1201 of the substrate 1200 is peeled off to form a tip. It has an opening 1061 and a flow path 1062.
  • the sensor S4 does not have the non-insulating region 1055 of the insulating layer 1050 for preventing the substrate 1200 from warping, and the tip opening 1061 and the flow path formed in the first insulating layer 1051 and the second insulating layer 1052 1062 (see FIG. 38).
  • sensor S5 Sensor S5 is an example of sensor 1101 having the structure shown in FIG. 49E.
  • the sensor S5 in the sensor S3, a portion 1515 (see FIGS. 36 and 49C) of the first insulating layer 1051 between the counter electrode 1330 and the tip 1201 of the substrate 1200 is peeled off to form the tip opening 1061 and the flow path 1062. That is.
  • the sensor S5 includes a non-insulating region 1055 of the insulating layer 1050 for preventing warping of the substrate 1200, a tip opening 1061 and a flow path 1062 formed in the first insulating layer 1051 and the second insulating layer 1052 (see FIG. 38).
  • substrate As an insulating substrate, a 188 ⁇ m thick substrate 1200 made of polyethylene terephthalate and including a main body portion 1210, a connecting portion 1220, and a base end portion 1230 and having a shape shown in FIGS. 49A to 49E was used.
  • the main body 1210 of the substrate 1200 was a rectangle with a width of 11 mm and a width of 4.2 mm.
  • the bent portion 1225 of the connecting portion 1220 of the substrate 1200 protrudes toward the first surface 1202, and the portion of the main body portion 1210 and the connecting portion 1220 that is closer to the tip than the bent portion 1225 is formed. , and bent so as to be perpendicular to the proximal end 1230.
  • a conductive layer 1321, a counter electrode (counter electrode conductive layer) 1330, a wiring 1005, and a terminal 1006 were formed.
  • first insulating layer 1051 On the first surface 1202 of the substrate 1200 on which the carbon conductive layer is disposed, as shown in FIG. A first insulating layer 1051 having a length of 5 ⁇ m was laminated.
  • the first insulating layer 1051 is formed by applying a curable resin composition (negative resist composition) that is cured by active energy ray irradiation to produce an insulating cured resin, and irradiating the coating film with active energy rays. did.
  • Appropriate masking was performed to form working electrode first openings 1511, 1511, reference electrode first opening 1512, and counter electrode first opening 1513 in the first insulating layer 1051.
  • a silver/silver chloride layer 1322 was placed inside the reference electrode first opening 1512 of the first insulating layer 1051.
  • a second insulating layer 1052 was disposed in a predetermined region on the first surface 1202 of the substrate 1200 on which the carbon conductive layer and the first insulating layer 1051 were disposed.
  • a second insulating layer 1052 which is a laminate of a 50 ⁇ m thick polyethylene terephthalate sheet (insulating sheet) whose surface has been water-repellent treated and a 10 ⁇ m thick bonding layer containing an adhesive, is attached to the substrate via the bonding layer.
  • 1200 was attached to a predetermined area on the first insulating layer 1051 disposed on the first surface 1202.
  • the working electrode second openings 1521, 1521 and the reference electrode second opening 1522 were each circular with a diameter of 2.0 mm.
  • the second opening 1523 of the counter electrode was a rectangle with a width of 2.1 mm in the horizontal direction of the main body 1210 and a width of 1.8 mm in the vertical direction.
  • sensors S1 to S5 were used in which the reagent layers 1315, 1315 and the working electrode protective films 1316, 1316 of the working electrodes 1310, 1310, and the reference electrode protective film 1326 of the reference electrode 1320 were not provided.
  • a 24-well plate was prepared, each having cylindrical wells with a depth of 17.40 mm, a well bottom diameter of 16.26 mm, and a well diameter of 15.62 mm. 0.85 mL, 0.94 mL, 1.0 mL, or 1.2 mL of RPMI medium supplemented with 500 ⁇ M ascorbic acid (hereinafter referred to as "liquid sample X1") was added to each well of the 24-well plate.
  • the sensors S1 to S5 are held horizontally with the base end 1230 of the substrate 1200 facing upward, and the main body 1210 of the substrate 1200 is held with the distal end 1201 facing upward.
  • the samples were immersed in each volume of liquid sample X1 in the wells so that
  • the voltage difference between the working electrodes 1310 and 1310 (not including the reagent layer and protective film) of each of the sensors S1 to S5 and the reference electrode 1320 (not including the protective film) was controlled by a potentiostat to be 500 mV.
  • the current values between each of the two working electrodes 1310, 1310 and the counter electrode 1330 were measured over time until 0.7 hours later. Further, in order to confirm whether the liquid sample X1 was in contact with the counter electrode 1330, the voltage of the counter electrode 1330 was measured over time.
  • the measurement was performed while vibrating the 24-well plate after a certain period of time had passed after the start of the measurement.
  • FIG. 50 shows the measurement results of the current values of the two working electrodes 1310 and 1310 when each of the four volumes of liquid samples is used for each of the sensors S1 to S5.
  • FIG. 50A shows the results for sensor S1
  • FIG. 50B shows the results for sensor S2
  • FIG. 50C shows the results for sensor S3
  • FIG. 50D shows the results for sensor S4,
  • FIG. 50E shows the results for sensor S5. .
  • Patent Document 2 discloses a cell culture analysis device having a cartridge that fits into a plate provided with a plurality of cell culture vessels.
  • the cell culture analyzer of Patent Document 2 has sensors that measure the inside of each culture container, and a plurality of openings into which these sensors are inserted are provided in the cartridge, and the sensors and fiber cables are connected in each opening. is connected. These plurality of fiber cables are connected to an external control unit.
  • the sensor of the cell culture analyzer described in Patent Document 2 has the following problems.
  • a second object of the disclosure is to provide a sensor and a sensor unit including the same, in which interference with contact of a liquid sample to a detection electrode of the sensor is suppressed when the sensor is immersed in a liquid sample.
  • a sensor used while immersed in a liquid sample an insulating substrate including a tip portion immersed in the liquid sample; a detection electrode disposed near the tip on the first surface of the substrate and including a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode; Wiring arranged on the first surface of the substrate and connected to the detection electrode; an insulating layer disposed on the first surface of the substrate and formed to cover at least a portion of the detection electrode and the wiring; a tip opening formed in the insulating layer that communicates with the upper surface of the counter electrode and opens toward the tip of the substrate; A sensor comprising: a channel formed in the insulating layer, connecting the tip opening and the upper surface of the counter electrode, and guiding the liquid sample from the tip opening to the upper surface of the counter electrode.
  • the insulating layer includes a counter electrode opening that penetrates in the thickness direction and is formed at a position overlapping with the counter electrode in a plan view from the thickness direction of the substrate, the upper surface of the counter electrode is exposed through the counter electrode opening;
  • the sensor described in Appendix 1. (Additional note 3)
  • the insulating layer includes: a working electrode opening penetrating in the thickness direction formed at a position overlapping with the working electrode in a plan view from the thickness direction of the substrate; a reference electrode opening formed in a position overlapping with the reference electrode and penetrating in the thickness direction;
  • the working electrode includes a working electrode protective film disposed within the working electrode opening,
  • the reference electrode includes a reference electrode protective film disposed within the reference electrode opening.
  • the insulating layer is a first insulating layer containing an insulating cured resin, disposed on the first surface of the substrate; a second insulating layer including an insulating sheet, disposed on the first insulating layer, the tip opening and the flow path are formed in the second insulating layer;
  • the sensor described in any one of Supplementary Notes 1 to 3. (Appendix 5) The tip opening and the flow path are further formed in the first insulating layer.
  • the sensor described in Appendix 4. (Appendix 6) The sensor according to any one of Supplementary Notes 1 to 5, wherein the flow path has an expanded portion that expands the flow path width toward the tip opening.
  • the substrate is a main body portion including the tip portion and a first end portion opposite to the tip portion, and in which the detection electrode is disposed;
  • the main body includes a second end connected to the first end, and a third end opposite to the second end, and extends from the second end to the third end.
  • the connecting portion of the substrate includes a bending portion near the third end portion that bends the substrate so that the first surface side protrudes.
  • the insulating layer is a first insulating layer disposed on a region of the main body portion and a portion of the connecting portion closer to the second end than the bent portion on the first surface of the substrate. including sheets, The sensor described in Appendix 7. (Appendix 9) The insulating layer has a non-insulating area that does not include an insulating sheet on the first surface of the substrate, on the area of the bending part of the connecting part. The sensor described in Appendix 8.
  • the insulating layer further includes a second insulating sheet disposed on the base end region of the first surface of the substrate, The first insulating sheet and the second insulating sheet are separated on the first surface of the substrate in the region of the bent portion of the connecting portion,
  • the sensor according to appendix 8 or 9. (Appendix 11) The sensor according to any one of Supplementary Notes 1 to 10, and A sensor unit including a support member including an engaging part that engages with the substrate of the sensor and supports the sensor so that the tip end of the substrate becomes a lower end.
  • the material thereof is not particularly limited, but for example, the same material as the insulating substrate of the sensor according to the first disclosure of this specification may be used. Available.
  • the conductive layer included in the working electrode, reference electrode, and counter electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification is a layer containing a conductive material such as carbon or gold.
  • the conductive layer can be manufactured by forming a layer of the conductive material as described above on the surface of the substrate using a sputtering method, a vapor deposition method, a screen printing method, or the like.
  • the conductive layer can be processed into a predetermined pattern using a laser trimming method, if necessary.
  • the conductive layer of the working electrode may be referred to as the working electrode conductive layer
  • the conductive layer of the reference electrode may be referred to as the reference electrode conductive layer.
  • the conductive layer of the counter electrode is simply referred to as a counter electrode because the conductive layer itself constitutes the counter electrode. More preferred embodiments of the conductive materials constituting the working electrode conductive layer and the counter electrode are as described below.
  • the wiring of the sensor according to the third disclosure of this specification can also be made of the same conductive material as the conductive layer.
  • the sensor according to the third disclosure of this specification is used to detect a predetermined analyte (analyte) in the liquid sample by being immersed in the liquid sample.
  • the liquid sample contains water as a solvent.
  • the liquid sample include a cell culture solution and a liquid sample prepared using blood obtained from a living body.
  • the test substance are as described with respect to the test substance by the sensor of the first disclosure of this specification, and particularly preferably one or more selected from glucose and lactic acid.
  • the liquid sample is preferably a liquid sample containing cells, especially living cells, and particularly preferably a cell culture solution.
  • the working electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification includes a reagent layer disposed on the working electrode conductive layer and containing a reagent involved in the redox reaction of the analyte.
  • the reagent can be appropriately selected depending on the test substance.
  • the reagent may include a combination of an oxidoreductase and a mediator (electron carrier), or an oxidoreductase. Oxidoreductases can include coenzymes.
  • oxidoreductases examples include oxidases and dehydrogenases. Specific examples of oxidoreductases are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein, and may particularly preferably be glucose oxidase, lactate oxidase, glucose dehydrogenase or lactate dehydrogenase.
  • the mediator is not particularly limited, and examples thereof are as described with respect to the sensor of the first disclosure of this specification.
  • the reagent layer included in the working electrode of the sensor according to the third disclosure of the present specification can further contain components such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • a buffer such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • hydrophilic polymer compounds and conductive carbon fillers are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein.
  • the working electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification can further include a protective film.
  • the protective film on the working electrode can be a film that prevents or suppresses leakage of the reagent contained in the reagent layer to the outside of the protective film and is permeable to the test substance present outside the protective film.
  • the protective film having such properties preferably contains a polymer compound.
  • the polymer compound contained in the protective film include a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit and a polymer compound containing a cation exchange functional group.
  • Examples of the polymer compound containing a cation exchange functional group include a polymer compound having proton conductivity.
  • Examples of cation exchange functional groups include anionic functional groups.
  • Examples of the polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit and the polymer compound having proton conductivity are as described with respect to the sensor disclosed in the first disclosure of this specification.
  • the protective film included in the working electrode of the sensor of the third disclosure herein can be a laminate of two or more protective films, an example of which is as described with respect to the sensor of the first disclosure herein. That's right.
  • Another suitable example of the protective film included in the working electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification is a protective film containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit.
  • the reference electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification can be provided with a protective film.
  • the protective film of the reference electrode can be made of the material described above for the protective film of the working electrode.
  • the counter electrode of the sensor according to the third disclosure of this specification may be covered with a protective film. Preferred embodiments of the protective film covering the counter electrode will be described later.
  • a portion of the electrode including a working electrode and a counter electrode disposed on an insulating substrate other than the portion that contacts the liquid sample may be covered with an insulating layer.
  • the insulating layer can contain an insulating resin.
  • the insulating layer can have a multilayer structure of two or more layers.
  • the multilayer insulating layer can include, for example, a first insulating layer disposed on an insulating substrate and a conductive layer, and a second insulating layer disposed on the first insulating layer. Preferred embodiments of the materials constituting the first insulating layer and the second insulating layer are as described with respect to the sensor according to the first disclosure.
  • the sensor 300 of this embodiment includes an insulating substrate 2, a first working electrode 10a, a second working electrode 10b, and a reference electrode arranged on the first surface 2a of the substrate 2. 20 and a counter electrode 60, and a wiring 50 electrically connected to each of the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 60.
  • the sensor 300 of this embodiment includes two working electrodes, in another embodiment not shown, there may be only one working electrode, or three or more working electrodes.
  • the first working electrode 10a and the second working electrode 10b are not distinguished, they may be expressed as working electrodes 10a and 10b.
  • the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 60 may be collectively referred to as an electrode.
  • the sensor 300 of this embodiment is a three-electrode sensor that includes a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode as electrodes, it may be a bipolar sensor that does not include a reference electrode but only includes a working electrode and a counter electrode.
  • the reference electrode and/or the counter electrode may be provided on a substrate different from the substrate on which the working electrode is arranged.
  • the sensor 300 is used to detect a predetermined analyte in the liquid sample X by being immersed in the liquid sample X, in the same way as shown in FIG. 21 regarding the sensor 1 of the first disclosure.
  • Specific examples of the liquid sample and test substance are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the working electrodes 10a and 10b of the sensor 300 include working electrode conductive layers 11a and 11b, and reagent layers 15a and 15b containing reagents involved in the redox reaction of the test substance in the liquid sample.
  • reagent layers 15a and 15b containing reagents involved in the redox reaction of the test substance in the liquid sample.
  • Preferred embodiments of the reagent are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the reagent layers 15a and 15b of the working electrodes 10a and 10b of the sensor 300 contain a reagent that oxidizes the analyte in the liquid sample
  • the analyte is removed from the analyte under the condition that a predetermined voltage is applied to the electrodes of the sensor 300. Electrons move to the working electrode conductive layers 11a and 11b.
  • the reagent layers 15a and 15b contain a reagent that reduces the analyte in the liquid sample
  • electrons move from the working electrode conductive layers 11a and 11b to the analyte. Since the amount of moving electrons depends on the concentration of the test substance, the concentration or change in concentration of the test substance in the liquid sample is measured based on the current value or change in the current value flowing through the working electrodes 10a and 10b of the sensor 300. can do.
  • the sensor 300 can constitute an analysis device for analyzing a test substance in a liquid sample.
  • the analysis device includes a sensor 300, an analysis unit 102, and a control unit 104 in which the sensor 1 according to the first disclosure is replaced with the sensor 300 according to the third disclosure in the analysis device 100 shown in FIG.
  • An example of this is an analyzer equipped with the following. The functions of this analyzer are as described with respect to the analyzer 100 shown in FIG. 24.
  • FIG. 54 and FIGS. 55, 56, and 57 are cross-sectional views thereof.
  • the structure of the reference pole 20 of the sensor 300 according to the third disclosure is the same as the structure of the reference pole 20 of the sensor 1 according to the first disclosure.
  • the description of the reference pole 20 of the sensor 1 according to the first disclosure with reference to FIG. 22 is cited as the description of the reference pole 20 of the sensor 300 according to the third disclosure.
  • the sensor 300 includes an insulating substrate 2, working electrode conductive layers 11a and 11b, a counter electrode 60, a reference electrode conductive layer 21, and a wiring 50, which are arranged on the first surface 2a of the substrate 2.
  • the counter electrode 60 is entirely made of a conductive layer. To specifically refer to the conductive layer portion of the counter electrode, it may also be referred to as a "counter electrode conductive layer” or "counter electrode conductive layer.”
  • a first insulating layer 3 is further arranged on the first surface 2a of the substrate 2, and a second insulating layer 4 is further arranged on the first insulating layer 3.
  • the height of the upper surface of the first insulating layer 3 from the first surface 2a of the substrate 2 is the height of the working electrode conductive layers 11a, 11b, the counter electrode 60, the reference electrode conductive layer 21, and the wiring 50 from the first surface 2a of the substrate 2. greater than the height from. Therefore, a part of the first insulating layer 3 is arranged on the working electrode conductive layers 11a, 11b, the counter electrode 60, the reference electrode conductive layer 21, and the wiring 50.
  • the first insulating layer 3 includes a counter electrode first opening 302 formed at a position overlapping a part of the counter electrode 60 and penetrating through the substrate 2 in the thickness direction T.
  • the second insulating layer 4 includes a second counter-electrode opening 402 that is formed in a position overlapping the entire counter-electrode first opening 302 of the first insulating layer 3 and that penetrates through the substrate 2 in the thickness direction T.
  • the counter electrode 60 is exposed to the outside through the first counter electrode opening 302 and the second counter electrode opening 402 .
  • a portion 60a of the counter electrode 60 that comes into contact with the liquid sample when the sensor 300 is immersed in the liquid sample is located at the bottom of the recess formed by the first opening 302 of the counter electrode.
  • the working electrodes 10a and 10b include working electrode conductive layers 11a and 11b, and a reagent that is disposed on the working electrode conductive layers 11a and 11b and is involved in the redox reaction of the test substance. It includes reagent layers 15a and 15b. Preferred embodiments of the reagent in the reagent layers 15a and 15b are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the former in order to distinguish between the "reagent layer 15a" of the first working electrode 10a and the “reagent layer 15b" of the second working electrode 10b, the former is The latter may be referred to as the "second reagent layer 15b" of the second working electrode 10b.
  • the reagent included in the reagent layer 15a of the first working electrode 10a may be referred to as a "first reagent”
  • the reagent included in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b may be referred to as a "second reagent”.
  • the sensor 300 includes a plurality of working electrodes 10a, 10b, and a first reagent contained in the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a among the plurality of working electrodes 10a, 10b;
  • the second reagents contained in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b, which is different from the working electrode 10a, are different from each other.
  • the first reagent participates in the redox reaction of the first analyte in the liquid sample
  • the second reagent is different from the first analyte in the liquid sample. Since it can participate in the redox reaction of the second analyte, it can be used to detect a plurality of analytes including the first analyte and the second analyte in a liquid sample.
  • the working electrodes 10a and 10b can include protective films 16a and 16b disposed on the reagent layers 15a and 15b.
  • Preferred embodiments of the protective films 16a and 16b are as described in the ⁇ Material> column.
  • a first protective film 16a consisting of a single layer is disposed on the first reagent layer 15a
  • a protective film 16b consisting of a second protective film 16ba and a third protective film 16bb is disposed on the second reagent layer 15b.
  • the protective films 16a and 16b are not limited to this example, and may have the same structure, or may have another structure not shown.
  • the first insulating layer 3 has a first working electrode formed in a position overlapping with a portion of each of the working electrode conductive layers 11a and 11b and extending through the substrate 2 in the thickness direction T. It includes openings 303a and 303b. Further, the second insulating layer 4 has a working electrode hole formed in the first insulating layer 3 at a position that overlaps with a portion that includes the whole of the first working electrode openings 303a and 303b, and which penetrates through the thickness direction T of the substrate 2. Two openings 403a and 403b are provided.
  • the working electrodes 10a, 10b are exposed to the outside through the working electrode first openings 303a, 303b and the working electrode second openings 403a, 403b. Portions 11a1 and 11b1 of the working electrode conductive layers 11a and 11b that come into contact with the liquid sample when the sensor 300 is immersed in the liquid sample are located at the bottom of the recess formed by the working electrode first openings 303a and 303b. . Further, the reagent layers 15a and 15b are contained in the first working electrode openings 303a and 303b, and the outer periphery of the reagent layers 15a and 15b is defined by the inner periphery of the first working electrode openings 303a and 303b. The protective films 16a, 16b are enclosed in the working electrode second openings 403a, 403b, and the outer peripheral edges of the protective films 16a, 16b are defined by the inner peripheral edges of the working electrode second openings 403a, 403b.
  • ⁇ Suppression of hydrogen peroxide generation by sensor 300> When the sensor 300 according to the third disclosure is immersed in a liquid sample and electrochemically measures an analyte in the liquid sample, the sensor 300 suppresses and/or generates hydrogen peroxide during measurement. By reducing the concentration of hydrogen peroxide, the concentration of hydrogen peroxide in the liquid sample is maintained at less than 15 ⁇ M during the measurement. Hydrogen peroxide is known to be toxic to cells. For this reason, when using an electrochemical sensor to continuously measure a test substance in a liquid sample containing cells, such as a cell culture medium, over a long period of several days or more, the concentration of hydrogen peroxide during measurement must be It is desirable to suppress the increase.
  • the sensor 300 it is possible to maintain the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample at a low concentration of less than 15 ⁇ M during the measurement without causing a significant decrease in the detection sensitivity of the analyte.
  • measuring the test substance in a liquid sample electrochemically means, for example, connecting the sensor 300 immersed in the liquid sample to a potentiostat, and using the reference electrode 20 as a reference, the working electrodes 10a, 10b. It refers to detecting the current between the working electrodes 10a, 10b and the counter electrode 60 when a predetermined potential is applied to the electrodes, and measuring the analyte based on the detected current. Electrochemical measurements using the sensor 300 are typically carried out over a period of several hours or days, such as one hour or more, preferably 72 hours (3 days) or more, and more preferably 96 hours (4 days) or more.
  • Sensor 300 maintains the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample below 15 ⁇ M during this period.
  • the hydrogen peroxide concentration of the liquid sample during said period is more preferably maintained below 10 ⁇ M.
  • the counter electrode 60 includes a catalyst for decomposing hydrogen peroxide in the portion 60a that contacts the liquid sample.
  • the generation of hydrogen peroxide is thought to be mainly caused by a reaction on the counter electrode 60 in which oxygen (O 2 ) in the liquid sample is reduced to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
  • oxygen (O 2 ) in the liquid sample is reduced to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
  • the generation of hydrogen peroxide on the counter electrode 60 can be a problem.
  • the working electrodes 10a, 10b are used, which are provided with reagent layers 15a, 15b containing oxidase, dehydrogenase, etc. involved in the oxidation of the test substance.
  • reagent layers 15a, 15b containing oxidase, dehydrogenase, etc. involved in the oxidation of the test substance.
  • the sensor 300 which includes the counter electrode 60 containing a catalyst that decomposes hydrogen peroxide in the portion 60a that contacts the liquid sample, oxygen (O 2 ) in the liquid sample is converted to water (H 2 O) on the counter electrode 60 during measurement. ), the generation of hydrogen peroxide is suppressed.
  • the reagents contained in the reagent layers 15a and 15b of the working electrodes 10a and 10b there are reagents that involve a reaction that generates hydrogen peroxide during measurement (for example, oxidase and dehydrogenase).
  • the hydrogen peroxide generated on the working electrodes 10a and 10b is also decomposed into water by the catalyst included in the counter electrode 60, so that the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample being measured is reduced. increase may be suppressed.
  • the catalyst can be, for example, a catalyst containing a metal.
  • Catalysts containing metals are preferred because they are more stable than organic catalysts such as catalase.
  • a catalyst containing metal a catalyst containing one or more selected from platinum, nickel, palladium, iron, manganese, and tungsten is preferable, and a catalyst containing platinum is particularly preferable.
  • Catalysts containing these metals are preferred because they have a high activity for decomposing hydrogen peroxide, and catalysts containing platinum are particularly preferred from the viewpoint of catalytic activity and stability.
  • the catalyst may be included in the portion of the counter electrode that contacts the liquid sample, may be contained only in the portion that contacts the liquid sample, or may be contained in the entire counter electrode. It's okay. Further, the catalyst may be included in the counter electrode as a film that coats the surface of at least the part that contacts the liquid sample, or it may be contained in the counter electrode as a film that covers the surface of at least the part that contacts the liquid sample, or it may be dispersed in a conductive material that constitutes the entire counter electrode or at least the part that contacts the liquid sample. It may be included in the state.
  • the counter electrode in which the catalyst is included as a film that covers the surface of the part that contacts the liquid sample for example, a metal that can be used as the catalyst is applied to the liquid by sputtering, plating, etc.
  • a counter electrode obtained using a dispersion containing particles of the catalyst in a liquid medium is preferred because it can be produced by a simple method such as coating or printing.
  • the catalyst particles include particles of the metals described above, with platinum particles being particularly preferred.
  • the platinum particles are preferably platinum nanoparticles having an average particle diameter of less than 1 ⁇ m, for example, 800 nm or less, preferably 600 nm or less.
  • examples of the counter electrode in which the catalyst is contained in a dispersed state in a conductive material that constitutes the entire counter electrode or at least a portion that contacts a liquid sample include particles of the catalyst and the conductive material.
  • examples include counter electrodes obtained by forming the whole or at least the part that contacts the liquid sample using a pasty or liquid composition containing particles of . Since the counter electrode of this embodiment can contain the catalyst at the same time as forming the counter electrode on the substrate, it can be produced with a small number of steps.
  • examples of the catalyst particles include particles of the metals described above, with platinum particles being particularly preferred. Preferred embodiments of the platinum particles are as described above.
  • the counter electrode can contain carbon, gold, etc. as a conductive material, and preferably contains carbon as a conductive material.
  • carbon conductive carbon materials such as glassy carbon, carbon black, graphite, diamond-like carbon, graphene, carbon nanotubes, and fullerene can be used.
  • the content of the catalyst in the counter electrode can be appropriately set depending on the type and activity of the catalyst.
  • the platinum particles are contained in an amount of, for example, 0.5% by weight or more based on the carbon. , preferably 1% by weight or more, more preferably 3% by weight, particularly preferably 5% by weight or more, and the upper limit is not particularly limited, but from a cost perspective it is preferably 50% by weight or less (the ratio of the platinum particles to the carbon is, for example, 0%). 5% by weight or more and 50% by weight or less), more preferably 30% by weight or less, and most preferably 10% by weight or less.
  • the ratio of carbon to platinum particles within this range, it is possible to suppress an increase in the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample during the measurement period.
  • the surface of the counter electrode may be further covered with a protective film.
  • the protective film covering the counter electrode preferably contains a polymer compound having a cation exchange functional group, particularly a polymer compound having a cation exchange functional group in a side chain.
  • examples of the polymer compound having a cation exchange functional group include a polymer compound containing a structural unit having a sulfonic acid group, preferably a perfluoro compound having a sulfonic acid group in the side chain.
  • a polymeric compound particularly preferably a copolymer of tetrafluoroethylene and perfluoro-2-(2-fluorosulfonylethoxy)propyl vinyl ether, most preferably Nafion®.
  • Anions such as chloride ions, organic acid ions, etc. that may be included in the liquid sample can adversely affect the activity of catalysts that decompose hydrogen peroxide, such as platinum catalysts.
  • a protective film containing a polymer compound having a cation exchange functional group it is possible to prevent anions from coming into contact with the counter electrode, thereby suppressing a decrease in the activity of the catalyst.
  • the working electrode conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b have at least the portions 11a1 and 11b1 that come into contact with the liquid sample, and preferably the entire portion contains a catalyst that decomposes hydrogen peroxide. It is preferable not to include it.
  • the working electrode conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b of the sensor 300 contain the catalyst, particularly a catalyst containing platinum, there is a possibility that background noise during measurement may increase and the current response value may decrease. .
  • the working electrode conductive layer 11a, 11b or the portion 11a1, 11b1 that does not contain a catalyst that decomposes hydrogen peroxide is a layer of a conductive material such as carbon, gold, etc. that does not contain a catalyst that decomposes hydrogen peroxide, or a portion thereof. Can be mentioned.
  • the working electrode conductive layers 11a and 11b of the working electrodes 10a and 10b are three electrodes including the working electrode conductive layers 11a and 11b as a working electrode, a silver silver chloride (saturated KCl) electrode as a reference electrode, and a platinum electrode as a counter electrode. It was measured when a potential in the range of -0.2V to 0.3V (vs. the silver-silver chloride (saturated KCl) electrode) was applied to the working electrode conductive layer in phosphate buffered saline using a formula electrolytic cell. satisfies the condition that the current value is ⁇ 5.5 nA/mm 2 or less.
  • the sensor 300 including the working electrode conductive layers 11a and 11b that satisfies this condition is preferable because the background current when measuring the analyte is sufficiently small and the responsiveness of the sensor is high.
  • working electrode conductive layers 11a and 11b include a carbon conductive layer containing carbon, and more preferably a carbon conductive layer that does not contain a catalyst that decomposes hydrogen peroxide, such as a catalyst containing platinum.
  • the carbon those exemplified for the conductive material of the counter electrode 60 can be used.
  • the current value of ⁇ 5.5 nA/mm 2 or less means that the vertical projected area of the portion of the working electrode conductive layers 11a and 11b used as the working electrode that comes into contact with the phosphate buffered saline is 1 mm 2 This means that the absolute value of the current value per unit is 5.5 nA or less.
  • the measurement of the current value using the above three-electrode electrolytic cell can be performed by the procedure described in ⁇ Third Disclosure/Experiment 5> mentioned above.
  • the present inventors further found that in the sensor 300 according to the present disclosure, in an embodiment in which the portion 60a of the counter electrode 60 that contacts the liquid sample includes a catalyst containing platinum, a negative current with a large absolute value can be caused to flow at a low potential.
  • the counter electrode 60 containing a platinum-containing catalyst in the portion 60a that contacts the liquid sample can efficiently function as a counter electrode with a smaller area compared to a counter electrode that does not contain a platinum-containing catalyst, thereby reducing the sensor size.
  • the projected area of the counter electrode 60 is preferably 250% or less, more preferably 100% or less, and preferably 3% or more of the projected area of the working electrode conductive layers 11a and 11b.
  • the projected area of the counter electrode can be, for example, 3% or more and 250% or less of the projected area of the working electrode conductive layer), more preferably 10% or more.
  • the sensor 300 including the counter electrode 60 containing a platinum-containing catalyst in the portion 60a that contacts the liquid sample is also suitable for a case where a plurality of working electrodes 10a and 10b are provided as shown in the figure.
  • the projected area of the counter electrode 60 refers to the vertical projected area of the portion 60a of the counter electrode 60 that contacts the liquid sample (corresponding to the bottom surface of the recess formed by the first counter electrode opening 302).
  • the projected area of the working electrode conductive layers 11a, 11b is the area of the portions 11a1, 11b1 of the working electrode conductive layers 11a, 11b that come into contact with the liquid sample (corresponding to the bottom surfaces of the recesses formed by the working electrode first openings 303a, 303b). , refers to the projected area in the vertical direction, and if a plurality of working electrodes 10a, 10b are present, refers to the total area thereof.
  • Example of third disclosure> In experiments 1 to 7 of the sensor according to the third disclosure, a sensor 300 having the configuration shown in FIG. 54 was used as an example and a comparative example of the sensor of the third disclosure.
  • substrate Similar to the first disclosed example, a 188 ⁇ m thick substrate made of polyethylene terephthalate and having the shape shown in FIG. 54 was used as the insulating substrate 2.
  • the electrode conductive layers 11a, 11b, the reference electrode conductive layer 21, the counter electrode (counter electrode conductive layer) 60, and the wiring 50 electrically connected to each of them were formed of a carbon conductive layer with a thickness of 5 ⁇ m.
  • first insulating layer (first insulating layer) Subsequently, the first surface 2a of the substrate 2 and the carbon conductive layer made of a fluororesin containing a copolymer containing vinylidene fluoride and hexafluoropropylene are placed on the first surface 2a of the substrate 2 on which the carbon conductive layer is disposed. A covering first insulating layer 3 having a thickness of 5 ⁇ m on the carbon conductive layer was laminated. The method for manufacturing the first insulating layer 3 is as described in the first disclosed embodiment.
  • the first working electrode opening 303a on the first working electrode conductive layer 11a of the first insulating layer 3 has a circular diameter of 1.2 mm
  • the working electrode first opening 303b on the second working electrode conductive layer 11b has a circular shape with a diameter of 1.2 mm.
  • the reference electrode first opening 301 was a circle with a diameter of 1.1 mm
  • the counter electrode first opening 302 was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • the working electrode second openings 403a and 403b of the second insulating layer 4 on the working electrode conductive layers 11a and 11b were each circular with a diameter of 2 mm.
  • the second opening 401 of the reference electrode was a circle with a diameter of 2 mm, and the second opening 402 of the counter electrode was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • First working electrode (for glucose measurement) reagent layer) A sodium phosphate buffer (pH 7.4), a carbon black dispersion, a polymer-bonded mediator, and glucose oxidase are placed in water in the working electrode first opening 303a of the first insulating layer 3 on the first working electrode conductive layer 11a. A droplet of 0.4 ⁇ L of the first liquid composition A containing a crosslinking agent and a crosslinking agent was formed and dried to form a first reagent layer 15a containing glucose oxidase and a mediator.
  • a first liquid composition B (P4VP-tBuMA polymer dispersion) was prepared by mixing the following reagents in ethanol to the following final concentrations and reacting for about 1 hour.
  • ⁇ P4VP-tBuMA Mn of poly-4-vinylpyridine: 74,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 87,000, Mw/Mn: 1.16, manufactured by NARD
  • final concentration 5.72 wt% ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.9 wt%
  • a droplet of 0.65 ⁇ L of the first liquid composition B is formed in the second working electrode opening 403a of the second insulating layer 4 on the first working electrode 10a, dried, and then the first liquid composition B is dried. 1 A droplet of 0.65 ⁇ L of liquid composition B was formed and dried to form a first protective film 16a.
  • a dispersion liquid was prepared.
  • the resulting Nafion (registered trademark) dispersion having a concentration of 16.12 wt % was designated as a second liquid composition B.
  • This second liquid composition B includes Nafion® in a solvent containing a lower alcohol.
  • a droplet of 0.60 ⁇ L of the second liquid composition B is formed in the second working electrode opening 403b of the second insulating layer 4 on the second working electrode 10b, and dried to form a second protective film 16ba. was formed.
  • the same composition as the first liquid composition B (P4VP-tBuMA polymer dispersion) was used as a third liquid composition B in the following treatment. That is, a droplet of 0.65 ⁇ L of the third liquid composition B is formed in the second working electrode opening 403b of the second insulating layer 4 on which the second protective film 16ba is formed, and dried. 3 protective film 16bb was formed. In this way, a protective film 16b, in which the third protective film 16bb was laminated on the second protective film 16ba, was formed on the second working electrode 10b.
  • Reference pole Since the cross-sectional structure of the reference electrode 20 is the same as that shown in FIG. 22 regarding the sensor of the first disclosure, a method for manufacturing the reference electrode 20 will be outlined below with reference to FIG. 22.
  • a silver-silver chloride paste was applied on the reference electrode conductive layer 21 in the reference electrode first opening 301 of the first insulating layer 3 and heated at 140° C. for 1 hour to form a silver-silver chloride layer 22 .
  • the reference electrode protective film 23 was placed on the silver-silver chloride layer 22 in the reference electrode second opening 401 of the second insulating layer 4, thereby forming the reference electrode 20.
  • Experiment 1-1 In the above method, a carbon conductive layer was formed using an ordinary carbon paste that did not contain a catalyst such as platinum, and the sensor 300 of Experiment 1-1 was manufactured. In the sensor of Experiment 1-1, the working electrode conductive layers 11a and 11b, the reference electrode conductive layer 21, and the counter electrode (counter electrode conductive layer) 60 were all made of carbon conductive layers that did not contain a catalyst that decomposed hydrogen peroxide.
  • Experiment 1-2 After forming a carbon conductive layer using a normal carbon paste that does not contain a catalyst such as platinum, platinum was deposited only on the counter electrode 60 before forming the first insulating layer 3.
  • the sensor 300 of Experiment 1-2 was manufactured using the above procedure.
  • the counter electrode 60 has a portion 60a exposed through the counter electrode first opening 302 of the first insulating layer 3 and the counter electrode second opening 402 of the second insulating layer 4 that is in contact with the liquid sample.
  • the working electrode conductive layers 11a, 11b and the reference electrode conductive layer 21 include a conductive layer and a platinum vapor deposited film laminated thereon, and the working electrode conductive layers 11a, 11b and the reference electrode conductive layer 21 are made of carbon conductive layers that do not contain a catalyst such as platinum.
  • Liquid samples containing glucose and lactic acid as test substances were phosphate buffered saline (PBS) (Takara Bio PBS Tablets T9181), glucose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and sodium lactate (Sigma-Aldrich).
  • PBS containing 30mM glucose and 15.6mM lactic acid and having a pH adjusted to 7.0 was prepared using PBS (manufactured by Nippon Steel & Co., Ltd.).
  • the sensor of Experiment 1-1 or Experiment 1-2 was immersed in the liquid sample, and a voltage of 100 mV was applied to the first working electrode 10a and the second working electrode 10b with respect to the reference electrode 20 (Ag/AgCl).
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample was prepared using the liquid sample after 7 days of measurement according to the formulation shown in the table below.
  • the absorbance at 666 nm of the hydrogen peroxide concentration measurement sample was measured for 5 minutes using a plate reader (at 37° C.).
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample was prepared by mixing a solution containing hydrogen peroxide (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a known concentration instead of the liquid sample in the above table, and the absorbance at 666 nm was similarly measured. By doing so, a calibration curve showing the relationship between hydrogen peroxide concentration and absorbance was created.
  • the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample was determined from the calibration curve.
  • the determined hydrogen peroxide concentration is a value corrected for the amount of water evaporated from the liquid sample during continuous measurement for 7 days. The results are shown in the table below.
  • the sensor of Experiment 1-2 which has a counter electrode made of a carbon conductive layer with a platinum vapor-deposited film laminated on the part that contacts the liquid sample, is different from the sensor of Experiment 1-1, which has a counter electrode made of only a carbon conductive layer. It was confirmed that the generation of hydrogen peroxide in the liquid sample could be suppressed or reduced during the measurement of the test substance in the liquid sample.
  • Experiment 2-1 A sensor 300 in which all conductive layers including the counter electrode 60 were made of carbon conductive layers, which was the same as the sensor in Experiment 1-1, was used as the sensor in Experiment 2-1.
  • Experiment 2-2 In the sensor of Experiment 2-1, a platinum nanoparticle dispersion liquid (manufactured by Sigma-Aldrich, platinum particle diameter: 70 ⁇ 6 nm) was dropped and dried, and then a 21.5 wt % Nafion (registered trademark) dispersion (manufactured by Sigma-Aldrich) was dropped and dried to form a protective film (not shown).
  • a sensor 300 for Experiment 2-2 was manufactured.
  • the portion 60a of the counter electrode 60 that comes into contact with the liquid sample is a carbon conductive layer whose surface is modified with platinum nanoparticles, and the surface of the portion 60a is coated with cations. It is coated with a protective film (not shown) containing Nafion®, a polymeric compound with exchangeable functional groups.
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample was prepared using the liquid sample after 7 days of measurement according to the formulation shown in the table below.
  • the absorbance at 666 nm of the hydrogen peroxide concentration measurement sample was measured for 5 minutes using a plate reader (at 37° C.).
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample is prepared by mixing a solution containing hydrogen peroxide (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a known concentration, and the absorbance at 666 nm is similarly measured. By this, a calibration curve between hydrogen peroxide concentration and absorbance was prepared.
  • the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample was determined from the calibration curve.
  • the determined hydrogen peroxide concentration is a value corrected for the amount of water evaporated from the liquid sample during continuous measurement for 7 days. The results are shown in the table below.
  • the sensor 300 of Experiment 2-2 which has the counter electrode 60 made of a carbon conductive layer modified with platinum nanoparticles in the portion 60a that contacts the liquid sample, is different from the sensor 300 of Experiment 2-2, which has the counter electrode 60 made of only a carbon conductive layer. It was confirmed that the generation of hydrogen peroxide in the liquid sample could be suppressed or reduced during the measurement of the test substance in the liquid sample, compared to the sensor 300 of No.-1.
  • Experiment 2-1 The sensor 300 in which all the conductive layers including the counter electrode 60 were made of carbon conductive layers, which was the same as the sensor in Experiments 1-1 and 2-1, was used as the sensor in Experiment 3-1.
  • Experiment 3-2 Using a carbon paste containing carbon (containing graphite and carbon black) and 1% by weight of platinum particles (average particle size 390 nm) based on the carbon, the working electrode conductive layer 11a was , 11b, the reference electrode conductive layer 21, the counter electrode (counter electrode conductive layer) 30, and the wiring 50 were formed, but the sensor 300 of Experiment 3-2 was manufactured by the above procedure.
  • Experiment 3-3 was carried out using the sensor and procedure of Experiment 3-2, except that a carbon paste containing the carbon and platinum particles of 5% by weight relative to the carbon was used as the carbon paste.
  • a sensor 300 was manufactured.
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample was prepared using the liquid sample after 7 days of measurement according to the formulation shown in the table below.
  • the absorbance at 666 nm of the hydrogen peroxide concentration measurement sample was measured for 5 minutes using a plate reader (at 37° C.).
  • a hydrogen peroxide concentration measurement sample is prepared by mixing a solution containing hydrogen peroxide (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a known concentration, and the absorbance at 666 nm is similarly measured. By this, a calibration curve between hydrogen peroxide concentration and absorbance was prepared.
  • the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample was determined from the calibration curve.
  • the determined hydrogen peroxide concentration is a value corrected for the amount of water evaporated from the liquid sample during continuous measurement for 7 days. The results are shown in the table below.
  • the sensor 300 of Experiment 3-2 and Experiment 3-3 which has the counter electrode 60 made of a carbon conductive layer containing platinum particles, is different from the sensor 300 of Experiment 3-1, which has the counter electrode 60 made of only a carbon conductive layer.
  • the generation of hydrogen peroxide in the liquid sample could be suppressed or reduced during the measurement of the test substance in the liquid sample.
  • a carbon conductive layer containing no platinum (hereinafter referred to as “carbon electrode without platinum particles”) used as the counter electrode 60 in Experiments 3-1, 3-2, and 3-3, a carbon conductive layer containing 1% by weight of platinum particles based on carbon. (hereinafter referred to as “carbon electrode containing 1% platinum particles”) and a carbon conductive layer containing 5% by weight of platinum particles relative to carbon (hereinafter referred to as “carbon electrode containing 5% platinum particles”).
  • carbon electrode containing 1% platinum particles a carbon conductive layer containing 5% by weight of platinum particles relative to carbon
  • a silver chloride (saturated KCl) electrode manufactured by BAS
  • a platinum electrode is used as a counter electrode.
  • a three-electrode electrolytic cell was constructed, and each electrode was connected to a potentiostat.
  • the working electrode, counter electrode, and reference electrode were prepared using phosphate buffered saline (PBS) (Takara Bio PBS Tablets T9181; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO4 3+ ), and cyclic voltammetry was performed by applying a potential in the range of ⁇ 0.5 V to the reference electrode to the working electrode at a sweep rate of 10 mV/s.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the electrode with a higher platinum particle content ratio has a larger absolute value of positive current value on the high potential side and a larger absolute value of negative current value on the lower potential side.
  • the negative current value on the low potential side is considered to be due to reduction of oxygen, etc. in PBS. This means that when an electrode containing platinum particles is used as a working electrode, the background noise increases, the current response value decreases, and the influence of environment-dependent disturbances such as oxygen concentration increases, which may reduce sensitivity. suggested that there is a sex.
  • an electrode containing platinum particles when using an electrode containing platinum particles as a counter electrode, due to the increase in current due to reduction of oxygen, etc., in the negative potential region, a negative current with a large absolute value occurs at a low potential (potential with a small absolute value). can flow. Therefore, an electrode containing platinum particles can function as a counter electrode more efficiently with a smaller area than a carbon electrode that does not contain platinum, and thus can contribute to reducing the sensor size. Furthermore, by driving the sensor of the present disclosure using an electrode containing platinum particles as a counter electrode at a low potential in a negative potential region, it is also possible to reduce the burden on the potentiostat that is the measuring device.
  • the working electrode, counter electrode, and reference electrode were prepared using phosphate buffered saline (PBS) (Takara Bio PBS Tablets T9181; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, Amperometric measurement was performed in which the working electrode was immersed in 0.010 M PO 4 3+ ), a potential of 0.3 V or -0.2 V was applied to the working electrode and the current value was measured over time with respect to the reference electrode. .
  • FIG. 59 shows the measurement results of the current value per area of the working electrode.
  • FIG. 59A shows the measurement results when a carbon electrode without platinum particles was used as a working electrode.
  • FIG. 59B shows measurement results when a carbon electrode containing 1% platinum particles was used as a working electrode.
  • the current value (absolute value) when a carbon electrode without platinum particles is used as a working electrode is significantly smaller than the current value (absolute value) when a carbon electrode containing 1% platinum particles is used as a working electrode. was confirmed (A and B have different vertical axis scales). This result shows that conductive layers that do not contain platinum particles are suitable for the working electrode conductive layers 11a and 11b because of their low background current.
  • the part 60a of the counter electrode 60 in the sensor of Experiment 2-1 that contacts the liquid sample to be measured is a carbon conductive layer whose surface is modified with platinum nanoparticles
  • the working electrode conductive layers 11a and 11b are carbon conductive layers that do not contain platinum particles.
  • the measurement results of the current values of the first working electrode 10a and the second working electrode 10b are shown in FIGS. 60A and 60B, respectively.
  • the current value of the first working electrode 10a shown in FIG. 60A corresponds to the glucose concentration.
  • the current value of the second working electrode 10b shown in FIG. 60B corresponds to the lactic acid concentration.
  • all conductive layers including the working electrode conductive layers 11a and 11b and the counter electrode 60 were carbon conductive layers containing 1% by weight of platinum particles based on carbon.
  • all conductive layers including the working electrode conductive layers 11a and 11b and the counter electrode 60 were carbon conductive layers containing 5% by weight of platinum particles based on carbon.
  • the measurement results of the current values of the first working electrode 10a and the second working electrode 10b are shown in FIGS. 61A and 61B, respectively.
  • the current value of the first working electrode 10a shown in FIG. 61A corresponds to the glucose concentration.
  • the current value of the second working electrode 10b shown in FIG. 61B corresponds to the lactic acid concentration.
  • the sensor of Experiment 3-2 in which the working electrode conductive layers 11a, 11b and the counter electrode 60 contained 1% by weight of platinum particles based on carbon was the sensor of Experiment 3-2 in which the working electrode conductive layers 11a, 11b and the counter electrode 60 contained no platinum particles. No significant decrease in current response value was observed compared to sensor No. 1.
  • the sensor of Experiment 3-3 in which the working electrode conductive layers 11a, 11b and the counter electrode 60 contain platinum particles in an amount of 5% by weight relative to carbon is the sensor in which the working electrode conductive layers 11a, 11b and the counter electrode 60 do not contain platinum particles.
  • the current response value was clearly decreased. This suggests that the presence of platinum in the working electrode conductive layers 11a and 11b reduces the responsiveness of the sensor.
  • Such a sensor is sometimes used for continuous monitoring, in which the test substance is continuously measured over a long period of several days or more while immersed in a liquid sample.
  • the sensor is desired not only to have high detection sensitivity for the test substance but also to have less negative impact (eg, cytotoxicity) on cultured cells contained in the liquid sample.
  • a sensor that includes a working electrode that includes a reagent layer containing a reagent involved in the redox reaction of the test substance, such as an oxidoreductase or a mediator, and a counter electrode is used to electrochemically detect the test substance in a liquid sample. It has been found that when measuring, hydrogen peroxide can be generated during long-term measurements. If the hydrogen peroxide concentration in a liquid sample exceeds a certain level, it may be toxic to cells.
  • the third disclosure provides a sensor including a working electrode and a counter electrode that can suppress the generation of hydrogen peroxide during measurement or reduce the generated hydrogen peroxide without causing a noticeable decrease in sensitivity.
  • the challenge is to provide.
  • the sensor according to the third disclosure suppresses the generation of hydrogen peroxide during measurement without causing a significant decrease in sensitivity when used for measuring a test substance in a liquid sample such as a cell culture solution. Since the generated hydrogen peroxide can be reduced, an increase in the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample can be suppressed. Therefore, the sensor according to the third disclosure has little negative influence on cells in a liquid sample, and can be suitably used for continuous monitoring over a long period of time.
  • a sensor for measuring an analyte in a liquid sample comprising: a working electrode including a working electrode conductive layer; and a reagent layer disposed on the working electrode conductive layer and containing a reagent involved in a redox reaction of the analyte; The opposite and Equipped with When the sensor is immersed in the liquid sample and the analyte in the liquid sample is electrochemically measured, the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample is maintained at less than 15 ⁇ M during the measurement. , sensor. (Appendix 3-2) The sensor according to appendix 3-1, wherein the counter electrode includes a catalyst that decomposes hydrogen peroxide in a portion that contacts the liquid sample.
  • the working electrode conductive layer is a working electrode, a silver silver chloride (saturated KCl) electrode as a reference electrode, and a platinum electrode as a counter electrode
  • the current value measured when a potential in the range of -0.2V to 0.3V (vs. the above-mentioned silver-silver chloride (saturated KCl) electrode) is applied to the working electrode conductive layer is ⁇ 5.5 nA/mm 2 or less.
  • the sensor according to any one of Supplementary Notes 3-1 to 3-9, which satisfies the following conditions.
  • the material of the insulating substrate used in the sensor according to the fourth disclosure of this specification is not particularly limited, but, for example, the same material as the material of the insulating substrate of the sensor according to the first disclosure of this specification can be used.
  • the conductive layer included in the working electrode, reference electrode, and counter electrode of the sensor according to the fourth disclosure of this specification is a layer containing a conductive material such as carbon, gold, platinum, palladium, or the like.
  • the conductive layer can be manufactured by forming a layer of the conductive material as described above on the surface of the substrate using a sputtering method, a vapor deposition method, a screen printing method, or the like.
  • the conductive layer can be processed into a predetermined pattern using a laser trimming method, if necessary.
  • the conductive layer of the working electrode may be referred to as the working electrode conductive layer
  • the conductive layer of the reference electrode may be referred to as the reference electrode conductive layer.
  • the conductive layer of the counter electrode is simply referred to as a counter electrode because the conductive layer itself constitutes the counter electrode.
  • the wiring of the sensor according to the fourth disclosure of this specification can also be made of the same conductive material as the conductive layer.
  • the sensor according to the fourth disclosure of this specification is immersed in a liquid sample and used to detect a predetermined analyte in the liquid sample.
  • the liquid sample contains water as a solvent.
  • the liquid sample include a cell culture solution and a liquid sample prepared using blood obtained from a living body.
  • the test substance are as described with respect to the test substance by the sensor of the first disclosure of this specification, and particularly preferably one or more selected from glucose and lactic acid.
  • the working electrode of the sensor according to the fourth disclosure of this specification includes a reagent layer disposed on the working electrode conductive layer and containing a reagent involved in the redox reaction of the analyte.
  • the reagent can be appropriately selected depending on the test substance.
  • the reagent may include a combination of an oxidoreductase and a mediator (electron carrier), or an oxidoreductase. Oxidoreductases can include coenzymes.
  • oxidoreductases examples include oxidases and dehydrogenases. Specific examples of oxidoreductases are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein, and may particularly preferably be glucose oxidase, lactate oxidase, glucose dehydrogenase or lactate dehydrogenase.
  • the mediator is not particularly limited, and examples thereof are as described with respect to the sensor of the first disclosure of this specification.
  • the reagent layer included in the working electrode of the sensor according to the fourth disclosure of the present specification can further contain components such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • a buffer such as a buffer, a hydrophilic polymer compound, a conductive carbon filler, and a crosslinking agent.
  • hydrophilic polymer compounds and conductive carbon fillers are as described with respect to the sensor of the first disclosure herein.
  • the working electrode of the sensor according to the fourth disclosure of this specification further includes a first protective film disposed on the reagent layer and a second protective film disposed on the first protective film.
  • the first protective film and the second protective film may be collectively referred to as a protective film.
  • the protective film on the reagent layer can be a film that prevents or suppresses leakage of the reagent contained in the reagent layer to the outside of the protective film, and is permeable to the test substance present outside the protective film. Preferred embodiments of the materials constituting the first protective film and the second protective film on the reagent layer having such properties will be described later.
  • the reference electrode of the sensor according to the fourth disclosure of this specification can be provided with a protective film.
  • the protective film of the reference electrode can contain a polymer compound. Examples of such polymer compounds include the polymer compounds described below contained in the first protective film or the second protective film disposed on the reagent layer of the working electrode, and the polymer compounds contained in the second protective film are particularly preferable.
  • a portion of the electrode including a working electrode and a counter electrode disposed on an insulating substrate other than the portion that contacts the liquid sample may be covered with an insulating layer.
  • the insulating layer can contain an insulating resin.
  • the insulating layer can have a multilayer structure of two or more layers.
  • the multilayer insulating layer can include, for example, a first insulating layer disposed on an insulating substrate and a conductive layer, and a second insulating layer disposed on the first insulating layer. Preferred embodiments of the materials constituting the first insulating layer and the second insulating layer are as described with respect to the sensor according to the first disclosure.
  • the sensor 400 of this embodiment includes an insulating substrate 2, a first working electrode 10a, a second working electrode 10b, and a reference electrode arranged on the first surface 2a of the substrate 2. 20 and a counter electrode 30, and a wiring 50 electrically connected to each of the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 30.
  • the sensor 400 of this embodiment includes two working electrodes, in another embodiment not shown, there may be only one working electrode, or three or more working electrodes. In the following description, when the first working electrode 10a and the second working electrode 10b are not distinguished, they may be expressed as working electrodes 10a and 10b.
  • the first working electrode 10a, the second working electrode 10b, the reference electrode 20, and the counter electrode 30 may be collectively referred to as electrodes.
  • the sensor 400 of this embodiment is a three-electrode sensor that includes a working electrode, a reference electrode, and a counter electrode as electrodes, it may be a bipolar sensor that does not include a reference electrode and only includes a working electrode and a counter electrode.
  • the reference electrode and/or the counter electrode may be provided on a substrate different from the substrate on which the working electrode is arranged.
  • the sensor 400 is used to detect a predetermined analyte in the liquid sample X by being immersed in the liquid sample X, in the same way as shown in FIG. 21 regarding the sensor 1 of the first disclosure.
  • Specific examples of the liquid sample and test substance are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the first working electrode 10a of the sensor 400 includes a working electrode conductive layer 11a, a reagent layer 15a containing a reagent involved in the redox reaction of the analyte in the liquid sample, and a layer on the reagent layer 15a.
  • the first protective film 18aa is disposed on the first protective film 18aa
  • the second protective film 18ab is disposed on the first protective film 18aa.
  • Preferred embodiments of the reagent are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the cross-sectional structure of the second working electrode 10b of the sensor 400 is substantially the same as the cross-sectional structure of the first working electrode 10a shown in FIG.
  • the working electrode conductive layer 11a is connected to the working electrode conductive layer 11, the reagent layer 15a is connected to the reagent layer 15b, the first protective film 18aa is connected to the first protective film 18ba, and the second protective film 18ab is connected to the working electrode 10b. 18bb, the protective film 18a is replaced with a protective film 18b.
  • the reagent layers 15a and 15b of the working electrodes 10a and 10b of the sensor 400 contain a reagent that oxidizes the analyte in the liquid sample
  • the analyte is removed from the analyte under the condition that a predetermined voltage is applied to the electrodes of the sensor 400. Electrons move to the working electrode conductive layers 11a and 11b.
  • the reagent layers 15a and 15b contain a reagent that reduces the analyte in the liquid sample, electrons move from the working electrode conductive layers 11a and 11b to the analyte.
  • the concentration or concentration change of the test substance in the liquid sample is measured based on the value of the current flowing through the working electrodes 10a, 10b of the sensor 400, or the change in the current value. can do.
  • the sensor 400 can constitute an analysis device for analyzing a test substance in a liquid sample.
  • the analysis device includes a sensor 400, an analysis unit 102, and a control unit 104 in which the sensor 1 according to the first disclosure is replaced with the sensor 400 according to the fourth disclosure in the analysis device 100 shown in FIG.
  • An example of this is an analyzer equipped with the following. The functions of this analyzer are as described with respect to the analyzer 100 shown in FIG. 24.
  • FIG. 62 and FIGS. 63 and 64 are cross-sectional views thereof.
  • the structure of the reference pole 20 of the sensor 400 according to the fourth disclosure is the same as the structure of the reference pole 20 of the sensor 1 according to the first disclosure. Therefore, the description of the reference pole 20 of the sensor 1 according to the first disclosure with reference to FIG. 22 is cited as the description of the reference pole 20 of the sensor 400 according to the fourth disclosure.
  • the sensor 400 includes an insulating substrate 2, working electrode conductive layers 11a and 11b, a counter electrode 30, a reference electrode conductive layer 21, and a wiring 50, which are arranged on the first surface 2a of the substrate 2.
  • the counter electrode 30 is entirely made of a conductive layer. To specifically refer to the conductive layer portion of the counter electrode, it may also be referred to as a "counter electrode conductive layer” or "counter electrode conductive layer.”
  • a first insulating layer 3 is further arranged on the first surface 2a of the substrate 2, and a second insulating layer 4 is further arranged on the first insulating layer 3.
  • the height of the upper surface of the first insulating layer 3 from the first surface 2a of the substrate 2 is the height of the working electrode conductive layers 11a, 11b, the counter electrode 30, the reference electrode conductive layer 21, and the wiring 50, greater than the height from. Therefore, a part of the first insulating layer 3 is arranged on the working electrode conductive layers 11a, 11b, the counter electrode 30, the reference electrode conductive layer 21, and the wiring 50.
  • the first insulating layer 3 includes a counter electrode first opening 302 that is formed at a position overlapping a part of the counter electrode 30 and penetrates through the substrate 2 in the thickness direction T.
  • the second insulating layer 4 includes a second counter-electrode opening 402 that is formed in a position overlapping the entire counter-electrode first opening 302 of the first insulating layer 3 and that penetrates through the substrate 2 in the thickness direction T.
  • the counter electrode 30 is exposed to the outside through the first counter electrode opening 302 and the second counter electrode opening 402 .
  • the working electrodes 10a and 10b include working electrode conductive layers 11a and 11b, and a reagent layer disposed on the working electrode conductive layers 11a and 11b and containing a reagent involved in the redox reaction of the test substance. 15a and 15b.
  • Preferred embodiments of the reagent in the reagent layers 15a and 15b are as described in the ⁇ Materials> column.
  • the former in order to distinguish between the "reagent layer 15a" of the first working electrode 10a and the “reagent layer 15b" of the second working electrode 10b, the former is The latter may be referred to as the "second reagent layer 15b" of the second working electrode 10b.
  • the reagent included in the reagent layer 15a of the first working electrode 10a may be referred to as a "first reagent”
  • the reagent included in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b may be referred to as a "second reagent”.
  • the sensor 400 includes a plurality of working electrodes 10a, 10b, and a first reagent contained in the first reagent layer 15a of the first working electrode 10a among the plurality of working electrodes 10a, 10b;
  • the second reagents contained in the second reagent layer 15b of the second working electrode 10b, which is different from the working electrode 10a, are different from each other.
  • the first reagent participates in the redox reaction of the first analyte in the liquid sample
  • the second reagent is different from the first analyte in the liquid sample. Since it can participate in the redox reaction of the second analyte, it can be used to detect a plurality of analytes including the first analyte and the second analyte in a liquid sample.
  • the working electrodes 10a, 10b have first protective films 18aa, 18ba placed on the reagent layers 15a, 15b, and second protective films 18aa, 18ba placed on the first protective films 18aa, 18ba.
  • Protective films 18a and 18b are provided, each consisting of films 18ab and 18bb.
  • the first insulating layer 3 has a working electrode first opening penetrating in the thickness direction T of the substrate 2, which is formed at a position overlapping a part of each of the working electrode conductive layers 11a and 11b. 303a and 303b.
  • the second insulating layer 4 has a working electrode hole formed in the first insulating layer 3 at a position that overlaps with a portion that includes the whole of the first working electrode openings 303a and 303b, and which penetrates through the thickness direction T of the substrate 2. Two openings 403a and 403b are provided.
  • the reagent layers 15a, 15b are contained in the working electrode first openings 303a, 303b, and the outer peripheral edges of the reagent layers 15a, 15b are defined by the inner peripheral edges of the working electrode first openings 303a, 303b.
  • the first protective films 18aa, 18ba and the second protective films 18ab, 18bb are included in the working electrode second openings 403a, 403b, and the outer peripheral edges of the first protective films 18aa, 18ba and the second protective films 18ab, 18bb are It is defined by the inner periphery of the working electrode second openings 403a and 403b.
  • the first protective films 18aa and 18ba contain a first polymer compound containing a cation-exchanging functional group
  • the second protective films 18ab and 18bb contain a cationic functional group. It is characterized by containing a second polymer compound containing.
  • a sensor with this feature can be used for continuous monitoring applications where the test substance is continuously measured over a long period of several days while immersed in a liquid sample. Stable measurements are possible without peeling.
  • polymeric compounds containing cation-exchange functional groups e.g., tetrafluoroethylene and perfluoro-2-(2-fluorosulfonyl)
  • cation-exchange functional groups e.g., tetrafluoroethylene and perfluoro-2-(2-fluorosulfonyl)
  • a first protective film containing a polymer compound containing 4-vinylpyridine as a constituent unit for example, P4VP-tBuMA (a copolymer compound of poly-4-vinylpyridine and polyvinyl pyridine) is provided on the reagent layer.
  • P4VP-tBuMA a copolymer compound of poly-4-vinylpyridine and polyvinyl pyridine
  • a sensor that includes a two-layered protective film in which a second protective film containing a block copolymer compound of -tert-butyl methacrylate) is further provided on the first protective film.
  • the present inventors found that when performing continuous electrochemical measurements of test substances by immersing this sensor in a liquid sample, the detected current value changes significantly after a long period of time exceeding 3 days. It has been found that an event may occur in which an accurate measurement cannot be made due to the detection of In the sensor that showed an abnormal value, it was confirmed that peeling had occurred between the first protective film and the second protective film.
  • the present inventors have found that the above problem can be solved by the sensor according to the fourth disclosure, which includes a first protective film and a second protective film having the above characteristics.
  • the first polymer compound of the first overcoat includes a cation exchange functional group (i.e., an anionic functional group), while the second polymer compound of the second overcoat includes a cationic functional group. It is considered that the first protective film and the second protective film are in close contact with each other at the interface due to electrostatic bonding, and peeling is suppressed.
  • the first polymer compound contained in the first protective film may have a cation-exchangeable functional group, and preferably has a cation-exchangeable functional group in its side chain.
  • a sulfonic acid group is preferable.
  • the first polymer compound having a sulfonic acid group in the side chain is preferably a polymer compound containing a perfluoro compound having a sulfonic acid group in the side chain as a constitutional unit, and more preferably has a sulfonic acid group in the side chain.
  • a copolymer compound containing a perfluoro compound and a perfluoro compound that does not have an ionic functional group in its side chain as a constituent unit is particularly preferably a copolymer compound containing tetrafluoroethylene and perfluoro-2-(2-fluorosulfonyl). ethoxy)propyl vinyl ether, most preferably Nafion(R).
  • the second polymer compound contained in the second protective film may contain a cationic functional group, and preferably has a cationic functional group in its side chain. Since the pH of the liquid sample to be analyzed may vary during long-term measurements, the cationic functional group in the second polymer compound is preferably a pH-independent cationic functional group. In particular, a functional group containing a quaternary ammonium cation is preferred. The quaternary ammonium cation preferably originates from the reaction of a tertiary amine with an epoxy group. Tertiary amines include pyridyl groups, particularly 4-pyridyl groups.
  • the second polymer compound includes a first unit containing a cationic functional group and a second unit containing a hydrophobic functional group, and the ratio of the second unit to the total amount of constitutional units of the second polymer compound is 50. It is preferable that it is mol% or more. Since such a second polymer compound has high hydrophobicity, even when the sensor according to the fourth disclosure is immersed in an aqueous liquid sample such as a cell culture medium and measured for a long time, the second protective film is not exposed to water. Because of this, it does not swell, and peeling at the interface with the first protective film is easily suppressed.
  • the upper limit of the content of the second unit containing a hydrophobic functional group in the second polymer compound is not particularly limited, but for example, if the ratio of the second unit to the total amount of constituent units of the second polymer compound is 70 mol% or less, Something can happen.
  • the hydrophobic functional group include saturated hydrocarbon groups having 1 to 10 carbon atoms.
  • the second polymer compound that includes a first unit that includes a cationic functional group and a second unit that includes a hydrophobic functional group is, for example, a third unit that includes a tertiary amine and a second unit that includes a hydrophobic functional group.
  • the epoxy group of the crosslinking agent compound is preferably 6.8 mol% or more, more preferably 23 mol% or less (the tertiary amine in the third unit), based on the tertiary amine in the third unit.
  • the resulting second polymer compound is a high-density quaternary polymer compound. This is preferable because the electrostatic bond between the first protective film and the second protective film becomes strong.
  • the number of moles of the tertiary amine is It can be calculated based on the molecular weight of the monomer of the third unit, and the number of moles of epoxy groups is the molecular weight of the crosslinking agent compound (if the crosslinking agent compound is a polymer compound, its number average molecular weight is taken as the uniform molecular weight). It can be calculated based on
  • the third unit containing a tertiary amine in the uncrosslinked polymer compound is preferably a structural unit derived from 4-vinylpyridine.
  • a preferred example of the uncrosslinked polymer compound is a copolymer compound of 4-vinylpyridine and tert-butyl methacrylate.
  • the copolymer compound more preferably has a second unit derived from tert-butyl methacrylate relative to the total amount of the third unit derived from 4-vinylpyridine and the second unit derived from tert-butyl methacrylate. contains 50 mol% or more, more preferably 70 mol% or less (the ratio of the second unit to the total amount of the third unit and the second unit is, for example, 50 mol% or more and 70 mol% or less).
  • the copolymer compound of 4-vinylpyridine and tert-butyl methacrylate is particularly preferably a block copolymer compound.
  • the molecular weight of the uncrosslinked polymer compound is not particularly limited, but may have a number average molecular weight (Mn) of 150,000 to 500,000, for example.
  • the crosslinking agent compound containing two or more epoxy groups is, for example, a linear compound having epoxy groups at both ends, preferably a polyalkylene glycol compound whose both ends are each modified with a glycidyl group.
  • the molecular weight of poly(ethylene glycol) diglycidyl ether is not particularly limited, but may have a number average molecular weight (Mn) of 200 to 2,000, for example.
  • the second protective films 18ab and 18bb have a second protective film including a first unit containing a quaternary ammonium cation derived from a reaction between a tertiary amine and an epoxy group, and a second unit containing a hydrophobic functional group.
  • a preferred method of manufacturing the sensor 400 according to the third disclosure includes: A mixture containing an uncrosslinked polymer compound containing a third unit containing a tertiary amine and a second unit containing a hydrophobic functional group, and a crosslinking agent compound containing two or more epoxy groups in an alcohol, By maintaining the temperature at a temperature of °C or higher for 6 hours or more, the tertiary amine of the third unit and the epoxy group of the crosslinking agent compound are reacted, and the third unit is A first step of obtaining a second protective film-forming composition containing the second polymer compound containing the first unit and the second unit in alcohol by converting it into the first unit containing an ammonium cation.
  • the second protective film forming composition substrate 2; Working electrode conductive layers 11a and 11b arranged on the substrate 2; reagent layers 15a, 15b disposed on the working electrode conductive layers 11a, 11b; first protective films 18aa, 18ba disposed on reagent layers 15a, 15b;
  • a sensor component comprising: a second step of coating and drying the first protective films 18aa, 18ba to form second protective films 18ab, 18bb containing the second polymer compound; including.
  • the crosslinking reaction between the tertiary amine of the third unit in the uncrosslinked polymer compound and the epoxy group of the crosslinker compound sufficiently progresses, and the density of the quaternary ammonium cation increases.
  • a second protective film-forming composition containing a high second polymer compound can be obtained.
  • the temperature conditions in the first step are more preferably 30°C or higher, more preferably 40°C or higher, and the upper limit is preferably lower than the boiling point of alcohol, for example, when using ethanol as the alcohol, it is preferably lower than 78°C. preferable.
  • the reaction time in the first step is preferably 12 hours or more, and the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 48 hours or less (the reaction time in the first step is, for example, 12 hours or more and 48 hours or less).
  • the alcohol ethanol, methanol, and propanol are preferred, and ethanol is particularly preferred.
  • Preferred embodiments of the beautiful fragrance copolymer compound and the crosslinking agent compound are as described above.
  • the composition for forming the second protective film is applied or dropped on the first protective films 18aa and 18ba to coat them, and then dried by volatilizing the alcohol as a solvent, and then Protective films 18ab and 18bb are formed.
  • substrate As in the first disclosed embodiment, a 188 ⁇ m thick substrate made of polyethylene terephthalate and having the shape shown in FIG. 62 was used as the insulating substrate 2.
  • conductive layer By applying carbon paste on the first surface 2a of the insulating substrate 2 and heating it at 140° C. for 1 hour, a working electrode conductive layer 11a and a reference electrode conductive layer having the same shape as in FIG. 1 related to the first disclosure are formed. 21 and the counter electrode (counter electrode conductive layer) 30, and the wiring 50 electrically connected to each of them were formed of a carbon conductive layer with a thickness of 5 ⁇ m.
  • first insulating layer (first insulating layer) Subsequently, the first surface 2a of the substrate 2 and the carbon conductive layer made of a fluororesin containing a copolymer containing vinylidene fluoride and hexafluoropropylene are placed on the first surface 2a of the substrate 2 on which the carbon conductive layer is disposed. A covering first insulating layer 3 having a thickness of 5 ⁇ m on the carbon conductive layer was laminated. The method for manufacturing the first insulating layer 3 is as described in the first disclosed embodiment.
  • the working electrode first opening 303a on the working electrode conductive layer 11a of the first insulating layer 3 was circular with a diameter of 1.2 mm.
  • the reference electrode first opening 301 was a circle with a diameter of 1.1 mm, and the counter electrode first opening 302 was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • the working electrode second opening 403a of the second insulating layer 4 on the working electrode conductive layer 11a was circular with a diameter of 2 mm.
  • the second opening 401 of the reference electrode was a circle with a diameter of 2 mm, and the second opening 402 of the counter electrode was a rectangle with a size of 1.8 mm x 2.1 mm.
  • a sodium phosphate buffer solution (pH 7.4) with a final concentration of 3 mM and a final concentration of 14 mg/mL (carbon black concentration) are applied on the working electrode conductive layer 11a.
  • a reagent layer 15a containing glucose dehydrogenase and a mediator was formed.
  • a first protective film 18aa is formed on the reagent layer 15a
  • a second protective film 18ab is formed on the first protective film 18aa
  • a first protective film 18ab is formed on the first protective film 18aa.
  • a protective film 18a having a two-layer structure consisting of a protective film 18aa and a second protective film 18ab was formed. A specific method for manufacturing the first protective film 18aa and the second protective film 18ab will be explained in Experiments 8 to 10.
  • Reference pole Since the cross-sectional structure of the reference electrode 20 is the same as that shown in FIG. 22 regarding the sensor of the first disclosure, a method for manufacturing the reference electrode 20 will be outlined below with reference to FIG. 22.
  • a silver-silver chloride paste was applied on the reference electrode conductive layer 21 in the reference electrode first opening 301 of the first insulating layer 3 and heated at 140° C. for 1 hour to form a silver-silver chloride layer 22 .
  • the reference electrode protective film 23 was placed on the silver-silver chloride layer 22 in the reference electrode second opening 401 of the second insulating layer 4, thereby forming the reference electrode 20.
  • Nafion® dispersion 30,792.92 mg of Nafion® dispersion was prepared.
  • 0.6 mg of the obtained Nafion (registered trademark) dispersion having a concentration of 16.12 wt% is applied onto the reagent layer 15a in the second opening 403a of the working electrode of the second insulating layer 4 and dried to form cations.
  • a first protective film 18aa containing Nafion (registered trademark) as a polymer compound containing an exchangeable functional group was formed.
  • P4VP-tBuMA is a block copolymer of poly-4-vinylpyridine (P4VP) with a predetermined molecular weight and poly-tert-butyl methacrylate (tBuMA) with a predetermined molecular weight.
  • Second protective film forming composition of Experiment 8-1 ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 74,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 87,000, Mw/Mn: 1.16, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.91 wt%
  • Second protective film forming composition of Experiment 8-2 ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 2.0 wt%
  • the sensor 400 provided with the second protective film 18ab of Experiment 8-1 was used as the sensor of Experiment 8-1.
  • the sensor 400 provided with the second protective film 18ab of Experiment 8-2 was used as the sensor of Experiment 8-2.
  • RPMI-1640 Medium manufactured by Sigma-Aldrich Co., Ltd. R1383
  • glucose manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • sodium lactate manufactured by Sigma-Aldrich Co., Ltd.
  • FIG. 65A shows the measurement results using the sensor of Experiment 8-1
  • FIG. 65B shows the measurement results using the sensor of Experiment 8-2.
  • P4VP-tBuMA containing P4VP of Mn: 74,000 and tBuMA of Mn: 87,000, and containing PEGDGE at a final concentration of 0.91 wt%.
  • the sensor of Experiment 8-2 provided with the protective film 18ab no abnormally high current value was detected even after 4 days or more had elapsed from the start of measurement.
  • compositions were designed for the composition for forming the second protective film, each containing P4VP-tBuMA and PEGDGE at the following final concentrations in ethanol.
  • the ratio (mol%) of epoxy groups derived from PEGDGE to pyridine derived from P4VP the number of moles of pyridine derived from P4VP calculated based on the molecular weight of the monomer of P4VP and , and the number of moles of epoxy groups derived from PEGDGE calculated based on the number average molecular weight of PEGDGE (considered as a uniform molecular weight of PEGDGE).
  • Composition A (10.17 mol% of epoxy group derived from PEGDGE with respect to pyridine derived from 4-vinylpyridine): ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.9 wt%
  • Composition B (6.77 mol% of epoxy groups derived from PEGDGE with respect to pyridine derived from 4-vinylpyridine): ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.6 wt%
  • a mixture containing the components of Composition A in ethanol was pre-crosslinked by holding it at 40°C for 16 hours to prepare a composition for forming a second protective film in Experiment 9-1.
  • a mixture containing the components of Composition B in ethanol was pre-crosslinked by holding it at 40°C for 16 hours to prepare a composition for forming a second protective film in Experiment 9-2.
  • a mixture containing the components of Composition B in ethanol was pre-crosslinked by holding it at 53° C. for 16 hours to prepare a composition for forming a second protective film in Experiment 9-3.
  • the sensor from Experiment 9-1, Experiment 9-2, or Experiment 9-3 was immersed in the same liquid sample used in Experiment 8, and a voltage of 100 mV was applied to the working electrode 10a with respect to the reference electrode 20 (Ag/AgCl). A voltage was applied, and the current value between the working electrode 10a and the counter electrode 30 was measured continuously for about 14 days.
  • FIG. 66A shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-1
  • FIG. 66B shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-2
  • FIG. 66C shows the measurement results using the sensor of Experiment 9-3. .
  • the second protective film 18ab is formed using a second protective film forming composition that has been pre-crosslinked by mixing P4VP-tBuMA and PEGDGE and then reacting them for a certain period of time. ) It was suggested that the sensor provided on the first protective film 18aa can suppress the occurrence of an abnormally high current value during long-term measurement. It was also suggested that by increasing the temperature during pre-crosslinking, it is possible to further suppress the occurrence of abnormally high current values during long-term measurements.
  • compositions for forming the second protective film were designed for the composition for forming the second protective film, each containing P4VP-tBuMA and PEGDGE in ethanol at the following final concentrations.
  • Composition C (22.67 mol% of epoxy groups derived from PEGDGE with respect to pyridine derived from 4-vinylpyridine): ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 2.0 wt%
  • Composition D (10.17 mol% of epoxy group derived from PEGDGE with respect to pyridine derived from 4-vinylpyridine): ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.9 wt%
  • Composition E (6.77 mol% of epoxy groups derived from PEGDGE with respect to pyridine derived from 4-vinylpyridine): ⁇ P4VP-tBuMA (Mn of poly-4-vinylpyridine: 120,000, Mn of poly-tert-butyl methacrylate: 270,000, Mw/Mn: 1.15, manufactured by Polymer Source), final concentration 5.72wt % ⁇ PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, Mn: ⁇ 1,000, manufactured by Sigma-Aldrich), final concentration 0.6 wt%
  • a mixture containing the components of Composition C in ethanol was pre-crosslinked by holding it at room temperature (25°C ⁇ 3°C) for about 1 hour to prepare the second protective film forming composition of Experiment 10-1.
  • a mixture containing the components of Composition D in ethanol was pre-crosslinked by holding it at 40° C. for 16 hours to prepare a composition for forming a second protective film in Experiment 10-2.
  • a mixture containing the components of Composition E in ethanol was pre-crosslinked by holding it at 53° C. for 16 hours to prepare a composition for forming a second protective film in Experiment 10-3.
  • Each sensor after being stored at 60°C for 14 days was immersed in the same liquid sample used in Experiment 8, and a voltage of 100 mV was applied to the working electrode 10a with respect to the reference electrode 20 (Ag/AgCl).
  • the current value between the electrode 10a and the counter electrode 30 was measured continuously for 10 days.
  • the second protective film 18ab is formed using a second protective film forming composition that has been pre-crosslinked by reacting P4VP-tBuMA and PEGDGE for 6 hours or more after mixing, with Nafion containing a cation exchange functional group.
  • the sensors of Experiments 10-2 and 10-3 provided on the first protective film 18aa containing (registered trademark) had smaller fluctuations in current value after the temperature accelerated test compared to the sensor of Experiment 10-1. confirmed. Furthermore, it was confirmed that by increasing the temperature during pre-crosslinking, it was possible to further reduce the fluctuation in current value after the temperature accelerated test.
  • Such a sensor is sometimes used for continuous monitoring, in which a test substance is continuously measured over a long period of several days or more while immersed in a liquid sample.
  • the sensor is required to have small changes in responsiveness in order to enable stable measurements during the measurement period.
  • the fourth disclosure of the present specification to provide a sensor that can perform stable measurements with little change in response even when measurements are performed for a long period of time while immersed in a liquid sample, and a method for manufacturing the same. shall be.
  • the sensor according to the fourth disclosure can be suitably used for continuous monitoring over a long period of time.
  • a sensor comprising an insulating substrate and a working electrode disposed on the substrate,
  • the working electrode is a working electrode conductive layer disposed on the substrate;
  • a reagent layer containing a reagent involved in a redox reaction, disposed on the working electrode conductive layer;
  • a first protective film containing a first polymer compound containing a cation exchange functional group, disposed on the reagent layer;
  • a sensor comprising: a second protective film that is disposed on the first protective film and includes a second polymer compound that includes a cationic functional group.
  • the second polymer compound includes the first unit containing the cationic functional group and the second unit containing the hydrophobic functional group, and the second unit is based on the total amount of the constituent units of the second polymer compound.
  • the sensor according to appendix 4-1 wherein the ratio of is 50 mol% or more.
  • the sensor according to appendix 4-1 or 4-2, wherein the cationic functional group is pH independent.
  • the sensor according to appendix 4-3, wherein the cationic functional group includes a quaternary ammonium cation derived from a reaction between a tertiary amine and an epoxy group.
  • the working electrode is a working electrode conductive layer disposed on the substrate; a reagent layer containing a reagent involved in a redox reaction, disposed on the working electrode conductive layer; a first protective film containing a first polymer compound containing a cation exchange functional group, disposed on the reagent layer; A first unit disposed on the first protective film that includes a quaternary ammonium cation derived from a reaction between a tertiary amine and an epoxy group, and a second unit that includes a hydrophobic functional group.
  • a method for manufacturing a sensor comprising: a second protective film containing a dipolymer compound; A mixture comprising an uncrosslinked polymer compound containing a third unit containing a tertiary amine and the second unit containing the hydrophobic functional group, and a crosslinking agent compound containing two or more epoxy groups in alcohol. , by holding the tertiary amine of the third unit and the epoxy group of the crosslinking agent compound at a temperature of 20° C. or higher for 6 hours or more, thereby converting the third unit into the third unit.
  • the uncrosslinked polymer compound includes the third unit and the second unit in a ratio of 50 mol% or more to the total amount of the third unit and the second unit.
  • Appendix 4-7 The method described in Appendix 4-7, including as follows.
  • Appendix 4-9) The uncrosslinked polymer compound and the crosslinking agent compound are contained in the mixture such that the epoxy group of the crosslinking agent compound is 6.8 mol% or more with respect to the tertiary amine of the third unit.
  • the method described in Appendix 4-7 or 4-8. (Appendix 4-10) The method according to any one of Supplementary Notes 4-7 to 4-9, wherein the uncrosslinked polymer compound is a copolymer compound of 4-vinylpyridine and tert-butyl methacrylate.

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Abstract

特性を所望の範囲に制御することが容易な試薬層及び保護膜を含む作用極を備えるセンサ及びその製造方法を提供する。センサ（１）は、絶縁性の基板（２）と作用極（１０ａ）とを備える。作用極（１０ａ）は、基板（２）上に導電層（１１ａ）と、導電層（１１ａ）上に配置された、第１開口部（３ａ１）と撥水性の表面（３ａ２）とを有する第１絶縁層（３ａ）と、第１絶縁層（３ａ）上に配置された第２開口部（４ａ１）とアルコールに対して撥液性の表面（４ａ２）とを有する第２絶縁層（４ａ）と、第１絶縁層（３ａ）の第１開口部（３ａ１）内に配置された試薬層（１５ａ）と、第２絶縁層（４ａ）の第２開口部（４ａ１）内に配置された保護膜（１６ａ）とを備える。

Description

センサ及びその製造方法
　第１の開示は、例えばセンサ及びその製造方法に関する。
　細胞培養液、血液試料等の被検試料中の目的物質を測定するために、電気化学式のセンサが従来から用いられている。このようなセンサは、例えば、絶縁性基材、及び、前記基材表面上に配置された作用極を備え、更に、対極及び／又は参照極を備える。前記作用極は、典型的には、導電層と、前記導電層上に配置され、酸化還元反応に関与する試薬（例えば酸化還元酵素及び電子伝達体）を含む試薬層とを備える。前記センサは、更に、前記試薬層からの試薬の流出を防ぐために、前記作用極のみを被覆する、或いは、前記作用極を前記対極及び／又は前記参照極とともに被覆する保護膜を備えることができる。
　例えば、特許文献１に記載の電気化学センサは、基材と、前記基材上に配置された感知層（試薬層）を含む第１電極（作用極）及び第２電極（参照極）と、それらの全体を被覆する、所定のポリマー化合物を含む流動制限膜（保護膜）とを備える。特許文献１では、前記流動制限膜（保護膜）を、浸漬コーティング又はキャスティングにより形成することが記載されている。
米国特許第９０１４７７４号明細書
　しかしながら、上記の導電層上に試薬層及び保護膜を含む作用極を備える従来のセンサは、以下に示すような問題点を有している。
　特許文献１では、ポリマー化合物を含む溶液に、導電層及び試薬層を含む作用極を備える絶縁性基材を浸漬し、乾燥して、絶縁性基材の全体を被覆する保護膜を形成する。
　しかし、この方法では、作用極の試薬層上の保護膜の特性（保護膜の厚さ、保護膜を構成するポリマー化合物の量等）を、設計した範囲に制御することが困難な場合がある。作用極の保護膜の特性のばらつきは、センサの測定精度の低下の原因となり得る。
　特許文献１ではまた、平坦な電極の表面に、酵素等の試薬を含む試薬層を配置している。
　しかし、平坦な電極の表面に試薬層を形成する方法では、試薬層の特性（試薬層の厚さ、試薬層を構成する試薬の量等）を、設計した範囲に制御することが困難な場合がある。作用極における試薬層の特性のばらつきもまた、センサの測定精度の低下の原因となり得る。
　第１の開示の課題は、特性を所望の範囲に制御することが容易な試薬層及び保護膜を含む作用極を備えるセンサ及びその製造方法を提供することにある。
　第１の開示に係るセンサは、絶縁性の基板と、前記基板上に配置された作用極とを備える。
　前記作用極は、
　前記基板上に配置された導電層と、
　少なくとも一部が前記導電層上に配置され、前記基板の厚さ方向からの平面視において前記導電層の一部と重なる位置に形成された前記厚さ方向に貫通した第１開口部と、撥水性の表面とを有する第１絶縁層と、
　前記第１絶縁層上に配置され、前記厚さ方向からの平面視において前記第１絶縁層のうち前記第１開口部の全体を内包する部分と重なる位置に形成された前記厚さ方向に貫通した第２開口部と、アルコールに対して撥液性の表面とを有する第２絶縁層と、
　前記第１絶縁層の前記第１開口部内に配置され、前記第１絶縁層の前記第１開口部の内周縁により規定される外周縁と、酸化還元反応に関与する試薬とを含む試薬層と、
　前記第２絶縁層の前記第２開口部内に配置され、前記第２絶縁層の前記第２開口部の内周縁により規定される外周縁を含む保護膜と
を備える。
　第１の開示に係る、前記センサの製造方法は、
　前記導電層、前記第１絶縁層及び前記第２絶縁層が配置された前記基板の、前記第１絶縁層の前記第１開口部内に、水中に前記試薬を含む液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して、前記試薬層を形成すること、及び、
　前記試薬層の形成後に、前記第２絶縁層の前記第２開口部内に、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、前記保護膜を形成すること
を含む。
（発明の効果）
　第１の開示に係るセンサ及び製造方法によれば、センサの作用極の試薬層及び保護膜の特性を所望の範囲に制御することが容易である。
第１作用極、第２作用極、参照極及び対極の導電層並びに配線が配置された基板を示す平面図。 第１作用極、第２作用極、参照極及び対極の導電層並びに配線が配置され、更にそれらの上に第１絶縁層が配置された基板を示す平面図。 第１作用極、第２作用極、参照極及び対極の導電層並びに配線が配置され、更にそれらの上に第１絶縁層及び第２絶縁層が配置された基板を示す平面図。 図３の基板に、作用極の試薬層及び参照極の銀／塩化銀層が更に配置された基板を示す平面図。 第１の開示の一実施形態に係るセンサの平面図。 図３の基板の、第１作用極に対応する部分の、Ａ－Ａ’線に沿った断面図。 図３の基板の、第１作用極の第１絶縁層の第１開口部内に形成した、水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａの液滴の断面図。 図３の液体組成物Ａの液滴を乾燥して得られる、図４の基板の、第１作用極に対応する部分の、Ｂ－Ｂ’線に沿った断面図。 図４の基板の、第１作用極の第２絶縁層の第２開口部内に形成した、アルコール中に保護膜成分を含む第１液体組成物Ｂの液滴の断面図。 図９に示す第１液体組成物Ｂの液滴を乾燥して得られる、図４の基板の、第１作用極の第２絶縁層の第２開口部内の保護膜の一部の断面図。 図１０の保護膜の一部を含む、第１作用極の第２絶縁層の第２開口部内に更に形成した、第１液体組成物Ｂの液滴の断面図。 図１１の第１液体組成物Ｂの液滴を乾燥して得られる第１保護膜を含む、図５のセンサの、第１作用極を含む部分の、Ｃ－Ｃ’線に沿った断面図。 図４の基板の、第２作用極の第２絶縁層の第２開口部内に形成した、アルコール中に保護膜成分を含む第２液体組成物Ｂの液滴の断面図。 図９の第２液体組成物Ｂの液滴を乾燥して得られる、図４の基板の、第２作用極の第２絶縁層の第２開口部内の第２保護膜の断面図。 図１４の第２保護膜を含む、第２作用極の第２絶縁層の第２開口部内に形成した、アルコール中に別の保護膜成分を含む第３液体組成物Ｂの液滴の断面図。 図１５の第３液体組成物Ｂの液滴を乾燥して得られる第３保護膜を含む、図５のセンサの、第２作用極を含む部分の、Ｄ－Ｄ’線に沿った断面図。 比較例のセンサの、第１作用極の第２絶縁層の第２開口部内に形成した、アルコール中に保護膜成分を含む第１液体組成物Ｂの液滴が濡れ拡がった状態の断面図。 図１７の濡れ拡がった第１液体組成物Ｂを乾燥して得られる、第１作用極の第２絶縁層の上面及び第２開口部内に形成された第１保護膜の一部の断面図。 図１８の第１保護膜の一部を含む、比較例のセンサの第１作用極の第２絶縁層の第２開口部内に更に形成した、第１液体組成物Ｂの液滴が濡れ拡がった状態の断面図。 図１９の濡れ拡がった第１液体組成物Ｂを乾燥して得られる、第１作用極の第２絶縁層の上面及び第２開口部内に形成された第１保護膜の断面図。 図５のセンサを液体試料中に浸漬して被検物質を測定する方法を説明する模式図。 図５のセンサの、参照極を含む部分の、Ｅ－Ｅ’線に沿った断面図。 図５のセンサの、対極を含む部分の、Ｆ－Ｆ’線に沿った断面図。 第１の開示の一実施形態のセンサを含む分析装置の制御ブロック図。 図２５Ａは、実施例のセンサの第１作用極（グルコース測定用）の電流値の測定結果を示す。図２５Ｂは、比較例のセンサの第１作用極（グルコース測定用）の電流値の測定結果を示す。 図２６Ａは、実施例のセンサの第２作用極（乳酸測定用）の電流値の測定結果を示す。図２６Ｂは、比較例のセンサの第２作用極（乳酸測定用）の電流値の測定結果を示す。 作用極導電層、参照極導電層、対極及び配線が配置された基板を示す平面図。 作用極導電層、参照極導電層、対極及び配線が配置され、更にそれらの上に第１絶縁層が配置された基板を示す平面図。 作用極導電層、参照極導電層、対極及び配線が配置され、更にそれらの上に第１絶縁層及び第２絶縁層が配置された基板を示す平面図。 図２９の基板に、作用極の試薬層及び参照極の銀／塩化銀層が更に配置された基板を示す平面図。 第２絶縁層に先端開口部及び流路が形成された第２の開示の一実施形態に係るセンサの平面図。 第１絶縁層及び第２絶縁層に先端側開口部及び流路が形成された第２の開示の別の一実施形態に係るセンサの平面図。 図３１のセンサの、作用極を含む部分のＪ－Ｊ’線に沿った断面図。 図３１のセンサの、参照極を含む部分のＫ－Ｋ’線に沿った断面図。 図３１のセンサの、対極を含む部分のＬ－Ｌ’線に沿った断面図。 図３１のセンサの、対極並びに第２絶縁層に形成された先端開口部及び流路を含む部分のＭ－Ｍ’線に沿った断面図。 絶縁層の上面を含まない厚さ方向の一部に形成され、周囲が囲われた構造の先端開口部及び流路を備える更に別の一実施形態に係るセンサの、対極並びに先端開口部及び流路を含む部分の断面図。 図３２のセンサの、対極並びに第１絶縁層と第２絶縁層に形成された先端開口部及び流路を含む部分のＮ－Ｎ’線に沿った断面図。 基板の先端部が下端となるように液体試料に浸漬した、図３１及び図３６に示すセンサの、対極、先端開口部及び流路を含む部分の断面の模式図。 基板の先端部が下端となるように液体試料に浸漬した、先端開口部及び流路を備えていない比較例のセンサの、対極を含む部分の断面の模式図。 本体部、接続部及び基端部を含む基板、並びに、基板の第１面上の全体に配置された第１絶縁層及び基板の第１面のうち折り曲げ部よりも先端部側に配置された絶縁シートを含む第２絶縁層を備える、第２の開示の一実施形態に係るセンサの平面図。 複数の図４１のセンサが基板の基端部において連結された、多連式のセンサの平面図。図４２では絶縁層は省略した。 基板の接続部の折り曲げ部において折り曲げられた、検出電極が配置された基板の本体部を液体試料に浸した図４１のセンサの模式図。図４３では絶縁層は省略した。 基板の接続部の折り曲げ部において折り曲げられた、検出電極が配置された基板の本体部を液体試料に浸した図４１のセンサの、側方からの模式図。 図４１のセンサにおいて基板の第１面上の全体に絶縁シートを含む第２絶縁層を配置し、基板の接続部の折り曲げ部において折り曲げられた、検出電極が配置された基板の本体部を液体試料に浸した比較例のセンサの、側方からの模式図。 本体部、接続部及び基端部を含む基板、並びに、基板の第１面上の全体に配置された第１絶縁層、基板の第１面のうち折り曲げ部よりも先端部側に配置された第１絶縁シートを含む第２絶縁層、及び、基板の基端部の第１面上に配置された第２絶縁シートを含む第２絶縁層を備え、基板の折り曲げ部上に絶縁シートを含まない、第２の開示の別の一実施形態に係るセンサの平面図。 図４６に示すセンサにおいて、更に、基板の第１面うち折り曲げ部上の領域に、切り込み部を介して第１絶縁シート及び第２絶縁シートと分離された、複数の、第３絶縁シートを含む第２絶縁層が更に配置された、第２の開示の更に別の一実施形態に係るセンサの平面図。 第２の開示の一実施形態のセンサを含む分析装置の制御ブロック図。 比較例のセンサＳ１の平面図。 比較例のセンサＳ２の平面図。 実施例のセンサＳ３の平面図。 実施例のセンサＳ４の平面図。 実施例のセンサＳ５の平面図。 図５０ＡはセンサＳ１の作用極の電流値の測定結果を示す。 図５０ＢはセンサＳ２の作用極の電流値の測定結果を示す。 図５０ＣはセンサＳ３の作用極の電流値の測定結果を示す。 図５０ＤはセンサＳ４の作用極の電流値の測定結果を示す。 図５０ＥはセンサＳ５の作用極の電流値の測定結果を示す。 第２の開示の一実施形態のセンサユニットの分解斜視図。 上方支持プレートと下方支持プレートとの間に保持されるセンサを示す断面図。 センサユニットを含むアダプタユニットの分解斜視図。 第３の開示の一実施形態に係るセンサの平面図。 図５４に示すセンサの、対極を含む部分の、Ｐ－Ｐ’線に沿った断面図。 図５４に示すセンサの、第１作用極を含む部分の、Ｑ－Ｑ’線に沿った断面図。 図５４に示すセンサの、第２作用極を含む部分の、Ｒ－Ｒ’線に沿った断面図。 第３の開示の実験４における、白金粒子なしカーボン電極（実験３－１）、白金粒子１％含有カーボン電極（実験３－２）及び白金粒子５％含有カーボン電極（実験３－３）のいずれかを作用極として用いたサイクリックボルタンメトリー試験の結果を示す。 第３の開示の実験５において、白金粒子なしカーボン電極（Ａ）及び白金粒子１％含有カーボン電極（Ｂ）のいずれかを作用極として用い、０．３Ｖ又は－０．２Ｖの電位を印加して電流値を経時的に測定した結果を示す。 第３の開示の実験６において、実験２－１のセンサ（作用極導電層及び対極が、白金粒子を含まないカーボン導電層）、及び、実験２－２のセンサ（対極が表面に白金ナノ粒子が修飾されたカーボン導電層、作用極導電層が白金粒子を含まないカーボン導電層）を用いて、液体試料中のグルコース濃度に対応する電流値（Ａ）及び乳酸濃度に対応する電流値（Ｂ）を経時的に測定した結果を示す（Ｎ＝２）。 第３の開示の実験７において、実験３－１のセンサ（作用極導電層及び対極が、白金粒子を含まないカーボン導電層）、実験３－２のセンサ（作用極導電層及び対極が、白金粒子をカーボンに対し１重量％含有するカーボン導電層）、及び、実験３－３のセンサ（作用極導電層及び対極が、白金粒子をカーボンに対し５重量％含有するカーボン導電層）を用いて、液体試料中のグルコース濃度に対応する電流値（Ａ）及び乳酸濃度に対応する電流値（Ｂ）を経時的に測定した結果を示す（Ｎ＝２）。 第４の開示の一実施形態に係るセンサの平面図。 図６２に示すセンサの、対極を含む部分の、Ｓ－Ｓ’線に沿った断面図。 図６２に示すセンサの、作用極を含む部分の、Ｔ－Ｔ’線に沿った断面図。 図６５は、第４の開示の実験８の結果を示す。図６５Ａは実験８－１のセンサを用いた測定結果を示し、図６５Ｂは実験８－２のセンサを用いた測定結果を示す。 図６６は、第４の開示の実験９の結果を示す。図６６Ａは実験９－１のセンサを用いた測定結果を示し、図６６Ｂは実験９－２のセンサを用いた測定結果を示し、図６６Ｃは実験９－３のセンサを用いた測定結果を示す。 図６７は、第４の開示の実験１０の結果を示す。
　本明細書における第１の開示から第４の開示の一以上の実施形態について説明する。本明細書において、ある方法及び物性について温度を明示しない場合は、室温（２５℃±３℃）での方法及び物性を指す。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２２－１０７３２０号及び２０２２－１１６２８７号の開示内容を包含する。
　また本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
＜第１の開示の実施形態＞
　以下、第１の開示に係るセンサ及びセンサの製造方法の実施形態について説明する。本実施形態では、必要以上に詳細な説明は省略する場合がある。例えば、既によく知られた事項の詳細説明や実質的に同一の構成に対する重複説明を省略する場合がある。これは、以下の説明が不必要に冗長になるのを避け、当業者の理解を容易にするためである。
　また、出願人は、当業者が第１の開示を十分に理解するために添付図面及び以下の説明を提供するのであって、これらによって特許請求の範囲に記載の主題を限定することを意図するものではない。
＜材料＞
　本明細書の第１の開示のセンサ及びその製造方法に用いることができる材料の例について説明する。
　本明細書の第１の開示のセンサの絶縁性の基板の材料は特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオキシメチレン、モノマーキャストナイロン、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂等の樹脂材料、或いは、ガラス材料を用いることができる。好ましくはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及びポリイミドであり、より好ましくはポリエチレンテレフタレートである。基板の厚さ等の寸法は特に限定されないが、厚さが例えば０．０５ｍｍ以上、２ｍｍ以下であり、好ましくは０．１ｍｍ以上、１ｍｍ以下の基板を用いることができる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える導電層は、カーボン、金、白金、パラジウム等の導電性材料を含む層である。作用極、参照極及び対極の導電層は、前記のような導電性材料の層を、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法等を用いて基板の表面上に形成することにより製造することができる。導電層は、必要に応じて、レーザートリミング法を用いて所定のパターンに加工することができる。後述する実施形態に係るセンサの配線もまた同様の導電性材料により構成することができる。
　本明細書の第１の開示のセンサは、液体試料に浸漬して液体試料中の所定の被検物質を検出するために用いられる。被検物質としては、グルコース、乳酸、コレステロール、ビリルビン、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸、糖化アミノ酸、糖化ペプチド、ケトン体（３－ヒドロキシ酪酸）、アルコール等が挙げられる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極は、酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を備える。酸化還元反応に関与する試薬は、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬であればよく、被検物質に応じて適宜選択することができる。酸化還元反応に関与する試薬としては、酸化還元酵素とメディエータ（電子伝達物質）との組み合わせ、又は、酸化還元酵素を含むことができる。酸化還元酵素は補酵素を含むことができる。
　酸化還元酵素としては、酸化酵素又は脱水素酵素が挙げられる。酸化還元酵素の具体例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。これらの酸化還元酵素は、上記で例示した被検物質の検出に利用できる。
　また、メディエータは、限定するものではないが、金属錯体（例えば、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、鉄錯体等）、キノン化合物（例えば、ベンゾキノン、ナフトキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン、アントラキノン、及びそれらの誘導体等）、フェナジン化合物、ビオロゲン化合物、フェノチアジン化合物、及びフェノール化合物から選択される１以上であることができる。メディエータの具体例としては、フェリシアン化カリウム、ヘキサアンミンルテニウム、フェロセン、ポリ（１－ビニルイミダゾール）－ビス（ビピリジン）クロロオスミウム、ヒドロキノン、２－メチル－１，４－ベンゾキノン、１，２－ナフトキノン－４－スルホン酸塩、９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸塩、９，１０－フェナントレンキノン－２，７－ジスルホン酸塩、１，１０－フェナントロリン－５，６－ジオン、アントラキノン－２－スルホン酸塩、フェナジン誘導体（１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート等）、メチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン、メチレンブルー、メチレングリーン、２－アミノフェノール、２－アミノ－４－メチルフェノール、及び２，４－ジアミノフェノールから選択される１以上が挙げられる。上記塩としては、限定するものではないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩等が挙げられる。
　メディエータは、センサの耐久性やセンサ外への流出を抑制するという観点から高分子化合物に結合した高分子化メディエータであることが望ましい。メディエータが結合する高分子化合物は、ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、或いは、それらが結合又は混合された高分子化合物であることができる。その高分子化合物の重量平均分子量は、例えば１０，０００以上、好ましくは５０，０００以上、更に好ましくは１００，０００以上であり、重量平均分子量の上限は、例えば１０，０００，０００未満、好ましくは１，０００，０００未満である。また、高分子化合物は、特に限定されるものではないが、炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の少なくとも１つから選ばれる原子が、鎖状に複数結合して主鎖を構成するものが挙げられる。その具体例としては、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド等の天然系高分子化合物、並びに、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアリル化合物、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアルキレンオキシド、及びそれらのコポリマー等の合成系高分子化合物を挙げることができる。ポリアミノ酸としては、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）やポリ（Ｌ－リジン）を挙げることができる。また、ポリイミンとしては、ポリエチレンイミンやポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミンを挙げることができる。また、ポリアリル化合物としては、ポリアリルアミンやポリジアリルアミン等を挙げることができる。また、ポリアルキレンオキシドとしては、ポリエチレンオキシドやポリプロピレンオキシドを挙げることができる。なお、高分子化メディエータ全体は親水性であることが好ましく、更にメディエータを結合させる高分子化合物が親水性であることが好ましい。
　高分子化メディエータとしては、共有結合を介してメディエータと高分子化合物とを結合させたものを用いることができる。この共有結合としては、例えば特表２００３－５１４９２４号公報に記載されているものを用いることができ、具体的には、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、ウレタン結合、アミド結合等を挙げることができる。共有結合は、高分子化合物を形成するモノマーが元来有していた反応基から形成されてもよく、或いは、別途メディエータ又は高分子化合物に導入されたリンカーが有する反応基から形成されてもよい。高分子化メディエータの具体例としては、例えば、メディエータにフェナジン化合物を用い、高分子にポリ（Ｌ－リジン）を用い、アミド結合を介して、フェナジン化合物とポリ（Ｌ－リジン）が結合したものを挙げることができる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える試薬層は、水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａを乾燥させることにより形成することができる。液体組成物Ａは、水中に前記試薬を含み、更に必要に応じて、緩衝剤、親水性高分子化合物、導電性炭素フィラー、架橋剤等の成分を含むことができる。親水性高分子化合物としては、セルロース誘導体が挙げられ、セルロース誘導体としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される１種以上が挙げられる。導電性炭素フィラーとしては、カーボンブラック、黒鉛粉、多孔質炭素及びナノカーボンから選択される１種以上が挙げられる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、試薬層に含まれる試薬の保護膜外への漏出を防止又は抑制し、且つ、保護膜外に存在する被検物質が透過可能な膜であることができる。このような性質を有する保護膜は、高分子化合物を含むことが好ましい。保護膜に含まれる高分子化合物としては、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物等が例示できる。
　４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物としては、ポリ（４－ビニルピリジン）、４－ビニルピリジンとメタクリル酸アルキルエステルとのコポリマー（好ましくはブロックコポリマー）、スチレンと４－ビニルピリジンとオリゴプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレートとのコポリマー（好ましくはランダムコポリマー）が挙げられる。前記メタクリル酸アルキルエステルとしてはｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートが挙げられる。前記オリゴプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレートとしてはトリプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレートが挙げられる。４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）等の、２以上のエポキシ基を含む架橋剤により架橋されていることが好ましい。２以上のエポキシ基を含む架橋剤により架橋された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物は、４－ビニルピリジン由来のピリジル基（第３級アミン）と、エポキシ基との反応により生じる第四級アンモニウムカチオン含有官能基を含む。２以上のエポキシ基を含む架橋剤により架橋された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物の好ましい態様としては、第４の開示において記載する「陽イオン性官能基を含む第２重合体化合物」の具体的態様が好ましい。
　陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物としては、側鎖にスルホン酸基を有する構成単位を含む重合体化合物が挙げられ、好ましくは側鎖にスルホン酸基を有するパーフルオロ化合物を構成単位に含む重合体化合物であり、より好ましくは側鎖にスルホン酸基を有するパーフルオロ化合物と、側鎖にイオン性官能基を有さないパーフルオロ化合物とを構成単位に含む共重合体化合物であり、特に好ましくはテトラフルオロエチレンとパーフルオロ－２－（２－フロオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテルとの共重合体化合物であり、特に好ましくはＮａｆｉｏｎ（登録商標）である。陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物の好ましい態様としては、第４の開示において記載する「陽イオン交換性官能基を含む第１重合体化合物」の具体的態様が好ましい。陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む保護膜は、プロトンなどの陽イオンを試薬層と液体試料との間で輸送するために、試薬層上に設けられることが好ましい。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、２以上の保護膜の積層体であることができ、例えば、試薬層と接する側に設けられた、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む保護膜と、その上に設けられた、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む保護膜との積層体であることができる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂを乾燥することにより形成することができる。ここで保護膜成分としては、保護膜に含まれる高分子化合物、架橋剤等が挙げられる。液体組成物Ｂ中のアルコールとしては、例えば炭素数１～５の一価アルコールが挙げられ、特にメタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールが好ましく、エタノールが最も好ましい。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える第１絶縁層は、撥水性の表面を含む。ここで撥水性の表面とは、水に対する接触角が例えば９０°以上、より好ましくは１００°以上、最も好ましくは１１０°以上の表面を指す。第１絶縁層の撥水性の表面の、水に対する接触角の上限は特に限定されないが、例えば１６０°以下（前記水に対する接触角の範囲は例えば９０°以上、１６０°以下）であることができる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える第２絶縁層は、アルコールに対して撥液性（撥アルコール性）の表面を含む。ここでアルコールに対して撥液性の表面とは、アルコールに対する接触角が例えば４５°以上、より好ましくは５０°以上、最も好ましくは５５°以上の表面を指す。第２絶縁層のアルコールに対して撥液性の表面の、アルコールに対する接触角の上限は特に限定されないが、例えば１００°以下（前記アルコールに対する接触角の範囲は例えば４５°以上、１００°以下）であることができる。ここでアルコールとは、例えば炭素数１～５の一価アルコールが挙げられ、特にメタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールが好ましく、エタノールが最も好ましい。
　第１絶縁層の表面の水に対する接触角、及び、第２絶縁層の表面のアルコールに対する接触角は、２０℃における測定値を採用することができる。第１絶縁層の表面の水に対する接触角、及び、第２絶縁層の表面のアルコールに対する接触角は、市販の解析装置を用いて測定することができ、例えばＫＲＵＳＳ社製のハンディ接触角・表面自由エネルギー解析装置ＭＳＡを用いて測定することができる。表面の水又はアルコールに対する接触角は、測定対象の表面に水又はアルコールの２μＬの液滴を吐出して、２秒後に、液滴と表面との接触角を測定することが好ましい。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える第１絶縁層の、撥水性の表面は、好ましくはフッ素樹脂を含む。フッ素樹脂としては、フッ化炭化水素の重合体化合物が使用でき、例えば、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン及びパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）から選択される１以上を含む重合体化合物が挙げられ、特にフッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン及びパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）から選択される２以上を含むコポリマーであることが好ましく、フッ化ビニリデンとヘキサフルオロプロピレンとを含むコポリマーであることがより好ましい。第１絶縁層は全体をフッ素樹脂により構成することができる。
　本明細書の第１の開示のセンサの作用極が備える第２絶縁層の、アルコールに対して撥液性の表面は、好ましくはパーフルオロアルキル基を含む化合物を含む。パーフルオロアルキル基を含む化合物としては、フッ素系表面改質添加剤が挙げられる。このような第２絶縁層は、溶媒中に、絶縁性のマトリックス樹脂と、パーフルオロアルキル基を含む化合物（フッ素系表面改質添加剤）とを含む組成物を、第１絶縁層上に塗布して乾燥させることにより形成することができる。このとき、パーフルオロアルキル基を含む化合物が表面に偏析して、アルコールに対して撥液性の表面が形成される。こうして形成される第２絶縁層は、好ましくは、表面にパーフルオロアルキル基を含む化合物を含む絶縁性のマトリックス樹脂の層である。絶縁性のマトリックス樹脂の種類は特に限定されないが、例えばポリエステル系樹脂であってよい。パーフルオロアルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数２～２０の範囲であることができる。パーフルオロアルキル基は末端にトリフルオロメチル基を含有することができる。
＜センサ１の概要＞
　第１の開示の一実施形態に係るセンサ１について図面を参照して説明する。
　本実施形態のセンサ１は、図５に示すように、絶縁性の基板２と、基板２上に配置された第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０と、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０のそれぞれと電気的に接続された配線５０を備える。本実施形態のセンサ１は作用極を２つ含むが、図示しない別の実施形態では、作用極は１つのみであってもよく、３つ以上であってもよい。以下の説明では、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂを区別しない場合は、作用極１０ａ，１０ｂと表現する場合がある。また、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０を総称して、電極と表現する場合がある。また、本実施形態のセンサ１は電極として作用極、参照極及び対極を含む三極式センサであるが、参照極を含まず作用極及び対極のみを含む二極式センサであってもよい。図示しないが、参照極及び／又は対極は、作用極が配置された基板とは別の基板上に設けられていてもよい。
　センサ１は、図２１に示すように、液体試料Ｘに浸漬して液体試料Ｘ中の所定の被検物質を検出するために用いられる。液体試料Ｘとしては、例えば図示するように細胞Ｃを含む培養液や、生体から取得された血液を用いて調製された液体試料が挙げられる。被検物質の具体例は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ１の作用極１０ａ，１０ｂは、図１２及び図１６に示す通り、導電層１１ａ，１１ｂ上に、液体試料Ｘ中の被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂを含む。酸化還元反応に関与する試薬の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ１の作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料Ｘ中の被検物質を酸化する試薬を含む場合、センサ１の電極に所定の電圧を印加した条件下で、被検物質から導電層１１ａ，１１ｂに電子が移動する。同様に、試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料Ｘ中の被検物質を還元する試薬を含む場合、導電層１１ａ，１１ｂから被検物質に電子が移動する。移動する電子の量は被検物質の濃度に依存するため、センサ１の作用極１０ａ，１０ｂを流れる電流値又は電流値の変化に基づき、液体試料Ｘ中の被検物質の濃度又は濃度変化を測定することができる。
　センサ１を備える、液体試料中の被検物質を分析するための分析装置１００の一例について、図２４を参照して説明する。
　分析装置１００は、図２４に示すように、センサ１と、分析ユニット１０２と、制御ユニット１０４とを備える。センサ１の作用極１０ａ，１０ｂ、参照極２０及び対極３０は、それぞれ、配線５０を介して分析ユニット１０２と接続される。分析ユニット１０２は制御ユニット１０４と通信可能である。
　分析ユニット１０２は、電気化学測定部１１１、制御部１１２、記憶部１１３及び通信部１１４を備える。
　電気化学測定部１１１は、センサ１の各電極に対して所定の電圧を印加して被検物質の濃度を測定するポテンショスタットであって、電圧印加部１１１ａと、電流測定部１１１ｂとを含み、好ましくは更に電圧測定部（対極端子電圧測定部）１１１ｃを含む。
　電圧印加部１１１ａは、センサ１の電極に対して、液体試料Ｘに含まれる被検物質の濃度を測定するために所定の電圧を印加する。
　電流測定部１１１ｂは、電圧印加部１１１ａからセンサ１の電極に対して電圧が印加された状態で測定される、センサ１の作用極１０ａ，１０ｂと対極３０との間に流れる電流値又はその変化を検出する。上記の通り、電流測定部１１１ｂで検出される電流値又は電流値の変化は、液体試料Ｘ中の被検物質の濃度又は濃度変化の指標となる。
　電圧測定部１１１ｃは、センサ１の各電極の端子電圧を測定する。
　制御部１１２は、電圧印加部１１１ａ、電流測定部１１１ｂ、電圧測定部１１１ｃ、記憶部１１３及び通信部１１４と接続されている。制御部１１２は、電圧印加部１１１ａに対し、センサ１の各電極に所定の電圧を印加するように制御するとともに、電流測定部１１１ｂ及び電圧測定部１１１ｃにおける測定結果を、制御ユニット１０４に送信するように、通信部１１４を制御する。
　記憶部１１３は、制御部１１２と接続されており、例えば、測定対象ごとに予め設定された印加電圧の値、電流測定部１１１ｂ及び電圧測定部１１１ｃにおける測定値、予め測定された検量線等のデータを保存する。
　通信部１１４は、制御部１１２によって制御され、制御ユニット１０４の解析部１４２に、電流測定部１１１ｂ及び電圧測定部１１１ｃにおける測定結果等のデータを送信する。
　制御ユニット１０４は、通信部１１４を介して分析ユニット１０２との間で通信可能であって、表示部１４１と、解析部１４２とを備えている。
　表示部１４１は、解析部１４２における解析の結果として、例えば、電流測定部１１１ｂにおいて検出された電流値から液体試料Ｘ中の被検物質の濃度等を表示する。
　解析部１４２は、例えば、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）であって、電流測定部１１１ｂにおいて測定された、作用極１０ａ，１０ｂと対極３０との間に流れる電流値に基づき、被検物質の濃度を算出する。
＜作用極＞
　センサ１の作用極１０ａ，１０ｂの特徴について、図面、特に図１２及び図１６を参照して説明する。図１２は、センサ１の第１作用極１０ａを含む部分の、図５のＣ－Ｃ’線に沿った断面図である。図１６は、センサ１の第２作用極１０ｂを含む部分の、図５のＤ－Ｄ’線に沿った断面図である。
　第１作用極１０ａは、導電層１１ａ、第１絶縁層３ａ、第２絶縁層４ａ、試薬層１５ａ及び保護膜１６ａを備える（図１２）。第２作用極１０ｂは、導電層１１ｂ、第１絶縁層３ｂ、第２絶縁層４ｂ、試薬層１５ｂ及び保護膜１６ｂを備える（図１６）。以下の説明において、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂの各要素を区別せずに言及する場合は、導電層１１ａ，１１ｂ、第１絶縁層３ａ，３ｂ、第２絶縁層４ａ，４ｂ、試薬層１５ａ，１５ｂ及び保護膜１６ａ，１６ｂのように表現する。
　作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂは、絶縁性の基板２上に配置される。導電層１１ａ，１１ｂが形成された側の主面を第１面２ａとする。
　基板２及び導電層１１ａ，１１ｂの材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、少なくとも一部が導電層１１ａ，１１ｂ上に配置される。図１２及び図１６に示すように、第１絶縁層３ａ，３ｂの一部が導電層１１ａ，１１ｂ上に配置されてもよいし、図示しないが、第１絶縁層３ａ，３ｂの全体が導電層１１ａ，１１ｂ上に配置されてもよい。
　図示する実施形態では、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、基板２の第１面２ａ上のほぼ全体を覆う第１絶縁層３のうち、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍部分を指す。しかしこの実施形態には限定されず、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍部分のみに配置されていてもよい。
　作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、基板２の厚さ方向Ｔからの平面視において導電層１１ａ，１１ｂの一部と重なる位置に形成された、厚さ方向Ｔに貫通した第１開口部３ａ１，３ｂ１と、撥水性の表面３ａ２，３ｂ２を有することを特徴とする。第１開口部３ａ１，３ｂ１の内周縁３ａ１０，３ｂ１０の、厚さ方向Ｔからの平面視における形状は、図示する例では円形であるが、これには限定されず、多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。
　作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの、導電層１１ａ，１１ｂを覆う部分の厚さは特に限定されないが例えば０．５μｍ以上、５０μｍ以下とすることができ、好ましくは２μｍ以上、２０μｍ以下とすることができる。
　作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１の開口幅は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、２ｍｍ以下とすることができる。
　作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、撥水性の表面３ａ２，３ｂ２を有する。後述する通り、作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１内に、水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥することにより形成する。液滴形成時に、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの表面３ａ２，３ｂ２は撥水性であるため、液体組成物Ａの液滴は崩壊せずに保持され易い。このため乾燥後の試薬層１５ａ，１５ｂの特性（例えば試薬層１５ａ，１５ｂの厚さ、試薬層１５ａ，１５ｂを構成する試薬の量）を設計した範囲とすることが容易である。
　撥水性の表面３ａ２，３ｂ２を有する第１絶縁層３ａ，３ｂを構成する材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、第１絶縁層３ａ，３ｂ上に配置される。図示する実施形態では、作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、基板２の第１面２ａ上のほぼ全体を覆う第２絶縁層４のうち、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍部分を指す。しかしこの実施形態には限定されず、作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍部分のみに配置されていてもよい。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、基板２の厚さ方向Ｔからの平面視において、第１絶縁層３ａ，３ｂのうち第１開口部３ａ１，３ｂ１の全体を内包する部分３ａ３，３ｂ３と重なる位置に形成された、厚さ方向Ｔに貫通した第２開口部４ａ１，４ｂ１と、アルコールに対して撥液性の表面４ａ２，４ｂ２とを有する。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１の内周縁４ａ１０，４ｂ１０の、厚さ方向Ｔからの平面視における形状は、図示する例では円形であるが、これには限定されず、多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。図３に示すように、第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１の内周縁３ａ１０，３ｂ１０と、第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１の内周縁４ａ１０，４ｂ１０とは、厚さ方向Ｔからの平面視において平行な形状であることが好ましいが、これには限定されない。第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１は、その底に、第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１及びその内部の試薬層１５ａ，１５ｂと、第１絶縁層３ａ，３ｂの撥水性の表面３ａ２，３ｂ２のうち、第１開口部３ａ１，３ｂ１を囲う領域を含む凹部である。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの厚さは特に限定されないが例えば５μｍ以上、１００μｍ以下とすることができ、好ましくは１０μｍ以上、５０μｍ以下とすることができる。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１の開口幅は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、３ｍｍ以下とすることができる。
　作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、アルコールに対し撥液性（撥アルコール性）の表面４ａ２，４ｂ２を有する。後述する通り、作用極１０ａ，１０ｂの保護膜１６ａ，１６ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１内に、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥することにより形成する。液体組成物Ｂの液滴形成時に、作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの表面４ａ２，４ｂ２はアルコールに対して撥液性であるため、液体組成物Ｂの液滴は崩壊せずに保持され易い。このため乾燥後の保護膜１６ａ，１６ｂの特性（例えば保護膜１６ａ，１６ｂの厚さ、保護膜１６ａ，１６ｂを構成する成分の量）を設計した範囲とすることが容易である。
　アルコールに対し撥液性（撥アルコール性）の表面４ａ２，４ｂ２を有する第２絶縁層４ａ，４ｂを構成する材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂは、第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１内に配置され、第１絶縁層３ａ，３ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１の内周縁３ａ１０，３ｂ１０により規定される外周縁１５ａ１０，１５ｂ１０と、酸化還元反応に関与する試薬とを含む。試薬層１５ａ，１５ｂの厚さは、特に限定されないが、図示するように第１絶縁層３ａ，３ｂの、導電層１１ａ，１１ｂを覆う部分の厚さとほぼ同一であるか、それよりも小さいことが好ましい。
　試薬層１５ａ，１５ｂにおける酸化還元反応に関与する試薬の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　作用極１０ａ，１０ｂの保護膜１６ａ，１６ｂは、第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１内に配置され、第２絶縁層４ａ，４ｂの第２開口部４ａ１，４ｂ１の内周縁４ａ１０，４ｂ１０により規定される外周縁１６ａ１０，１６ｂ１０を含む。保護膜１６ａ，１６ｂの厚さは、特に限定されないが、図示するように第２絶縁層４ａ，４ｂの厚さとほぼ同一であるか、それよりも小さいことが好ましい。
　保護膜１６ａ，１６ｂの好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　以下の説明では、第１作用極１０ａの「試薬層１５ａ」と、第２作用極１０ｂの「試薬層１５ｂ」とを区別するために、前者を第１作用極１０ａの「第１試薬層１５ａ」、後者を第２作用極１０ｂの「第２試薬層１５ｂ」と表現する場合がある。また、第１作用極１０ａの試薬層１５ａが有する試薬を「第１試薬」、第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂが有する試薬を「第２試薬」と表現する場合がある。
　センサ１は、好適な実施形態において、複数の作用極１０ａ，１０ｂを備え、複数の作用極１０ａ，１０ｂのうち第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａに含まれる第１試薬と、第１作用極１０ａとは異なる第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂに含まれる第２試薬とは、互いに異なる。この好適な実施形態に係るセンサ１は、第１試薬が、液体試料Ｘ中の第１被検物質の酸化還元反応に関与し、第２試薬が、液体試料Ｘ中の第１被検物質とは異なる第２被検物質の酸化還元反応に関与することができるため、液体試料Ｘ中の、第１被検物質及び第２被検物質を含む複数の被検物質を検出するために用いることができる。
　複数の作用極１０ａ，１０ｂを備える上記の好適な実施形態に係るセンサ１において、第１試薬は、好ましくはグルコースの酸化還元反応に関与する酵素、より好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼを含み、第２試薬は、好ましくは乳酸の酸化還元反応に関与する酵素、より好ましくは乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼを含む。この態様に係るセンサ１は、グルコースと乳酸とを検出することができる。
＜参照極＞
　センサ１の参照極２０の構造について、図面、特に図２２を参照して説明する。図２２は、センサ１の参照極２０を含む部分の、図５のＥ－Ｅ’線に沿った断面図である。
　参照極２０は、絶縁性の基板２の第１面２ａ上に配置された参照極導電層２１と、参照極導電層２１上に配置された銀／塩化銀層２２と、銀／塩化銀層２２上に配置された参照極保護膜２３とを備える。
　参照極導電層２１は、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂに関して記載した材料により形成することができる。
　参照極保護膜２３は、作用極１０ａ，１０ｂの保護膜１６ａ，１６ｂに関して＜材料＞の欄に記載した材料により形成することができる。
　基板２の第１面２ａ上に配置された第１絶縁層３は、一部が参照極導電層２１上に配置されており、基板２の厚さ方向Ｔからの平面視において参照極導電層２１の一部と重なる位置に形成された厚さ方向Ｔに貫通した参照極第１開口部３０１を含む。参照極２０の銀／塩化銀層２２は、第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１内に配置されている。
　第１絶縁層３上に配置された第２絶縁層４は、厚さ方向Ｔからの平面視において第１絶縁層３のうち参照極第１開口部３０１の全体を内包する部分と重なる位置に形成された厚さ方向Ｔに貫通した参照極第２開口部４０１を含む。参照極２０の参照極保護膜２３は、第２絶縁層４の参照極第２開口部４０１内に配置されている。
＜対極＞
　センサ１の対極３０の構造について、図面、特に図２３を参照して説明する。図２３は、センサ１の対極３０を含む部分の、図５のＦ－Ｆ’線に沿った断面図である。
　対極３０は、絶縁性の基板２の第１面２ａ上に配置された対極導電層３１を備える。
　対極導電層３１は、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂに関して記載した材料により形成することができる。
　基板２の第１面２ａ上に配置された第１絶縁層３は、一部が対極導電層３１上に配置されており、基板２の厚さ方向Ｔからの平面視において対極導電層３１の一部と重なる位置に形成された厚さ方向Ｔに貫通した対極第１開口部３０２を含む。
　第１絶縁層３上に配置された第２絶縁層４は、厚さ方向Ｔからの平面視において第１絶縁層３のうち対極第１開口部３０２と重なる位置に形成された厚さ方向Ｔに貫通した対極第２開口部４０２を含む。
　対極３０の対極導電層３１は、第１絶縁層３の対極第１開口部３０２及び第２絶縁層４の対極第２開口部４０２を通じて外部に露出している。このため図２１に示すようにセンサ１を液体試料Ｘに浸漬したときに、対極３０の対極導電層３１は液体試料Ｘと直接接触する。
＜センサ１の製造方法＞
　センサ１の製造方法の好ましい実施形態について、図面、特に図１～図１６を参照して説明する。
　まず図１に示すように、絶縁性の基板２の第１面２ａ上に、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂ、参照極２０の参照極導電層２１及び対極３０の対極導電層３１、並びに、それらの各々に電気的に接続された配線５０を配置する。
　続いて図２に示すように、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１、対極導電層３１及び配線５０が配置された基板２の第１面２ａ上に、第１絶縁層３を更に積層する。第１絶縁層３のうち、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍の部分が、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂである。作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの一部は、導電層１１ａ，１１ｂ上に配置され、導電層１１ａ，１１ｂの上面を覆う。作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの一部と重なる位置に、作用極１０ａ，１０ｂの第１開口部３ａ１，３ｂ１を有する。第１絶縁層３は更に、参照極導電層２１の一部と重なる位置に参照極第１開口部３０１を有し、対極導電層３１の一部と重なる位置に対極第１開口部３０２を有する。
　続いて図３に示すように、第１絶縁層３上に、第２絶縁層４を更に積層する。第２絶縁層４のうち、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂの近傍の部分が、作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂである。作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂは、作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂのうち第１開口部３ａ１，３ｂ１の全体を内包する部分３ａ３，３ｂ３と重なる位置に形成された、第２開口部４ａ１，４ｂ１を有する。第２絶縁層４は更に、第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１と重なる位置に参照極第２開口部４０１を有し、第１絶縁層３の対極第１開口部３０２と重なる位置に対極第２開口部４０２を有する。好ましくは、第２絶縁層４は、溶媒中に、絶縁性のマトリックス樹脂と、パーフルオロアルキル基を含む化合物（フッ素系表面改質添加剤）とを含むインクを、第１絶縁層上に塗布して乾燥させることにより形成することができる。
　図３に示す、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１、対極導電層３１及び配線５０、第１絶縁層３並びに第２絶縁層４が配置された基板２のうち、第１作用極１０ａに対応する部分の、Ａ－Ａ’線に沿った断面を図６に示す。図６に示すように、作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１は、その底に、作用極１０ａの導電層１１ａを含む凹部である。作用極１０ａの第１絶縁層３ａは、撥水性の表面３ａ２を有する。
　続いて図７に示すように、作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内に、水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａの液滴を形成する。このとき、作用極１０ａの第１絶縁層３ａの表面３ａ２は撥水性であるため、液体組成物Ａの液滴は、第１絶縁層３ａの表面３ａ２との接点での内角θａ（図７に図示）が、第１絶縁層３ａの表面３ａ２の水接触角に達するまで崩壊せずに保持される。
　このように作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内に液体組成物Ａの液滴を形成したのち、乾燥して、図８に示すように、試薬層１５ａを形成する。上記の通り、水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａの液滴は、撥水性の表面３ａ２を有する第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内で崩壊せずに保持され易いため、乾燥後の試薬層１５ａの特性（例えば試薬層１５ａの厚さ、試薬層１５ａを構成する試薬の量）を設計した範囲とすることが容易である。仮に、第１絶縁層３ａの表面が撥水性を有さない場合は、第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内に液体組成物Ａの液滴を形成したときに、液滴が崩壊し液体組成物Ａは第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１の外側を濡らす可能性が高く、乾燥して得られる試薬層の特性を、設計した範囲に調節することは容易ではない。
　水中に酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物Ａの組成の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　試薬層１５ａの形成後に、図９に示すように、作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴を形成する。このとき、第２絶縁層４ａの表面４ａ２はアルコールに対して撥液性であるため、液体組成物Ｂの液滴は、第２絶縁層４ａの表面４ａ２との接点での内角θｂ（図９に図示）が、第２絶縁層４ａの表面４ａ２のアルコールとの接触角に達するまで崩壊せずに保持される。
　このように作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内の液体組成物Ｂの液滴を形成したのち、乾燥して、図１０に示すように、保護膜１６ａを形成する。上記の通り、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴は、アルコールに対して撥液性の表面４ａ２を有する第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内で崩壊せずに保持され易いため、乾燥後の保護膜１６ａの特性（例えば保護膜１６ａの厚さ、保護膜１６ａを構成する成分の量）を設計した範囲とすることが容易である。仮に、第２絶縁層４ａの表面がアルコールに対する撥液性を有さない場合は、第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に液体組成物Ｂの液滴を形成したときに、液滴が崩壊し液体組成物Ｂは第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１の外側を濡らす可能性が高く、乾燥して得られる保護膜の特性を、設計した範囲に調節することは容易ではない（図１７～２０を参照して説明する後述の比較例を参照）。
　アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの組成の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　図９～１２では、作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内における保護膜１６ａの形成を２段階で行う例を示す。センサ１の製造方法のこの態様では、図９に示すように、試薬層１５ａの形成後に、第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、図１０に示すように、保護膜１６ａの厚さ方向の一部を形成する。続いて、図１１に示すように、第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、更に液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、図１２に示すように、保護膜１６ａの全体を形成する。ただしこの例には限定されず、保護膜の形成は１段階で行ってもよいし、３段階以上で行ってもよい。
　上記の通り、センサ１は、好適な実施形態において、複数の作用極１０ａ，１０ｂを備え、複数の作用極１０ａ，１０ｂのうち第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａに含まれる第１試薬と、第１作用極１０ａとは異なる第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂに含まれる第２試薬とは、互いに異なる。この好適な実施形態に係るセンサ１の製造方法は、試薬層を形成する工程として、
　複数の作用極１０ａ，１０ｂに含まれる第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａを、第１作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内に、水中に第１試薬を含む第１液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して形成すること（図６～図８参照）、及び
　複数の作用極１０ａ，１０ｂに含まれる第１作用極１０ａとは異なる第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂを、第２作用極１０ｂの第１絶縁層３ｂの第１開口部３ｂ１内に、水中に第１試薬とは異なる第２試薬を含む第２液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して形成すること（図示しないが、図６～図８と同様の工程）
を含むことが好ましい。
　本実施形態に係るセンサ１の製造方法では、複数の作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂを個別に独立して形成することができるため、水中に試薬を含む液体組成物Ａの組成を調節することにより、複数の作用極１０ａ，１０ｂに、異なる試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂを形成することが容易である。
　上記の好適な実施形態に係る方法により製造される、複数の作用極１０ａ，１０ｂに異なる試薬を含むセンサ１において、第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａは、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼを含む第１試薬を含む。この実施形態では、第１作用極１０ａは、図１２に示すように、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第１保護膜１６ａを備える。このような第１保護膜１６ａの形成は、
　第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａの形成後に、第１作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、アルコール中に４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第１液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、第１保護膜１６ａを形成すること
を含むことができる。第１保護膜１６ａの形成は、図９～図１２に示すように２段階で行ってもよいし、図示しないが１段階又は３段階以上で行ってもよい。
　上記の好適な実施形態に係る方法により製造される、複数の作用極１０ａ，１０ｂに異なる試薬を含むセンサ１において、第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂは、例えば乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼを含む第２試薬を含む。この実施形態では、第２作用極１０ｂの保護膜１６ｂは、図１６に示すように、第２試薬層１５ｂ上に配置された、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む第２保護膜１６ｂａと、第２保護膜１６ｂａ上に配置された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第３保護膜１６ｂｂとを含む。このような第２保護膜１６ｂａと第３保護膜１６ｂｂとを含む保護膜１６ｂの形成は、
　第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂの形成後に、第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１内に、アルコール中に前記陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む第２液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、第２保護膜１６ｂａを形成すること（図１３及び図１４参照）、及び
　第２保護膜１６ｂａの形成後に、第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１内に、アルコール中に前記４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第３液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、第３保護膜１６ｂｂを形成すること（図１５及び図１６参照）
を含むことができる。
　本実施形態に係る方法では、複数の作用極１０ａ，１０ｂの保護膜１６ａ，１６ｂを個別に独立して形成することができるため、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの組成を調節することにより、複数の作用極１０ａ，１０ｂの異なる試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂ上に、試薬層１５ａ，１５ｂに応じて最適化された異なる組成の保護膜１６ａ，１６ｂを形成することが容易である。
　本実施形態に係る方法では、参照極２０を形成する工程を含むことができる。参照極２０を形成する工程は、
　図３に示す、参照極導電層２１、第１絶縁層３及び第２絶縁層４が配置された基板２において、第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１内の参照極導電層２１上に銀／塩化銀層２２を配置すること（図４）、及び
　銀／塩化銀層２２の配置後に、基板２の第２絶縁層４の参照極第２開口部４０１内の銀／塩化銀層２２上に参照極保護膜２３を配置すること（図５、図２２）
を含むことができる。
＜第１の開示の実施例＞
　第１の開示の実施例として、図５に示す構成のセンサ１を製造した。図５に示す構成のセンサ１に使用した材料及び製造方法の概略を以下に示す。
（基板）
　絶縁性の基板２として図１等で図示する形状のポリエチレンテレフタレートからなる厚さ１８８μｍの基板を用いた。
（導電層）
　絶縁性の基板２の第１面２ａ上に、カーボンペーストを適用し１４０℃で１時間加熱することにより、図１に図示する形状の、作用極１０ａ，１０ｂの導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１及び対極導電層３１、並びに、それらの各々に電気的に接続された配線５０を、厚さ５μｍのカーボン導電層により形成した。
（第１絶縁層）
　続いて、カーボン導電層が配置された基板２の第１面２ａ上に、図２に示すように、フッ化ビニリデンとヘキサフルオロプロピレンとを含むコポリマーを含むフッ素樹脂からなる、基板２の第１面２ａ及びカーボン導電層を覆う、カーボン導電層上の部分の厚さが５μｍの第１絶縁層３を積層した。第１絶縁層３は、硬化により前記フッ素樹脂を形成する組成物を、カーボン導電層が配置された基板２の第１面２ａ上に適用し１４０℃で１時間加熱することにより形成した。
　第１作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１は、直径１．２ｍｍの円形とした。第２作用極１０ｂの第１絶縁層３ｂの第１開口部３ｂ１は、直径１．４ｍｍの円形とした。参照極第１開口部３０１は直径１．１ｍｍの円形とし、対極第１開口部３０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
　第１絶縁層３の表面（作用極１０ａ，１０ｂの第１絶縁層３ａ，３ｂの表面３ａ２，３ｂ２を含む）の水接触角は１３４．２°であった。水接触角の測定は、ＫＲＵＳＳ社製のハンディ接触角・表面自由エネルギー解析装置ＭＳＡを用いて、２０℃において、測定対象の表面に水の２μＬの液滴を吐出して、２秒後に、液滴と表面との接触角を測定することにより行った。
（第２絶縁層）
　続いて図３に示すように、第１絶縁層３上に、溶媒中にポリエステル系樹脂と、パーフルオロアルキル基を含むフッ素系表面改質添加剤とを含む組成物を塗布し、１４０℃で１時間加熱することにより、厚さ４０μｍの第２絶縁層４を積層した。
　第１作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１及び第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１は、それぞれ直径２ｍｍの円形とした。参照極第２開口部４０１は直径２ｍｍの円形とし、対極第２開口部４０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
　第２絶縁層４の表面（作用極１０ａ，１０ｂの第２絶縁層４ａ，４ｂの表面４ａ２，４ｂ２を含む）のエタノールに対する接触角は６０．７°であった。エタノールに対する接触角の測定は、ＫＲＵＳＳ社製のハンディ接触角・表面自由エネルギー解析装置ＭＳＡを用いて、２０℃において、測定対象の表面にエタノールの２μＬの液滴を吐出して、２秒後に、液滴と表面との接触角を測定することにより行った。
（第１作用極（グルコース測定用）試薬層）
　第１作用極１０ａの第１絶縁層３ａの第１開口部３ａ１内に、水中にリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、カーボンブラック分散液、ポリマー結合型メディエータ、グルコースオキシダーゼ及び架橋剤を含む第１液体組成物Ａの０．４μＬの液滴を形成し、乾燥して、グルコースオキシダーゼ及びメディエータを含む第１試薬層１５ａを形成した。
　このとき第１液体組成物Ａの液滴は第１開口部３ａ１から溢れ出ることはなく、乾燥後の第１試薬層１５ａは第１開口部３ａ１内のみに形成された（図７及び図８参照）。
（第２作用極（乳酸測定用）試薬層）
　第２作用極１０ｂの第１絶縁層３ｂの第１開口部３ｂ１内に、水中にカーボンブラック分散液、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリマー結合型メディエータ、乳酸オキシダーゼ、ポリイミダゾール、ポリ－Ｌ－リジン及び架橋剤を含む第２液体組成物Ａの０．６μＬの液滴を形成し、乾燥して、乳酸オキシダーゼ及びメディエータを含む第２試薬層１５ｂを形成した。
　このとき第２液体組成物Ａの液滴は第１開口部３ｂ１から溢れ出ることはなく、乾燥後の第２試薬層１５ｂは第１開口部３ｂ１内のみに形成された（図７及び図８参照）。
（第１作用極（グルコース測定用）保護膜）
　以下の各試薬を下記終濃度となるようにエタノールに混合し約１時間反応させて、第１液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）を調製した。
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：７４，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：８７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１６、ＮＡＲＤ社製）、終濃度３．５５ｗｔ％
・トリプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレート－スチレン－４－ビニルピリジンのランダムコポリマー（ナード社製）、終濃度４．４５ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度７ｍＭ
　第１作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、前記第１液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、続いて更に前記第１液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、第１保護膜１６ａを形成した（図１２参照）。
　このとき第１液体組成物Ｂの液滴は第２開口部４ａ１から溢れ出ることはなく、乾燥後の第１保護膜１６ａは第２開口部４ａ１内のみに形成された（図９、図１０、図１１及び図１２参照）。
（第２作用極（乳酸測定用）保護膜）
　２１．５ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液（シグマアルドリッチ社製）２３０９３．６７ｍｇに、エタノール（富士フイルム和光純薬社製）６４７２．７９ｍｇ及び５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（富士フイルム和光純薬社製）１２２６．４６ｍｇを添加して分散液のｐＨを調整し（陽イオン交換基の中和処理）、ボルテックスミキサーで析出物を溶解して、１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液３０７９２．９２ｍｇを調製した。得られた１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液を第２液体組成物Ｂとした。この第２液体組成物Ｂは、低級アルコールを含む溶媒中にＮａｆｉｏｎ（登録商標）を含む。
　第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１内に、前記第２液体組成物Ｂの０．６０μＬの液滴を形成し、乾燥して、第２保護膜１６ｂａを形成した（図１４参照）。
　このとき第２液体組成物Ｂの液滴は第２開口部４ｂ１から溢れ出ることはなく、乾燥後の第２保護膜１６ｂａは第２開口部４ｂ１内のみに形成された（図１３及び図１４参照）。
　続いて、上記の第１液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）と同一の組成物を第３液体組成物Ｂとして以下の処理に用いた。すなわち、第２保護膜１６ｂａが形成された第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１内に、前記第３液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、第３保護膜１６ｂｂを形成した（図１６参照）。
　このとき第３液体組成物Ｂの液滴は第２開口部４ｂ１から溢れ出ることはなく、乾燥後の第３保護膜１６ｂｂは第２開口部４ｂ１内のみに形成された（図１５及び図１６参照）。
（参照極）
　第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１内の参照極導電層２１上に、銀／塩化銀ペーストを適用し、１４０℃で１時間加熱して、銀／塩化銀層２２形成した。
　続いて、第２絶縁層４の参照極第２開口部４０１内の銀／塩化銀層２２上に参照極保護膜２３を配置して、参照極２０（図２２）を形成した。
＜比較例＞
　比較例のセンサを、第２絶縁層を次の手順で作製したことを除いて、上記の実施例のセンサ１と同様の方法で作製した。
　第１絶縁層３上に、溶媒中に実施例と同じポリエステル系樹脂を含み、フッ素系表面改質添加剤を含まない組成物を塗布し、１４０℃で１時間加熱することにより、厚さ３８μｍの第２絶縁層を形成した。
　こうして得られた比較例のセンサの第２絶縁層の表面のエタノールに対する接触角は１１．２°であった。
　比較例のセンサの第１作用極及び第２作用極の保護膜の形成時に次の問題が発生した。
　比較例のセンサの第１作用極１０ａの第２絶縁層４ａの第２開口部４ａ１内に、実施例で用いたのと同じ前記第１液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）の０．６５μＬの液滴を形成したところ、図１７に示すように、液滴が第２開口部４ａ１内に留まらず、第２絶縁層４ａの上面まで前記第１液体組成物Ｂが濡れ拡がった。この液滴を乾燥したところ、図１８に示すように、第２開口部４ａ１内だけでなく第２絶縁層４ａの上面上にも第１保護膜１６ａの一部が形成された。乾燥して、続いて更に前記第１液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成したところ、図１９に示すように、第２絶縁層４ａの上面まで前記第１液体組成物Ｂが濡れ拡がった。それを乾燥したところ、図２０に示すように、第２開口部４ａ１内だけでなく第２絶縁層４ａの上面上にも第１保護膜１６ａの一部が形成された。
　図示しないが、比較例のセンサの第２作用極１０ｂの第２絶縁層４ｂの第２開口部４ｂ１内に、実施例で用いたのと同じ前記第２液体組成物Ｂ（Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）分散液）の液滴を形成し乾燥したときにも、第２保護膜１６ｂａは第２開口部４ｂ１内だけでなく第２絶縁層４ｂの上面上にも不規則に形成された。更に、実施例で用いたのと同じ前記第３液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）の液滴を形成し乾燥したときにも、第３保護膜１６ｂｂは第２開口部４ｂ１内だけでなく第２絶縁層４ｂの上面上にも不規則に形成された。
＜グルコース及び乳酸の測定実験＞
（培養液）
　ＲＰＭＩ－１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒ１３８３、シグマアルドリッチ社製）の溶液に、緩衝液成分としてＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（同仁化学社製）、及びＭＯＰＳ（３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（同仁化学社製）をそれぞれ終濃度２５ｍＭとなるように加えた、更にグルコース濃度３０ｍＭ、乳酸濃度１５ｍＭ、ｐＨ７．４に調整して、培養液を調製した。
（電流値測定）
　上記の実施例のセンサ１及び比較例のセンサを、上記の培養液に浸漬し、第１作用極及び第２作用極に、参照極に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極と対極との間の電流値及び第２作用極と対極との間の電流値を約１１日間測定した。測定はＮ＝２で行った。
　実施例のセンサ１の第１作用極（グルコース測定用）の電流値の測定結果を図２５Ａに示す。比較例のセンサの第１作用極（グルコース測定用）の電流値の測定結果を図２５Ｂに示す。実施例のセンサ１での電流値は安定していたのに対し、比較例のセンサでの電流値は経時的に減少した。比較例のセンサでは、第１保護膜の厚みの制御が難しいため、グルコースの透過性が初期から大きいことや、グルコースオキシダーゼを含む試薬が漏出したことが推定された。
　実施例のセンサ１の第２作用極（乳酸測定用）の電流値の測定結果を図２６Ａに示す。比較例のセンサの第２作用極（乳酸測定用）の電流値の測定結果を図２６Ｂに示す。実施例のセンサ１での電流値は安定していたのに対し、比較例のセンサでの電流値は経時的に減少した。比較例のセンサでは、第２保護膜及び第３保護膜の厚みの制御が難しいため、乳酸の透過性が初期から大きいことや、乳酸オキシダーゼを含む試薬が漏出したことが推定された。
＜第２の開示の実施形態＞
　以下、第２の開示に係るセンサ及びセンサユニットの実施形態について説明する。本実施形態では、必要以上に詳細な説明は省略する場合がある。例えば、既によく知られた事項の詳細説明や実質的に同一の構成に対する重複説明を省略する場合がある。これは、以下の説明が不必要に冗長になるのを避け、当業者の理解を容易にするためである。
　また、出願人は、当業者が第２の開示を十分に理解するために添付図面及び以下の説明を提供するのであって、これらによって下記の「第２の開示に関する付記」に記載の事項を限定することを意図するものではない。
＜材料＞
　本明細書の第２の開示のセンサに用いることができる材料の例について説明する。
　本明細書の第２の開示のセンサの絶縁性の基板の材料は特に限定されないが、例えば、本明細書の第１の開示のセンサの絶縁性の基板の材料と同じものが利用できる。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極、参照極及び対極が備える導電層は、カーボン、金、白金、パラジウム等の導電性材料を含む層である。導電層は、前記のような導電性材料の層を、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法等を用いて基板の表面上に形成することにより製造することができる。導電層は、必要に応じて、レーザートリミング法を用いて所定のパターンに加工することができる。
　本明細書の第２の開示のセンサの配線もまた、導電層と同様の導電性材料により構成することができる。
　本明細書の第２の開示のセンサは、液体試料に浸漬して液体試料中の所定の被検物質を検出するために用いられる。液体試料は水を溶媒として含む液体試料であることが好ましい。液体試料としては、細胞培養液や、生体から取得された血液を用いて調製された液体試料が挙げられる。被検物質の例は、本明細書の第１の開示のセンサによる被検物質に関して記載の通りである。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極は、酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を備える。酸化還元反応に関与する試薬は、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬であればよく、被検物質に応じて適宜選択することができる。酸化還元反応に関与する試薬としては、酸化還元酵素とメディエータ（電子伝達物質）との組み合わせ、又は、酸化還元酵素を含むことができる。酸化還元酵素は補酵素を含むことができる。
　酸化還元酵素としては、酸化酵素又は脱水素酵素が挙げられる。酸化還元酵素の具体例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　また、メディエータは特に限定されず、その例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極が備える試薬層は、前記試薬に加えて、更に緩衝剤、親水性高分子化合物、導電性炭素フィラー、架橋剤等の成分を含むことができる。親水性高分子化合物及び導電性炭素フィラーの例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、試薬層に含まれる試薬の保護膜外への漏出を防止又は抑制し、且つ、保護膜外に存在する被検物質が透過可能な膜であることができる。このような性質を有する保護膜は、高分子化合物を含むことが好ましい。保護膜に含まれる高分子化合物としては、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物等が例示できる。
　４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物、及び、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物の例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、２以上の保護膜の積層体であることができ、その例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第２の開示のセンサの作用極が備える保護膜の別の好適な例は、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む保護膜である。
　本明細書の第２の開示のセンサの参照極は保護膜を備えることができる。参照極の保護膜は、作用極の保護膜に関して上述した材料により構成することができる。
＜センサ１１０１の概要＞
　第２の開示の一実施形態に係るセンサ１１０１について図面を参照して説明する。
　本実施形態のセンサ１１０１は、図３１並びにその断面図である図３３、図３４、図３５及び図３６に示すように、
　液体試料に浸漬される先端部１２０１を含む絶縁性の基板１２００と、
　基板１２００の第１面１２０２における先端部１２０１の付近に配置され、作用極１３１０、参照極１３２０及び対極１３３０を含む検出電極１３００と、
　基板１２００の第１面１２０２に配置され、検出電極１３００と接続された配線１００５と、
　基板１２００の第１面１２０２に配置され、検出電極１３００及び配線１００５の少なくとも一部を覆うように形成された絶縁層１０５０と、
　絶縁層１０５０に形成された、対極１３３０の上面１３３１と連通しており、基板１２００の先端部１２０１の側に開口する先端開口部１０６１と、
　絶縁層１０５０に形成された、先端開口部１０６１と対極１３３０の上面１３３１とを接続する、液体試料を先端開口部１０６１から対極１３３０の上面１３３１へと導く流路１０６２と
を備える。
　本実施形態のセンサ１１０１は作用極１３１０を２つ含むが、図示しない別の実施形態では、作用極は１つのみであってもよく、３つ以上であってもよい。
　センサ１１０１は、図３９及び図４３に示すように、液体試料Ｘ１に浸漬して液体試料Ｘ１中の所定の被検物質を検出するために用いられる。液体試料及び被検物質の具体例は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ１１０１の作用極１３１０は、図３３に示すように、作用極導電層１３１１と、作用極導電層１３１１上に配置された、液体試料Ｘ１中の被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１３１５を含む。酸化還元反応に関与する試薬の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　作用極１３１０の試薬層１３１５が、液体試料Ｘ１中の被検物質を酸化する試薬を含む場合、センサ１１０１の検出電極１３００に所定の電圧を印加した条件下で、被検物質から作用極１３１０に電子が移動する。同様に、試薬層１３１５が、液体試料Ｘ１中の被検物質を還元する試薬を含む場合、作用極１３１０から被検物質に電子が移動する。移動する電子の量は被検物質の濃度に依存するため、センサ１１０１の作用極１３１０を流れる電流値又は電流値の変化に基づき、液体試料Ｘ１中の被検物質の濃度又は濃度変化を測定することができる。
　センサ１１０１を備える、液体試料中の被検物質を分析するための分析装置１１００の一例について、図４８を参照して説明する。
　分析装置１１００は、図４８に示すように、センサ１１０１と、分析ユニット１１０２と、制御ユニット１１０４とを備える。センサ１１０１の作用極１３１０、参照極１３２０及び対極１３３０を含む検出電極１３００は、それぞれ、配線１００５を介して分析ユニット１１０２と接続される。分析ユニット１１０２は制御ユニット１１０４と通信可能である。
　分析ユニット１１０２は、電気化学測定部１１１１、制御部１１１２、記憶部１１１３及び通信部１１１４を備える。
　電気化学測定部１１１１は、センサ１１０１の検出電極１３００に対して所定の電圧を印加して被検物質の濃度を測定するポテンショスタットであって、電圧印加部１１１１ａと、電流測定部１１１１ｂとを含み、好ましくは更に電圧測定部（対極端子電圧測定部）１１１１ｃを含む。
　電圧印加部１１１１ａは、センサ１１０１の検出電極１３００に対して、液体試料Ｘ１に含まれる被検物質の濃度を測定するために所定の電圧を印加する。
　電流測定部１１１１ｂは、電圧印加部１１１１ａからセンサ１１０１の検出電極１３００に対して電圧が印加された状態で測定される、センサ１１０１の作用極１３１０と対極１３３０との間に流れる電流値又はその変化を検出する。上記の通り、電流測定部１１１１ｂで検出される電流値又は電流値の変化は、液体試料Ｘ１中の被検物質の濃度又は濃度変化の指標となる。
　電圧測定部１１１１ｃは、センサ１１０１の対極１３３０の端子電圧を測定する。
　制御部１１１２は、電圧印加部１１１１ａ、電流測定部１１１１ｂ、電圧測定部１１１１ｃ、記憶部１１１３及び通信部１１１４と接続されている。制御部１１１２は、電圧印加部１１１１ａに対し、センサ１１０１の検出電極１３００に所定の電圧を印加するように制御するとともに、電流測定部１１１１ｂ及び電圧測定部１１１１ｃにおける測定結果を、制御ユニット１１０４に送信するように、通信部１１１４を制御する。
　記憶部１１１３は、制御部１１１２と接続されており、例えば、測定対象ごとに予め設定された印加電圧の値、電流測定部１１１１ｂ及び電圧測定部１１１１ｃにおける測定値、予め測定された検量線等のデータを保存する。
　通信部１１１４は、制御部１１１２によって制御され、制御ユニット１１０４の解析部１１４２に、電流測定部１１１１ｂ及び電圧測定部１１１１ｃにおける測定結果等のデータを送信する。
　制御ユニット１１０４は、通信部１１１４を介して分析ユニット１１０２との間で通信可能であって、表示部１１４１と、解析部１１４２とを備えている。
　表示部１１４１は、解析部１１４２における解析の結果として、例えば、電流測定部１１１１ｂにおいて検出された電流値から液体試料Ｘ１中の被検物質の濃度等を表示する。
　解析部１１４２は、例えば、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）であって、電流測定部１１１１ｂにおいて測定された、作用極１３１０と対極１３３０との間に流れる電流値に基づき、被検物質の濃度を算出する。
＜センサ１１０１の構造＞
　続いて本実施形態のセンサ１１０１の構造を、主に図３１並びにその断面図である図３３、図３４、図３５及び図３６を参照して説明する。
　本実施形態のセンサ１１０１の基板１２００は、液体試料に浸漬される先端部１２０１を含む。基板１２００は板状体であることができる。先端部１２０１は、基板１２００の周縁部のうち、センサ１１０１が液体試料Ｘ１に浸漬される際の先端となる部分である（図４３参照）。基板１２００の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ１１０１において、作用極１３１０、参照極１３２０及び対極１３３０を含む検出電極１３００は、基板１２００の第１面１２０２における先端部１２０１の付近に配置される。
　センサ１１０１の配線１００５は、基板１２００の第１面１２０２上に配置され、検出電極１３００の各電極（作用極１３１０、参照極１３２０及び対極１３３０）と電気的に接続されている。配線１００５の材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ１１０１の絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２に配置され、検出電極１３００及び配線１００５の少なくとも一部を覆うように形成されている。
　絶縁層１０５０は、図示する例では、基板１２００の第１面１２０２に配置された第１絶縁層１０５１と、第１絶縁層１０５１上に配置された第２絶縁層１０５２とを含む。しかし図示しない別の実施形態では、絶縁層１０５０は１層のみからなっていてもよいし、３層以上を含んでいてもよい。
　絶縁層１０５０は、絶縁性の層であればよく、材料は特に限定されないが、例えば、絶縁性の硬化樹脂を含む絶縁層、絶縁シートを含む絶縁層等であることができ、複数の絶縁層の組み合わせであってもよい。
　絶縁性の硬化樹脂を含む絶縁層は、硬化性樹脂組成物を硬化して形成することができる。硬化性樹脂組成物としては、活性エネルギー線照射により重合及び／又は架橋して絶縁性の硬化樹脂を生じる組成物を用いることができる。活性エネルギー線としては紫外線、電子線、Ｘ線、赤外線、可視光線等が挙げられ、紫外線又は電子線が好ましい。硬化性樹脂組成物としては例えばネガ型レジスト組成物が利用できる。硬化性樹脂組成物を硬化して形成することができる絶縁性の硬化樹脂としては、フッ素樹脂が好ましい。フッ素樹脂としては、主鎖炭素及び／又は側鎖上にフッ素原子を含むポリマーを含む樹脂であればよく、例えば主鎖炭素及び／又は側鎖上にフッ素原子を含むポリ（メタ）アクリレート樹脂、ポリエステル樹脂等が挙げられる。絶縁性の硬化樹脂を含む絶縁層の厚さは特に限定されないが、例えば１μｍ以上、５０μｍ以下とすることができる。
　絶縁シートを含む絶縁層は、絶縁シートと、絶縁シートの一方の面上に配置された粘着剤又は接着剤を含む結合層とを含むことができる。結合層を含む絶縁シートを、基板１２００の第１面１２０２上に、直接又は他の絶縁層を介して貼付することにより、絶縁シートを含む絶縁層を形成することができる。絶縁シートは絶縁性樹脂シートであることができ、例えばポリエチレンテレフタレートシートが例示できる。結合層としては例えば両面テープや、粘着剤又は接着剤の層が利用できる。絶縁シートの外側の表面は、撥水性表面であることが好ましく、例えば撥水コーティングや表面の凹凸処理により撥水性が付与された撥水性表面であることができる。絶縁シートを含む絶縁層の厚さは特に限定されないが、絶縁シートの厚さが例えば１０μｍ以上、２００μｍ以下とすることができ、好ましくは２０μｍ以上、１００μｍ以下とすることができ、絶縁シートの一方の面に配置される結合層の厚さが例えば１μｍ以上、５０μｍ以下とすることができ、好ましくは５μｍ以上、２０μｍ以下とすることができる。
　絶縁層１０５０の好ましい態様は、基板１２００の第１面１２０２に配置された、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１と、第１絶縁層１０５１上に配置された、絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２とを含む。この態様において第２絶縁層１０５２は、絶縁シートと、絶縁シートの第１絶縁層１０５１側の面上に配置された結合層とを含むことができ、絶縁シートが結合層を介して第１絶縁層１０５１上に貼付されていることが好ましい。この態様において、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１の厚さは特に限定されないが、検出電極１３００の配線１００５及び各導電層（作用極導電層１３１１、参照極導電層１３２１、対極１３３０）を覆う部分の厚さが例えば０．５μｍ以上、５０μｍ以下とすることができ、好ましくは２μｍ以上、２０μｍ以下とすることができる。絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２の厚さの例は前段落に記載の通りである。
　センサ１１０１の作用極１３１０を、図面、特に図３３を参照して説明する。図３３は、図３１に示すセンサ１１０１の作用極１３１０を含む部分の、図３１のＪ－Ｊ’線に沿った断面図である。
　作用極１３１０は、基板１２００の第１面１２０２上に配置された作用極導電層１３１１と、作用極導電層１３１１上に配置された試薬層１３１５とを含む。作用極１３１０は、好ましくは、図示するように試薬層１３１５上に配置された作用極保護膜１３１６を更に含む。作用極導電層１３１１、試薬層１３１５及び作用極保護膜１３１６の材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。作用極１３１０の作用極導電層１３１１に配線１００５が接続される（図２７及び図３１参照）。
　作用極１３１０が作用極保護膜１３１６を含むことにより次の効果が奏される。作用極保護膜１３１６は試薬層１３１５からの試薬の漏出を抑制する。また、作用極保護膜１３１６は多孔質であるため、液体試料Ｘ１が浸透することができる。このためセンサ１１０１を液体試料Ｘ１に浸漬したときに、作用極１３１０への液体試料Ｘ１の到達が容易であり、作用極１３１０への液体試料Ｘ１の浸漬阻害が生じにくい。
　絶縁層１０５０は、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において、作用極１３１０の少なくとも一部と重なる位置に形成された、厚さ方向Ｔ１に貫通した作用極開口部１５０１を備える。図示する例では作用極開口部１５０１は、作用極導電層１３１１上に位置し、試薬層１３１５及び作用極保護膜１３１６が作用極開口部１５０１内に配置されている。作用極保護膜１３１６が作用極開口部１５０１内に配置されていることにより、試薬層１３１５からの試薬の漏出が更に効果的に抑制される。試薬層１３１５及び作用極保護膜１３１６のそれぞれの外周縁は、作用極開口部１５０１の内周縁により規定される。絶縁層１０５０の作用極開口部１５０１の内周縁の、厚さ方向Ｔ１からの平面視における形状は、図示する例では円形であるが、これには限定されず、多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。絶縁層１０５０の作用極開口部１５０１の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。
　図示する例では、絶縁層１０５０の作用極開口部１５０１は、第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１と、第２絶縁層１０５２の作用極第２開口部１５２１とにより構成される。作用極第１開口部１５１１は、第１絶縁層１０５１の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において作用極導電層１３１１の一部と重なる位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。作用極第２開口部１５２１は、第２絶縁層１０５２の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において第１絶縁層１０５１のうち作用極第１開口部１５１１の全体を内包する部分と重なる位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。試薬層１３１５は、第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１内に配置されており、作用極第１開口部１５１１の内周縁により規定される外周縁を含む。作用極保護膜１３１６は、第２絶縁層１０５２の作用極第２開口部１５２１内に配置されており、作用極第２開口部１５２１の内周縁により規定される外周縁を含む。第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１及び第２絶縁層１０５２の作用極第２開口部１５２１の内周縁の、厚さ方向Ｔ１からの平面視における形状は、図示する例ではそれぞれ円形であるが、これには限定されず、それぞれ多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、２ｍｍ以下とすることができる。第２絶縁層１０５２の作用極第２開口部１５２１の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。
　続いてセンサ１１０１の参照極１３２０について、図面、特に図３４を参照して説明する。図３４は、図３１のセンサ１１０１の参照極１３２０を含む部分の、図３１のＫ－Ｋ’線に沿った断面図である。
　参照極１３２０は、基板１２００の第１面１２０２上に配置された参照極導電層１３２１と、参照極導電層１３２１上に配置された銀／塩化銀層１３２２とを含む。参照極１３２０は、好ましくは、図示するように銀／塩化銀層１３２２上に配置された参照極保護膜１３２６を更に含む。参照極導電層１３２１及び参照極保護膜１３２６の材料の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。参照極１３２０の参照極導電層１３２１に配線１００５が接続される（図２７及び図３１参照）。
　参照極１３２０が参照極保護膜１３２６を含むことにより次の効果が奏される。参照極保護膜１３２６は銀／塩化銀層１３２２からの銀の漏出を抑制する。また、参照極保護膜１３２６は多孔質であるため、液体試料Ｘ１が浸透することができる。このためセンサ１１０１を液体試料Ｘ１に浸漬したときに、参照極１３２０への液体試料Ｘ１の到達が容易であり、参照極１３２０への液体試料Ｘ１の浸漬阻害が生じにくい。
　絶縁層１０５０は、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において、参照極１３２０の少なくとも一部と重なる位置に形成された、厚さ方向Ｔ１に貫通した参照極開口部１５０２を備える。図示する例では参照極開口部１５０２内に、参照極導電層１３２１の一部と、銀／塩化銀層１３２２及び参照極保護膜１３２６が配置されている。参照極保護膜１３２６が参照極開口部１５０２の内に配置されていることにより、銀／塩化銀層１３２２からの銀の漏出が更に効果的に抑制される。銀／塩化銀層１３２２及び参照極保護膜１３２６のそれぞれの外周縁は、参照極開口部１５０２の内周縁により規定される。絶縁層１０５０の参照極開口部１５０２の内周縁の、厚さ方向Ｔ１からの平面視における形状は、図示する例では円形であるが、これには限定されず、多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。絶縁層１０５０の参照極開口部１５０２の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。
　図示する例では、絶縁層１０５０の参照極開口部１５０２は、第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２と、第２絶縁層１０５２の参照極第２開口部１５２２とにより構成される。参照極第１開口部１５１２は、第１絶縁層１０５１の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において参照極導電層１３２１の一部と重なる位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。参照極第２開口部１５２２は、第２絶縁層１０５２の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において第１絶縁層１０５１のうち参照極第１開口部１５１２の全体を内包する部分と重なる位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。参照極導電層１３２１の一部及び銀／塩化銀層１３２２は、第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２に配置されており、参照極第１開口部１５１２の内周縁により規定される外周縁を含む。参照極保護膜１３２６は、第２絶縁層１０５２の参照極第２開口部１５２２に配置されており、参照極第２開口部１５２２の内周縁により規定される外周縁を含む。第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２及び第２絶縁層１０５２の参照極第２開口部１５２２の内周縁の、厚さ方向Ｔ１からの平面視における形状は、図示する例ではそれぞれ円形であるが、これには限定されず、それぞれ多角形（四角形、三角形等）やその他の任意の形状であることができる。第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、２ｍｍ以下とすることができる。第２絶縁層１０５２の参照極第２開口部１５２２の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。
　続いてセンサ１１０１の対極１３３０について、図面、特に図３５を参照して説明する。図３５は、図３１のセンサ１１０１の対極１３３０を含む部分の、図３１のＬ－Ｌ’線に沿った断面図である。
　対極１３３０は、基板１２００の第１面１２０２上に配置される。図示する実施形態では、対極１３３０は全体が導電層からなる。対極のうち導電層の部分を特に指すために、「対極導電層」又は「対極の導電層」と称する場合がある。対極１３３０の材料の好ましい態様は、対極の導電層の材料として＜材料＞の欄に記載の通りである。対極１３３０に配線１００５が接続される（図２７及び図３１参照）。
　センサ１１０１では、絶縁層１０５０は、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において、対極１３３０の少なくとも一部と重なる位置に形成された、厚さ方向Ｔ１に貫通した対極開口部１５０３を備え、対極１３３０の上面１３３１は、対極開口部１５０３を通じて露出している。この構成を有するセンサ１１０１を液体試料Ｘ１に浸漬したとき、液体試料Ｘ１が絶縁層１０５０の対極開口部１５０３を通じて対極１３３０の上面１３３１に接触することができる。絶縁層１０５０の対極開口部１５０３の内周縁の、厚さ方向Ｔ１からの平面視における形状は、図示する例では四角形であるが、これには限定されず、円形、四角形以外の多角形（三角形等）やその他の任意の形状であることができる。絶縁層１０５０の対極開口部１５０３の開口幅（最も広い部分の幅）は特に限定されないが、例えば０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。図示する例では、対極１３３０の上面１３３１の一部が、対極開口部１５０３を通じて露出しているが、これには限定されない。例えば、対極開口部１５０３が対極１３３０の全体を内包する形状であり、対極１３３０の上面１３３１の全体が対極開口部１５０３を通じて露出していてもよい。
　図示する例では、絶縁層１０５０の対極開口部１５０３は、第１絶縁層１０５１の対極第１開口部１５１３と、第２絶縁層１０５２の対極第２開口部１５２３とにより構成される。対極第１開口部１５１３は、第１絶縁層１０５１の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において対極１３３０の一部と重なる位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。対極第２開口部１５２３は、第２絶縁層１０５２の、厚さ方向Ｔ１からの平面視において第１絶縁層１０５１の対極第１開口部１５１３と一致する位置に形成されており、厚さ方向Ｔ１に貫通する。第１絶縁層１０５１の対極第１開口部１５１３と、第２絶縁層１０５２の対極第２開口部１５２３とは一致していることは必須ではなく、少なくとも一部が重なっていればよい。第１絶縁層１０５１の対極第１開口部１５１３及び第２絶縁層１０５２の対極第２開口部１５２３の内周縁の形状及び開口幅は特に限定されず、例えばそれぞれが絶縁層１０５０の対極開口部１５０３に関して記載の範囲であることができる。
　続いてセンサ１１０１の先端開口部１０６１及び流路１０６２について、図面、特に図３１及び図３６を参照して説明する。図３６は、図３１のセンサ１１０１の対極１３３０、先端開口部１０６１及び流路１０６２を含む部分の、図３１のＭ－Ｍ’線に沿った断面図である。
　先端開口部１０６１は、絶縁層１０５０に形成されており、対極１３３０の上面１３３１と連通しており、基板１２００の先端部１２０１の側に開口する。流路１０６２は、絶縁層１０５０に形成されており、先端開口部１０６１と対極１３３０の上面１３３１とを接続する。流路１０６２は、先端開口部１０６１から対極１３３０の上面１３３１へと液体試料Ｘ１を導く。例えば流路１０６２は、毛細管現象により液体試料Ｘ１を先端開口部１０６１から対極１３３０の上面１３３１へと導くことができる。
　図３１及び図３６に示す実施形態のセンサ１１０１の先端開口部１０６１及び流路１０６２の機能を、図３９及び図４０を参照して説明する。図３９は、基板１２００の先端部１２０１から液体試料Ｘ１に浸漬した、先端開口部１０６１及び流路１０６２を備える本実施形態のセンサ１１０１の、図３６に相当する断面の模式図である。図４０は、液体試料Ｘ１に浸漬した、先端開口部１０６１及び流路１０６２を備えていないことを除いて本実施形態のセンサ１１０１と同じ構造の比較例のセンサ１１５０の断面の模式図である。
　図３９に示す通り、本実施形態のセンサ１１０１を基板１２００の先端部１２０１が下端となるように液体試料Ｘ１に浸漬したとき、液体試料Ｘ１は、先端開口部１０６１から流路１０６２を通じて対極１３３０の上面１３３１に導かれる。この結果、センサ１１０１の対極１３３０の上面１３３１が液体試料Ｘ１に十分に接触することができる。特に、液体試料Ｘ１の深さが十分でない場合であっても、センサ１１０１の対極１３３０の上面１３３１が液体試料Ｘ１に十分に接触することができるため好ましい。このため本実施形態のセンサ１１０１を用いることにより液体試料Ｘ１中の被検物質の測定精度が高まる。
　一方、図４０に示すように、絶縁層１０５０に先端開口部１０６１及び流路１０６２が形成されていない比較例のセンサ１１５０では、基板１２００の第１面１２０２の、対極１３３０と先端部１２０１との間の領域が絶縁層１０５０により被覆されている。この構造の比較例のセンサ１１５０を基板１２００の先端部１２０１が先端となるように液体試料Ｘ１に浸漬した場合、液体試料Ｘ１が、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の絶縁層１０５０による撥液により対極１３３０から遠ざけられ易い。このため比較例のセンサ１１５０では、対極１３３０と液体試料Ｘ１との接触が阻害され易く、液体試料Ｘ１中の被検物質の測定を正常に行うことができない場合がある。なかでも、対極１３３０がカーボン導電層である場合、対極１３３０の上面１３３１は撥水性が高いため、水を溶媒として含む液体試料Ｘ１の、対極１３３０の上面１３３１との接触は特に阻害され易い。比較例のセンサ１１５０のこの問題点を、絶縁層１０５０に先端開口部１０６１及び流路１０６２を形成した本実施形態のセンサ１１０１により解消することができる。
　図３１及び図３６に示す本実施形態のセンサ１１０１は、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において、絶縁層１０５０のうち、対極１３３０と、基板１２００の先端部１２０１との間の部分に形成された、先端開口部１０６１及び流路１０６２を備える。本実施形態のセンサ１１０１では、流路１０６２が、絶縁層１０５０の対極開口部１５０３と接続しており、対極１３３０の上面１３３１は対極開口部１５０３を通じて露出しているため、液体試料Ｘ１への浸漬時に、対極１３３０の上面１３３１が液体試料Ｘ１に接触する効果が特に高い。
　図３１及び図３６に示すセンサ１１０１の先端開口部１０６１及び流路１０６２は、基板１２００が存在する側が閉じ、絶縁層１０５０の上面１０５３の側が開放された、絶縁層１０５０に形成された凹部であるがこの態様には限定されない。例えば図３７に示す別の実施形態に係るセンサ１１０１’のように、先端開口部１０６１及び流路１０６２が、絶縁層１０５０の上面１０５３を含まない厚さ方向の一部に形成されており、対極１３３０から基板１２００の先端部１２０１に至る方向（図３１のＭ－Ｍ’方向）から見たときに先端開口部１０６１及び流路１０６２の周囲が囲われた構造を有していてもよい。
　図３１及び図３６に示すセンサ１１０１が備える流路１０６２は、先端開口部１０６１に向かって流路幅Ｗ（図３１参照）を拡張する拡張部１０６２Ａを有している。流路１０６２が拡張部１０６２Ａを有することにより、センサ１１０１を液体試料Ｘ１に浸漬したときの、先端開口部１０６１から対極１３３０の上面１３３１への液体試料Ｘ１の移動が促進される。ここで流路幅Ｗは、センサ１１０１の、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において、対極１３３０から基板１２００の先端部１２０１に至る方向（図３１のＭ－Ｍ’方向）に直交する方向（図３１のＬ－Ｌ’方向）での、流路１０６２の幅を指す。
　図３１及び図３６に示すセンサ１１０１では、絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２上に配置された第１絶縁層１０５１と、第１絶縁層１０５１上に配置された第２絶縁層１０５２とを含み、第２絶縁層１０５２に先端開口部１０６１及び流路１０６２が形成されている。本実施形態のセンサ１１０１の特に好ましい態様では、第１絶縁層１０５１が、絶縁性の硬化樹脂を含み、第２絶縁層１０５２が、絶縁シートを含む。絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１は、硬化性樹脂組成物を、基板１２００の第１面１２０２に塗布し、塗膜に活性エネルギー線を照射して硬化させることにより形成できる。絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１上に結合層を介して絶縁シートを貼付することにより形成できる。絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２を形成後に、絶縁シートのうち、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分を剥離することにより第２絶縁層１０５２に先端開口部１０６１及び流路１０６２を形成することができる。或いは、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分に予め切り欠きを有する絶縁シートを、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１上に結合層を介して貼付することにより、先端開口部１０６１及び流路１０６２が形成された絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２を形成することができる。
　図３２及び図３８に示す更に別の実施形態のセンサ１１０１’’では、図３１及び図３６に示すセンサ１１０１において、先端開口部１０６１及び流路１０６２が、第１絶縁層１０５１にも更に形成されている。図３２及び図３８に示すセンサ１１０１’’は、図３１及び図３６に示すセンサ１１０１において、第１絶縁層１０５１の、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分１５１５（図３６参照）に先端開口部１０６１及び流路１０６２が更に形成されたものである。図３２及び図３８に示すセンサ１１０１’’は、基板１２００の第１面１２０２上の対極１３３０と先端部１２０１との間に絶縁層を含まないため、センサ１１０１’’を液体試料Ｘ１に浸漬するときの液体試料Ｘ１と対極１３３０との接触が更に促進され、液体試料Ｘ１中の被検物質を更に高精度に検出することができる。図３２及び図３８に示すセンサ１１０１’’の特に好ましい態様は、第１絶縁層１０５１が絶縁性の硬化樹脂を含む層であり、第２絶縁層１０５２が絶縁シートを含む層である。この特に好ましい態様に係るセンサ１１０１’’は、前段落で説明した手順により、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１と、絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２とを含む絶縁層１０５０を備えるセンサ１１０１を製造した後に、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１の前記部分１５１５（図３６参照）を剥離することによって製造することができる。或いは、基板１２００の第１面１２０２上で硬化性樹脂組成物を硬化して絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１を形成する際に、前記部分１５１５を欠いた第１絶縁層１０５１を形成し、その上に第２絶縁層１０５２を形成することによりセンサ１１０１’’を製造することもできる。
＜センサ１１０１の製造方法＞
　第２の開示の図３１に示す実施形態のセンサ１１０１の製造方法の一例について、図面、特に図２７～図３１を参照して説明する。
　まず図２７に示すように、絶縁性の基板１２００の第１面１２０２上に、作用極導電層１３１１，１３１１、参照極導電層１３２１及び対極１３３０（対極導電層）、並びに、それらの各々に電気的に接続された配線１００５を配置する。
　続いて図２８に示すように、作用極導電層１３１１，１３１１、参照極導電層１３２１、対極１３３０及び配線１００５が配置された基板１２００の第１面１２０２上に、第１絶縁層１０５１を積層する。第１絶縁層１０５１は、作用極導電層１３１１，１３１１の一部と重なる位置に作用極第１開口部１５１１，１５１１、参照極導電層１３２１の一部と重なる位置に参照極第１開口部１５１２、対極１３３０の一部と重なる位置に対極第１開口部１５１３を有する。
　上記の通り、本実施形態のセンサ１１０１の特に好ましい態様では、第１絶縁層１０５１は、絶縁性の硬化樹脂を含む。絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１は、硬化性樹脂組成物を、基板１２００の第１面１２０２に塗布し、塗膜に活性エネルギー線を照射して硬化することにより形成することができる。
　続いて図２９に示すように、図２８の基板１２００の第１絶縁層１０５１上に、第２絶縁層１０５２を更に積層する。第２絶縁層１０５２は、第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１，１５１１と重なる位置に作用極第１開口部１５１１，１５１１の全体を内包する形状の作用極第２開口部１５２１，１５２１、参照極第１開口部１５１２と重なる位置に参照極第１開口部１５１２の全体を内包する形状の参照極第２開口部１５２２、対極第１開口部１５１３と重なる位置に対極第１開口部１５１３と一致する形状の対極第２開口部１５２３を有する。第２絶縁層１０５２は更に、基板１２００の厚さ方向Ｔ１からの平面視において対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分に、先端開口部１０６１及び流路１０６２を有する。
　上記の通り、本実施形態のセンサ１１０１の特に好ましい態様では、第２絶縁層１０５２は、絶縁シートを含む。絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は、更に、絶縁シートの一方の面上に配置された粘着剤又は接着剤を含む結合層を含むことができる。絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は、第１絶縁層１０５１上に結合層を介して絶縁シートを貼付することにより形成することができる。
　続いて図３０に示すように、第１絶縁層１０５１の作用極第１開口部１５１１，１５１１内に、試薬層１３１５を配置し、第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２内に、銀／塩化銀層１３２２を配置する。
　続いて図３１に示すように、第２絶縁層１０５２の作用極第２開口部１５２１，１５２１内に、作用極保護膜１３１６，１３１６を配置して作用極１３１０，１３１０を形成し、第２絶縁層１０５２の参照極第２開口部１５２２内に参照極保護膜１３２６を配置して参照極１３２０を形成する。なお図３０と図３１の各層の形成の順序は特に限定されず別の順序で行ってもよい。
＜センサ１１０１の更なる実施形態＞
　第２の開示のセンサ１１０１の更なる好ましい実施形態を図４１～図４７を参照して説明する。
　図４１に示す実施形態に係るセンサ１１０１において、基板１２００は、
　先端部１２０１と、先端部１２０１と反対側の第１端部１２１１とを含み、検出電極１３００が配置された本体部１２１０と、
　本体部１２１０の第１端部１２１１に接続された第２端部１２２２と、第２端部１２２２と反対側の第３端部１２２３とを含み、第２端部１２２２から第３端部１２２３まで延在する接続部１２２０と、
　接続部１２２０の第３端部１２２３に接続された第４端部１２３４を含む基端部１２３０と
を含み、
　基板１２００の接続部１２２０は、第３端部１２２３の付近に、基板１２００の第１面１２０２の側が突出するように基板１２００を折り曲げる折り曲げ部１２２５を含む。
　なお図４１、図４２、図４６及び図４７では基板１２００を、折り曲げ部１２２５で折り曲げる前のセンサ１１０１の平面図を示している。
　図４１に示すように、配線１００５は、基板１２００の第１面１２０２上に、本体部１２１０から接続部１２２０を経由して基端部１２３０まで配置されていることが好ましい。図４１に示すように、基端部１２３０の第１面１２０２上に端子１００６が配置されており、配線１００５はそれぞれ、本体部１２１０の第１面１２０２上の検出電極１３００の１つと、基端部１２３０の第１面１２０２上の端子１００６の１つとを電気的に接続することが好ましい。
　図４１に示すセンサ１１０１の基板１２００は、検出電極１３００等が配置された第１面１２０２の側が突出するように、折り曲げ部１２２５において折り曲げられる。折り曲げ部１２２５で折り曲げられた基板１２００は、基端部１２３０に対して、本体部１２１０と、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分とが突出した形状を有する。好ましくは、図４３及び図４４に示すように、基板１２００の基端部１２３０に対して、基板１２００の本体部１２１０と、接続部１２２０の折り曲げ部２１２５よりも第２端部１２２２側の部分とが略垂直に突出した形状を有する。
　接続部１２２０の折り曲げ部１２２５において折り曲げられた基板１２００を備える図４１に示すセンサ１１０１は、図４３及び図４４に示すように、基板１２００の基端部１２３０を傾斜させなくとも（例えば、図４３及び図４４に示すように基板１２００の基端部１２３０を水平方向に保持した状態で）、検出電極１３００が配置された基板１２００の本体部１２１０を、先端部１２０１が下端となるように配向させ、被検物質の測定のために液体試料Ｘ１に浸漬することが可能である。
　図４１に示すセンサ１１０１は、図４２に示すように、複数連結し一体化して多連式センサ１１０５として用いることができる。図４２に示す多連式センサ１１０５は、４つのセンサ１１０１の、基板１２００の基端部１２３０が一体化されたものである。
　図４１に示すセンサ１１０１では、絶縁層１０５０が、基板１２００の第１面１２０２のうち、本体部１２１０、及び、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分の領域に配置された、第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２を含む。ここで、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分とは、接続部１２２０のうち、折り曲げ部１２２５の第２端部１２２２側の端から、第２端部１２２２までの部分である。図４１に示すセンサ１１０１では、絶縁層１０５０は更に、基板１２００の第１面１２０２の全体に形成された絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１を含む。第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は、第１絶縁シートに加えて、粘着剤又は接着剤を含む結合層（図示せず）を含み、結合層の側から第１絶縁層１０５１を介して基板１２００の第１面１２０２の上記領域に貼付されている。図４１に示すセンサ１１０１は、液体試料Ｘ１に浸漬される部分が、第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２により一体に覆われているため、検出電極１３００及び配線１００５の間の必要な絶縁が達成されており、且つ、第２絶縁層１０５２の第１絶縁シートに先端開口部１０６１及び流路１０６２を形成することが容易であるため好ましい。
　図４１に示すセンサ１１０１の、絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２のうち、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上に、絶縁シートを含まない非絶縁領域１０５５を含む。この構成により奏される効果を図４４及び図４５を参照して説明する。
　図４４は、基板１２００の先端部１２０１を含む本体部１２１０を液体試料Ｘ１に浸漬した、図４１に示すセンサ１１０１の、側方からの模式図である。図４４に示すように、センサ１１０１は、基板１２００が、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５において、第１面１２０２の側が突出し、基端部１２３０に対して、本体部１２１０及び接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分が略垂直となるように折り曲げられている。図４１及び図４４に示すセンサ１１０１において、絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２の全体を覆う絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１と、第１絶縁層１０５１を介して、基板１２００の第１面１２０２のうち、本体部１２１０、及び、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分の領域を覆う、第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２とを含む。絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２のうち、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上に、絶縁シートを含まず、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１を含む非絶縁領域１０５５を含む。本実施形態において第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は平坦であり変形していない。このため基板１２００は、第１絶縁シートを変形した後に起こる収縮又は伸長の影響を受けず、本体部１２１０及び接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分は平坦な形状に保持される。この結果、図４４に示すように、センサ１１０１の基板１２００の本体部１２１０は、液体試料Ｘ１中で、先端部１２０１を下端とした垂直な姿勢で保持され、検出電極１３００による被検物質の測定を正常に行うことができる。
　一方、図４５は、第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２が、基板１２００の第１面１２０２の、折り曲げ部１２２５上の領域を含む全体に形成された以外は図４１及び図４４に示すセンサ１１０１と同じ構造を有する比較例のセンサ１１５１を示す。比較例のセンサ１１５１では、基板１２００の第１面１２０２上の絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は、基板１２００の折り曲げ部１２２５での折り曲げにより伸長される。伸長した絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２は収縮しようとするため、基板１２００の本体部１２１０及び接続部１２２０に図４５に示すような反りが発生する。反りが発生した基板１２００の本体部１２１０は、検出電極１３００が配置された第１面１２０２の側が上方を向いて傾斜する。このため、図４５に示すように液体試料Ｘ１と、本体部１２１０の第１面１２０２上の検出電極１３００との接触が阻害され、検出電極１３００による被検物質の測定の精度が低下する。図４１及び図４４に示すセンサ１１０１は、絶縁層１０５０が、基板１２００の第１面１２０２の折り曲げ部１２２５上の領域に非絶縁領域１０５５を含むことにより、比較例のセンサ１１５１のこの問題点を解消する。
　図４１及び４４に示すセンサ１１０１の更に別の実施形態を、図４６に基づいて説明する。図４６に示すセンサ１１０１は、絶縁層１０５０が、基板１２００の第１面１２０２のうち、本体部１２１０、及び、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分の領域上に配置された、第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ａと、基板１２００の第１面１２０２のうち、基端部１２３０の領域上に配置された、第２絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ｂとを含む。ここで、第２絶縁層１０５２ａの第１絶縁シートと、第２絶縁層１０５２ｂの第２絶縁シートとは、基板１２００の第１面１２０２のうち、接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上において分離されている。図４６に示すセンサ１１０１において、絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２の全体に形成された絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層１０５１を更に含む。絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２のうち接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上に、絶縁シートを含まず第１絶縁層１０５１を含む非絶縁領域１０５５を含む。第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ａ及び第２絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ｂは、それぞれ、第１絶縁層１０５１上から基板１２００の第１面１２０２の上記領域に配置されている。この実施形態によれば、センサ１１０１の基板１２００の反りによる検出精度の低下を抑制できるとともに、基板１２００の基端部１２３０上の配線１００５及び端子１００６の間の絶縁性を高めることができる。
　図４６に示すセンサ１１０１の更に別の実施形態を、図４７に基づいて説明する。図４７に示すセンサ１１０１では、第２絶縁層１０５２ａの第１絶縁シートと、第２絶縁層１０５２ｂの第２絶縁シートとが、基板１２００の第１面１２０２のうち接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上において、接続部１２２０が延在する方向と交差する方向に形成された切り込み部１０５６を介して分離されている。本実施形態では、絶縁層１０５０は、基板１２００の第１面１２０２のうち接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の領域上に、切り込み部１０５６を介して第２絶縁層１０５２ａ，１０５２ｂと分離された、複数の第３絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ｃを含む。この実施形態によれば、センサ１１０１の基板１２００の反りによる検出精度の低下を抑制できるとともに、基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５上の配線１００５の間の絶縁性を高めることができる。
＜センサユニット９００＞
　センサユニット９００について図５１、図５２及び図５３を参照して説明する。
　図示するセンサユニット９００は、２４ウェルプレート９２５の各ウェルに対して、センサ１１０１の検出電極１３００を含む基板１２００の本体部１２１０を位置決めするために用いられる。
　センサユニット９００は、図５１に示すように、下方から順に配置された、下方支持プレート９５７、６セットの多連式センサ１１０５（図４２参照）、添加剤を供給するためのポート９６１が取り付けられた上方支持プレート９５９、及び、ガスケットシート９６０を備える。
　本実施形態では、多連式センサ１１０５は、図４２に示す、４つのセンサ１１０１が、基板１２００の基端部１２３０において連結されて一体化されたものである。４つのセンサ１１０１の各々は、基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５において、基板１２００の第１面１２０２の側が突出し、基端部１２３０に対し、本体部１２１０及び接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも第２端部１２２２側の部分が垂直となるように折り曲げられている。図５１に示すように、４つのセンサ１１０１を備える多連式センサ１１０５は、６セット分、下方支持プレート９５７に取り付けられる。
　下方支持プレート９５７は、６セットの多連式センサ１１０５に含まれる２４のセンサ１１０１のそれぞれの基板１２００の本体部１２１０及び接続部１２２０に対応する位置に貫通孔９５７ｂを備える。下方支持プレート９５７の貫通孔９５７ｂのそれぞれに、２４のセンサ１１０１のそれぞれの基板１２００の本体部１２１０及び接続部１２２０が挿入される。センサ１１０１が下方支持プレート９５７の貫通孔９５７ｂに挿入されると、図５２に示すように、下方支持プレート９５７の上面と、センサ１１０１の基板１２００の基端部１２３０の下面とが係合した状態となる。また、下方支持プレート９５７の貫通孔９５７ｂの内周壁のうち、センサ１１０１の基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５の内側と係合する部分に、基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５を下方から支持する第１係合部９５７ｄが設けられている。
　一方、上方支持プレート９５９の下側面には、下方支持プレート９５７の２４の貫通孔９５７ｂの各々に挿入されるピン状の第２係合部９５９ａが設けられている。
　６つの多連式センサ１１０５を、下方支持プレート９５７と上方支持プレート９５９との間に挟んで組み合わせると、図５２に示すように、下方支持プレート９５７の第１係合部９５７ｄの上面と、上方支持プレート９５９の第２係合部９５９ａの下面とにより、センサ１１０１の基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５が係合されて支持される。図５２に示すように、下方支持プレート９５７の第１係合部９５７ｄは、上面に湾曲した面を含む上面湾曲部形状を有している。また、上方支持プレート９５９の第２係合部９５９ａは、下面に湾曲した面を含む下面湾曲部形状を有している。この構成により、センサ１１０１は、基板１２００の先端部１２０１が下端となり、基板１２００の本体部１２１０及び接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも先端側の部分が垂直となるように支持される。この結果、ウェルプレートの各ウェル内に収容された液体試料に対する、センサ１１０１の基板１２００の本体部１２１０の姿勢を安定化することができ、センサ１１０１による検出の精度を高めることができる。
　最後に、図５１に示すように、上方支持プレート９５９の上面に貫通孔を有するガスケットシート９６０を重ねて配置して、センサユニット９００を完成させる。
　センサユニット９００は他の部材と組み合わせてアダプタユニット９２０を構成することができる。アダプタユニット９２０は、図５３に示すように、最下段から、アダプタボトム（培養容器設置部）９２４、ウェルプレート（培養容器）９２５、アダプタトップ９２６、センサユニット９００がこの順に載置されている。
　本実施形態において、ウェルプレート９２５は４×６の２４個のウェルを有している。
　アダプタトップ９２６は、ウェルプレート９２５の高さを調整するために設けられており、ウェルプレート９２５の高さに応じて、異なるアダプタトップ９２６が使用される。これは、アダプタトップ９２６の上にセンサユニット９００が載置された際に、センサユニット９００とウェルプレート９２５との高さ関係を調整するためである。
　ウェルプレート９２５は、汎用品も含めていくつかの種類を有しており、その種類に応じてアダプタトップ９２６が使い分けられる。
　アダプタトップ９２６上に配置されたセンサユニット９００は、その下面側に設けられた４本の脚部（支持体）９４０が、下方のアダプタトップ９２６の貫通孔９４１を通って、培養容器設置部としてのアダプタボトム９２４に設けられた位置決め穴９４２内に挿入される。
　こうして形成された、センサユニット９００及びウェルプレート９２５を備えたアダプタユニット９２０では、センサ１１０１の検出電極１３００を含む基板１２００の本体部１２１０が、ウェルプレート９２５の各ウェル内で安定した姿勢で保持されている。
　図示しないが、アダプタユニット９２０において、センサユニット９００に含まれるセンサ１１０１の基板１２００の基端部１２３０上の端子１００６は、センサユニット９００のガスケットシート９６０の貫通孔を通じて、外部の分析ユニット１１０２の電気化学測定部１１１１（図４８参照）と、電気的に接続することができる。すなわち、センサユニット９００を備えるアダプタユニット９２０は、外部の分析ユニット１１０２及び制御ユニット１１０４と組み合わせることで、図４８に示す分析装置１１００を構成することができる。
＜第２の開示の実施例＞
　第２の開示の実施例または比較例として、以下の５つのセンサを作成した。なお以下の実験で用いたセンサＳ１～Ｓ５には、作用極１３１０，１３１０の試薬層１３１５，１３１５及び作用極保護膜１３１６，１３１６、並びに、参照極１３２０の参照極保護膜１３２６は設けていない。
センサＳ１
　センサＳ１は図４９Ａに示す構造の比較例である。センサＳ１は、基板１２００の第１面１２０２の全体に第１絶縁層１０５１と絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２が積層されている。センサＳ１では先端開口部１０６１及び流路１０６２が形成されておらず、基板１２００の第１面１２０２の、対極１３３０と先端部１２０１との間の部分も、第１絶縁層１０５１及び第２絶縁層１０５２を含む絶縁層１０５０により被覆されている。すなわち、センサＳ１は、基板１２００の反りを防止するための絶縁層１０５０の非絶縁領域１０５５、並びに、対極１３３０の上面１３３１へ液体試料を導くための先端開口部１０６１及び流路１０６２を有さない。
センサＳ２
　センサＳ２は図４９Ｂに示す構造の比較例である。センサＳ２は、センサＳ１における全体を覆う第２絶縁層１０５２の代わりに、基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも先端側の部分に配置された第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ａと、基板１２００の基端部１２３０に配置された第２絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ｂとを配置し、基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５上に第１絶縁層１０５１を含み絶縁シートを含まない非絶縁領域１０５５を配置したものである。すなわち、センサＳ２は、基板１２００の反りを防止するための絶縁層１０５０の非絶縁領域１０５５を有するが、対極１３３０の上面１３３１へ液体試料を導くための先端開口部１０６１及び流路１０６２を有さない。
センサＳ３
　センサＳ３は図４９Ｃに示す構造のセンサ１１０１の実施例である。センサＳ３は図４６に示すセンサ１１０１と同様に、基板１２００の反りを防止するための絶縁層１０５０の非絶縁領域１０５５と、第２絶縁層１０５２のみに形成された先端開口部１０６１及び流路１０６２（図３６参照）を有する。
センサＳ４
　センサＳ４は図４９Ｄに示す構造のセンサ１１０１の実施例である。センサＳ４は、センサＳ３において、絶縁層１０５０の第１絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ａ及び第２絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２ｂを、基板１２００の第１面１２０２の全体を覆う一体の絶縁シートを含む第２絶縁層１０５２に置換し、且つ、第１絶縁層１０５１の、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分１５１５（図３６、図４９Ｃ参照）を剥離して先端開口部１０６１及び流路１０６２としたものである。すなわち、センサＳ４は、基板１２００の反りを防止するための絶縁層１０５０の非絶縁領域１０５５を有さず、第１絶縁層１０５１及び第２絶縁層１０５２に形成された先端開口部１０６１及び流路１０６２（図３８参照）を有する。
センサＳ５
　センサＳ５は図４９Ｅに示す構造のセンサ１１０１の実施例である。センサＳ５は、センサＳ３において、第１絶縁層１０５１の、対極１３３０と基板１２００の先端部１２０１との間の部分１５１５（図３６、図４９Ｃ参照）を剥離して先端開口部１０６１及び流路１０６２としたものである。すなわち、センサＳ５は、基板１２００の反りを防止するための絶縁層１０５０の非絶縁領域１０５５と、第１絶縁層１０５１及び第２絶縁層１０５２に形成された先端開口部１０６１及び流路１０６２（図３８参照）を有する。
　上記の５つのセンサの製造に使用した材料を示す。
（基板）
　絶縁性の基板として、図４９Ａ～図４９Ｅ等に示す形状の、本体部１２１０、接続部１２２０及び基端部１２３０を含む、ポリエチレンテレフタレートからなる厚さ１８８μｍの基板１２００を用いた。
　基板１２００の本体部１２１０は、横幅１１ｍｍ、縦幅４．２ｍｍの長方形とした。
　絶縁層１０５０を積層してセンサを完成後に基板１２００の接続部１２２０の折り曲げ部１２２５において、第１面１２０２の側に突出し、本体部１２１０及び接続部１２２０の折り曲げ部１２２５よりも先端側の部分が、基端部１２３０に対して垂直になるように折り曲げた。
（導電層）
　基板１２００の第１面１２０２上に、カーボンペーストを適用し加熱して得られる厚さ５μｍのカーボン導電層により、図２７及び図４６に図示する形状の、作用極導電層１３１１，１３１１、参照極導電層１３２１、対極（対極導電層）１３３０、配線１００５及び端子１００６を形成した。
（第１絶縁層）
　カーボン導電層が配置された基板１２００の第１面１２０２上に、図２８に示すようにフッ素樹脂からなる、基板１２００の第１面１２０２及びカーボン導電層を覆う、カーボン導電層上の部分の厚さが５μｍの第１絶縁層１０５１を積層した。第１絶縁層１０５１は、活性エネルギー線照射により硬化して絶縁性の硬化樹脂を生じる硬化性樹脂組成物（ネガ型レジスト組成物）を塗布し、塗膜に活性エネルギー線を照射することにより形成した。適宜マスキングを施し、第１絶縁層１０５１に、作用極第１開口部１５１１，１５１１、参照極第１開口部１５１２、対極第１開口部１５１３を形成した。
　第１絶縁層１０５１の参照極第１開口部１５１２内に銀／塩化銀層１３２２を配置した。
（第２絶縁層）
　カーボン導電層及び第１絶縁層１０５１が配置された基板１２００の第１面１２０２上の所定の領域に第２絶縁層１０５２を配置した。表面が撥水処理された厚さ５０μｍのポリエチレンテレフタレートシート（絶縁シート）と、厚さ１０μｍの粘着剤を含む結合層との積層体である第２絶縁層１０５２を、結合層を介して、基板１２００の第１面１２０２上に配置された第１絶縁層１０５１上の所定の領域に貼付した。
　作用極第２開口部１５２１，１５２１及び参照極第２開口部１５２２はそれぞれ直径２．０ｍｍの円形とした。対極第２開口部１５２３は、本体部１２１０の横方向の幅が２．１ｍｍ、縦方向の幅が１．８ｍｍの長方形とした。
　以下の実験では、作用極１３１０，１３１０の試薬層１３１５，１３１５及び作用極保護膜１３１６，１３１６、及び参照極１３２０の参照極保護膜１３２６を設けていないセンサＳ１～Ｓ５を用いた。
　各々が深さ１７．４０ｍｍ、ウェル底直径１６．２６ｍｍ、ウェル直径１５．６２ｍｍの円筒型のウェルを有する２４ウェルプレートを用意した。２４ウェルプレートの各ウェルに、５００μＭのアスコルビン酸を添加したＲＰＭＩ培地（以下「液体試料Ｘ１」とする）を、０．８５ｍＬ、０．９４ｍＬ、１．０ｍＬ又は１．２ｍＬ加えた。
　センサＳ１～Ｓ５を、図４３～４５に示すように基板１２００の基端部１２３０を第１面１２０２が上方を向くように水平に保持し、基板１２００の本体部１２１０を先端部１２０１が下端となるようにウェル内の各量の液体試料Ｘ１中に浸漬した。
　センサＳ１～Ｓ５のそれぞれの作用極１３１０，１３１０（ただし試薬層及び保護膜を含まない）の、参照極１３２０（ただし保護膜を含まない）に対する電圧差を５００ｍＶとなるようにポテンショスタットにより制御し、２つの作用極１３１０，１３１０のそれぞれと対極１３３０との間の電流値を経時的に０．７時間後まで測定した。また、対極１３３０に液体試料Ｘ１が接触しているかどうかを確認するため、対極１３３０の電圧を経時的に測定した。
　検出電極１３００の各々と液体試料Ｘ１との接触を促進するために、測定開始後一定時間経過後に２４ウェルプレートを振動させながら測定を行った。
　センサＳ１～Ｓ５の各々について、４つの容量の液体試料の各々を用いた場合の２つの作用極１３１０，１３１０の電流値の測定結果を図５０に示す。図５０Ａは、センサＳ１の結果を示し、図５０ＢはセンサＳ２の結果を示し、図５０ＣはセンサＳ３の結果を示し、図５０ＤはセンサＳ４の結果を示し、図５０ＥはセンサＳ５の結果を示す。
　比較例のセンサＳ１（図４９Ａ参照）は、振動を加えない場合、すべての容量の液体試料Ｘ１中で作用極の電流値が底打ちし正常な電流値が測定されなかった。振動を加えた場合に、１．２ｍＬ、１．０ｍＬ及び０．９４ｍＬの液体試料Ｘ１中で作用極に正常な電流値が測定されたが、０．８５ｍＬの液体試料Ｘ１中では作用極の電流値が底打ちし正常な測定ができなかった。
　比較例のセンサＳ２（図４９Ｂ参照）は、振動を加えない場合、１．２ｍＬ、１．０ｍＬ及び０．８５ｍＬの液体試料Ｘ１中で作用極の電流値が底打ちし正常な電流値が測定なかったが、０．９４ｍＬの液体試料Ｘ１中では作用極に正常な電流値が測定された。振動を加えた場合に、すべての容量の液体試料Ｘ１中で作用極に正常な電流値が測定された。
　実施例のセンサＳ３（図４９Ｃ参照）は、振動を加えない場合と振動を加えた場合のどちらも、すべての容量の液体試料Ｘ１中で作用極に正常な電流値が測定された。
　実施例のセンサＳ４（図４９Ｄ参照）は、振動を加えない場合、１．２ｍＬ、１．０ｍＬ及び０．９４ｍＬの液体試料Ｘ１中で作用極に正常な電流値が測定され、０．８５ｍＬの液体試料中では作用極の電流値が底打ちし正常な測定ができなかった。振動を加えた場合は、どの容量の液体試料Ｘ１中でも作用極に正常な電流値が測定された。
　実施例のセンサＳ５（図４９Ｅ参照）は、振動を加えない場合と振動を加えた場合のどちらも、すべての容量の液体試料Ｘ１中で作用極に正常な電流値が測定された。
　上記の結果を下記表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　どのセンサを用いた場合でも、作用極の電流値が底打ちし正常な測定ができていないときは、対極の電圧値も底打ちしており、作用極の電流値が正常なときは、対極の電圧値も正常であることが確認された（データは不図示）。このことは、センサによる正常な測定のためには対極と液体試料とを十分に接触させることが必要であることを示す。そして、上記の電流値の測定結果から、絶縁層に先端開口部及び流路を形成することにより対極の上面へ液体試料を導くことができ対極と液体試料との接触阻害を抑制できること、並びに、基材の反りを抑制することにより接触阻害が更に抑制できることが確認された。
＜第２の開示に関する付記＞
　細胞培養液を分析するためのセンサを備える従来の細胞培養分析装置の構成では、基体に設けられた貫通孔部分にセンサが固定されるとともに、このセンサには、信号を取り出すためのリード線が接続されていた。
　例えば、特許文献２（米国特許第９１７０２５５号明細書）には、複数の細胞培養容器が設けられたプレートと嵌合するカートリッジを有する細胞培養分析装置について開示されている。
　特許文献２の細胞培養分析装置は、それぞれの培養容器内を計測するセンサを有しており、これらのセンサを挿入する複数の開口がカートリッジに設けられ、それぞれの開口内でセンサとファイバーケーブルとが接続されている。そして、これら複数のファイバーケーブルが、外部の制御部に接続されている。
　特許文献２に記載の上記の細胞培養分析装置のセンサは、以下に示すような問題点を有している。
　すなわち、特許文献２に開示された細胞培養分析装置では、複数の培養容器にそれぞれ挿入される各センサの培養容器に対する正確な位置決めを行うことが困難であった。
　このため、培養容器に入れられた培地へのセンサの浸漬深さ等にばらつきが生じ、測定精度が低下するおそれがあった。特に、培地へのセンサの浸漬深さが十分でない場合、センサの検出電極に液体試料が十分に接触せず、測定精度が低下するおそれがあった。
　第２の開示の課題は、液体試料中にセンサを浸漬した場合の、センサの検出電極への液体試料の接触阻害が抑制されたセンサ及びそれを備えるセンサユニットを提供することにある。
　そこで本明細書では、第２の開示として、以下の付記１～１１のいずれかに記載のセンサ及びセンサユニットを開示する。
（付記１）
　液体試料に浸漬された状態で使用されるセンサであって、
　前記液体試料に浸漬される先端部を含む絶縁性の基板と、
　前記基板の第１面における前記先端部の付近に配置され、作用極、対極及び参照極を含む検出電極と、
　前記基板の前記第１面に配置され、前記検出電極と接続された配線と、
　前記基板の前記第１面に配置され、前記検出電極及び前記配線の少なくとも一部を覆うように形成された絶縁層と、
　前記絶縁層に形成された、前記対極の上面に連通しており、前記基板の前記先端部の側に開口する先端開口部と、
　前記絶縁層に形成された、前記先端開口部と前記対極の前記上面とを接続する、前記液体試料を前記先端開口部から前記対極の前記上面へと導く流路と
を備えたセンサ。
（付記２）
　前記絶縁層は、前記基板の厚さ方向からの平面視において前記対極と重なる位置に形成された、前記厚さ方向に貫通した対極開口部を備え、
　前記対極の前記上面は、前記対極開口部を通じて露出している、
付記１に記載のセンサ。
（付記３）
　前記絶縁層は、前記基板の厚さ方向からの平面視において
　前記作用極と重なる位置に形成された、前記厚さ方向に貫通した作用極開口部と、
　前記参照極と重なる位置に形成された、前記厚さ方向に貫通した参照極開口部と
を備え、
　前記作用極は、前記作用極開口部内に配置された作用極保護膜を含み、
　前記参照極は、前記参照極開口部内に配置された参照極保護膜を含む、
付記１又は２に記載のセンサ。
（付記４）
　前記絶縁層は、
　前記基板の前記第１面に配置された、絶縁性の硬化樹脂を含む第１絶縁層と、
　前記第１絶縁層上に配置された、絶縁シートを含む第２絶縁層と
を含み、
　前記先端開口部及び前記流路は、前記第２絶縁層に形成されている、
付記１～３のいずれか１つに記載のセンサ。
（付記５）
　前記先端開口部及び前記流路は、更に前記第１絶縁層に形成されている、
付記４に記載のセンサ。
（付記６）
　前記流路は、前記先端開口部に向かって流路幅を拡張する拡張部を有している、付記１～５のいずれか１つに記載のセンサ。
（付記７）
　前記基板は、
　前記先端部と、前記先端部と反対側の第１端部とを含み、前記検出電極が配置された本体部と、
　前記本体部の前記第１端部に接続された第２端部と、前記第２端部と反対側の第３端部とを含み、前記第２端部から前記第３端部まで延在する接続部と、
　前記接続部の前記第３端部に接続された第４端部を含む基端部と
を含み、
　前記基板の前記接続部は、前記第３端部の付近に、前記第１面の側が突出するように前記基板を折り曲げる折り曲げ部を含む、
付記１～６のいずれか１つに記載のセンサ。
（付記８）
　前記絶縁層は、前記基板の前記第１面のうち、前記本体部、及び、前記接続部の、前記折り曲げ部よりも前記第２端部側の部分の領域上に配置された、第１絶縁シートを含む、
付記７に記載のセンサ。
（付記９）
　前記絶縁層は、前記基板の前記第１面のうち、前記接続部の前記折り曲げ部の領域上に、絶縁シートを含まない非絶縁領域を有している、
付記８に記載のセンサ。
（付記１０）
　前記絶縁層は、前記基板の前記第１面のうち、前記基端部の領域上に配置された第２絶縁シートを更に含み、
　前記第１絶縁シートと前記第２絶縁シートとは、前記基板の前記第１面のうち、前記接続部の前記折り曲げ部の領域上において分離されている、
付記８又は９に記載のセンサ。
（付記１１）
　付記１～１０のいずれか１項に記載のセンサ、及び、
　前記センサの前記基板と係合して、前記基板の前記先端部が下端となるように前記センサを支持する係合部を備える支持部材
を備えるセンサユニット。
＜第３の開示の実施形態＞
　以下、第３の開示に係るセンサの実施形態について説明する。本実施形態では、必要以上に詳細な説明は省略する場合がある。例えば、既によく知られた事項の詳細説明や実質的に同一の構成に対する重複説明を省略する場合がある。これは、以下の説明が不必要に冗長になるのを避け、当業者の理解を容易にするためである。なお、第３の開示に係るセンサにおける構成のうち、第１の開示に係るセンサにおける構成と同じ符号を付したものについては、第１の開示に係るセンサにおける対応する構成の説明を参照することができる。
　また、出願人は、当業者が第３の開示を十分に理解するために添付図面及び以下の説明を提供するのであって、これらによって下記の「第３の開示に関する付記」に記載の事項を限定することを意図するものではない。
＜材料＞
　本明細書の第３の開示のセンサに用いることができる材料の例について説明する。
　本明細書の第３の開示のセンサが絶縁性の基板を備える場合、その材料は特に限定されないが、例えば、本明細書の第１の開示のセンサの絶縁性の基板の材料と同じものが利用できる。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極、参照極及び対極が備える導電層は、カーボン、金等の導電性材料を含む層である。導電層は、前記のような導電性材料の層を、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法等を用いて基板の表面上に形成することにより製造することができる。導電層は、必要に応じて、レーザートリミング法を用いて所定のパターンに加工することができる。第３の開示において、作用極の導電層を作用極導電層、参照極の導電層を参照極導電層と称する場合がある。第３の開示において、対極の導電層に関しては、導電層自体が対極を構成するため、単に対極と称する。作用極導電層及び対極を構成する導電性材料のより好ましい実施形態は、後述する通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサの配線もまた、導電層と同様の導電性材料により構成することができる。
　本明細書の第３の開示のセンサは、液体試料に浸漬して液体試料中の所定の被検物質（アナライト）を検出するために用いられる。液体試料は水を溶媒として含む液体試料であることが好ましい。液体試料としては、細胞培養液や、生体から取得された血液を用いて調製された液体試料が挙げられる。被検物質の例は、本明細書の第１の開示のセンサによる被検物質に関して記載の通りであり、特に好ましくはグルコース及び乳酸から選択される１以上である。液体試料としては、細胞、特に生細胞、を含む液体試料が好ましく、細胞培養液が特に好ましい。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極は、作用極導電層上に配置された、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を備える。当該試薬は被検物質に応じて適宜選択することができる。当該試薬としては、酸化還元酵素とメディエータ（電子伝達物質）との組み合わせ、又は、酸化還元酵素を含むことができる。酸化還元酵素は補酵素を含むことができる。
　酸化還元酵素としては、酸化酵素又は脱水素酵素が挙げられる。酸化還元酵素の具体例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りであり、特に好ましくは、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼであることができる。
　また、メディエータは特に限定されず、その例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極が備える試薬層は、前記試薬に加えて、更に緩衝剤、親水性高分子化合物、導電性炭素フィラー、架橋剤等の成分を含むことができる。親水性高分子化合物及び導電性炭素フィラーの例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極は、保護膜を更に備えることができる。作用極上の保護膜は、試薬層に含まれる試薬の保護膜外への漏出を防止又は抑制し、且つ、保護膜外に存在する被検物質が透過可能な膜であることができる。このような性質を有する保護膜は、高分子化合物を含むことが好ましい。保護膜に含まれる高分子化合物としては、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物が挙げられる。陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物としては、プロトン伝導性を有する重合体化合物等が例示できる。陽イオン交換性官能基としては陰イオン性官能基が例示できる。
　４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物、及び、プロトン伝導性を有する重合体化合物の例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極が備える保護膜は、２以上の保護膜の積層体であることができ、その例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサの作用極が備える保護膜の別の好適な例は、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む保護膜である。
　本明細書の第３の開示のセンサの参照極は保護膜を備えることができる。参照極の保護膜は、作用極の保護膜に関して上述した材料により構成することができる。
　本明細書の第３の開示のセンサの対極は、保護膜により被覆されていてもよい。対極を被覆する保護膜の好ましい態様については後述する通りである。
　本明細書の第３の開示のセンサにおいて、絶縁性の基板上に配置された作用極及び対極を含む電極の、液体試料と接触する部分以外の部分は、絶縁層により被覆されていることが好ましい。絶縁層は絶縁性樹脂を含むことができる。絶縁層は２層以上の多層構造であることができる。多層構造の絶縁層は、例えば、絶縁性の基板及び導電層上に配置された第１絶縁層と、第１絶縁層上に配置された第２絶縁層とを含むことができる。第１絶縁層と第２絶縁層を構成する材料の好ましい態様は、第１の開示に係るセンサに関して説明した通りである。
＜センサ３００の概要＞
　第３の開示の一実施形態に係るセンサ３００について図面を参照して説明する。
　本実施形態のセンサ３００は、図５４～５７に示すように、絶縁性の基板２と、基板２の第１面２ａ上に配置された第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極６０と、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極６０のそれぞれと電気的に接続された配線５０を備える。本実施形態のセンサ３００は作用極を２つ含むが、図示しない別の実施形態では、作用極は１つのみであってもよく、３つ以上であってもよい。以下の説明では、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂを区別しない場合は、作用極１０ａ，１０ｂと表現する場合がある。また、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極６０を総称して、電極と表現する場合がある。また、本実施形態のセンサ３００は電極として作用極、参照極及び対極を含む三極式センサであるが、参照極を含まず作用極及び対極のみを含む二極式センサであってもよい。図示しないが、参照極及び／又は対極は、作用極が配置された基板とは別の基板上に設けられていてもよい。
　センサ３００は、第１の開示のセンサ１に関して図２１に示すのと同様に、液体試料Ｘに浸漬して液体試料Ｘ中の所定の被検物質を検出するために用いられる。液体試料及び被検物質の具体例は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ３００の作用極１０ａ，１０ｂは、図５６、５７に示すように、作用極導電層１１ａ，１１ｂと、液体試料中の被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂを含む。試薬の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ３００の作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料中の被検物質を酸化する試薬を含む場合、センサ３００の電極に所定の電圧を印加した条件下で、被検物質から作用極導電層１１ａ，１１ｂに電子が移動する。同様に、試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料中の被検物質を還元する試薬を含む場合、作用極導電層１１ａ，１１ｂから被検物質に電子が移動する。移動する電子の量は被検物質の濃度に依存するため、センサ３００の作用極１０ａ，１０ｂを流れる電流値又は電流値の変化に基づき、液体試料中の被検物質の濃度又は濃度変化を測定することができる。
　センサ３００は、液体試料中の被検物質を分析するための分析装置を構成することができる。分析装置としては、図２４に示す分析装置１００において、第１の開示に係るセンサ１が、第３の開示に係るセンサ３００に置換された、センサ３００と、分析ユニット１０２と、制御ユニット１０４とを備える分析装置が挙げられる。この分析装置の機能は、図２４に示す分析装置１００に関して説明した通りである。
＜センサ３００の構造＞
　第３の開示に係るセンサ３００の構造について、図５４並びにその断面図である図５５、５６及び５７を参照して説明する。なお第３の開示に係るセンサ３００の参照極２０の構造は、第１の開示に係るセンサ１の参照極２０の構造と同じである。このため図２２を参照した、第１の開示に係るセンサ１の参照極２０の説明を、第３の開示に係るセンサ３００の参照極２０の説明として引用する。
　センサ３００は、絶縁性の基板２と、基板２の第１面２ａ上に配置された、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極６０、参照極導電層２１、配線５０を備える。なお、第３の開示に係るセンサ３００の図示する実施形態では、対極６０は全体が導電層からなる。対極のうち導電層の部分を特に指すために、「対極導電層」又は「対極の導電層」と称することもできる。基板２の第１面２ａ上にはさらに、第１絶縁層３が配置されており、第１絶縁層３上にさらに第２絶縁層４が配置されている。第１絶縁層３の上面の、基板２の第１面２ａからの高さは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極６０、参照極導電層２１及び配線５０の、基板２の第１面２ａからの高さよりも大きい。このため、第１絶縁層３の一部は、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極６０、参照極導電層２１及び配線５０上に配置される。
　図５５に示すように、第１絶縁層３は、対極６０の一部と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した対極第１開口部３０２を備える。更に第２絶縁層４は、第１絶縁層３の対極第１開口部３０２の全体と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した対極第２開口部４０２を備える。対極第１開口部３０２及び対極第２開口部４０２を通じて、対極６０は外部に露出している。対極６０のうち、センサ３００を液体試料に浸漬したときに液体試料と接触する部分６０ａは、対極第１開口部３０２により形成される凹部の底面に位置する。
　図５６、５７に示すように、作用極１０ａ，１０ｂは、作用極導電層１１ａ，１１ｂと、作用極導電層１１ａ，１１ｂ上に配置され、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂを含む。試薬層１５ａ，１５ｂにおける前記試薬の好ましい態様は＜材料＞の欄に記載の通りである。
　第１の開示と同様に、第１作用極１０ａの「試薬層１５ａ」と、第２作用極１０ｂの「試薬層１５ｂ」とを区別するために、前者を第１作用極１０ａの「第１試薬層１５ａ」、後者を第２作用極１０ｂの「第２試薬層１５ｂ」と表現する場合がある。また、第１作用極１０ａの試薬層１５ａが有する試薬を「第１試薬」、第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂが有する試薬を「第２試薬」と表現する場合がある。センサ３００は、好適な実施形態において、複数の作用極１０ａ，１０ｂを備え、複数の作用極１０ａ，１０ｂのうち第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａに含まれる第１試薬と、第１作用極１０ａとは異なる第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂに含まれる第２試薬とは、互いに異なる。この好適な実施形態に係るセンサ３００は、第１試薬が、液体試料中の第１被検物質の酸化還元反応に関与し、第２試薬が、液体試料中の第１被検物質とは異なる第２被検物質の酸化還元反応に関与することができるため、液体試料中の、第１被検物質及び第２被検物質を含む複数の被検物質を検出するために用いることができる。
　図５６、５７に示すように、作用極１０ａ，１０ｂは、試薬層１５ａ，１５ｂ上に配置された、保護膜１６ａ，１６ｂを備えることができる。保護膜１６ａ，１６ｂの好ましい態様は＜材料＞の欄に記載の通りである。図示する例では、第１試薬層１５ａ上に一層からなる第１保護膜１６ａが配置され、第２試薬層１５ｂ上に、第２保護膜１６ｂａと第３保護膜１６ｂｂとからなる保護膜１６ｂが配置されているが、この例には限定されず、保護膜１６ａ，１６ｂは同じ構造を有していてもよいし、図示しない他の構造を有していてもよい。
　図５６、５７に示すように、第１絶縁層３は、作用極導電層１１ａ，１１ｂの各々の一部と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂを備える。更に第２絶縁層４は、第１絶縁層３の作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂの全体を内包する部分と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂを備える。作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂ及び作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂを通じて、作用極１０ａ，１０ｂは外部に露出している。作用極導電層１１ａ，１１ｂのうち、センサ３００を液体試料に浸漬したときに液体試料と接触する部分１１ａ１，１１ｂ１は、作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂにより形成される凹部の底面に位置する。また、試薬層１５ａ，１５ｂは、作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂに内包され、試薬層１５ａ，１５ｂの外周縁は、作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂの内周縁により規定される。保護膜１６ａ，１６ｂは、作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂに内包され、保護膜１６ａ，１６ｂの外周縁は、作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂの内周縁により規定される。
＜センサ３００による過酸化水素の発生の抑制＞
　第３の開示に係るセンサ３００は、液体試料中に浸漬し、前記液体試料中の被検物質を電気化学的に測定するとき、測定中の過酸化水素の発生の抑制、及び／又は、発生した過酸化水素の濃度低下により、測定の間の、前記液体試料中の過酸化水素濃度が１５μＭ未満に維持されることを特徴とする。過酸化水素は細胞に対し毒性を有することが知られている。このため、電気化学センサを用いて、細胞培養液等の、細胞を含む液体試料における被検物質を、数日間以上の長期間にわたり連続的に測定する場合に、測定中の過酸化水素濃度の上昇を抑制することが望ましい。
　センサ３００によれば、被検物質の検出感度の顕著な低下を生じることなく、測定の間の、液体試料中の過酸化水素濃度を１５μＭ未満の低濃度に維持することが可能である。
　ここで「液体試料中の被検物質を電気化学的に測定する」とは、例えば、液体試料中に浸漬したセンサ３００をポテンショスタットに接続し、参照極２０を基準として、作用極１０ａ，１０ｂに所定の電位を印加したときの、作用極１０ａ，１０ｂと対極６０の間の電流を検出し、検出された電流に基づいて被検物質を測定することを指す。センサ３００を用いた電気化学的測定は、典型的には数時間以上または数日間以上の期間、例えば１時間以上、好ましくは７２時間（３日間）以上、より好ましくは９６時間（４日間）以上、更に好ましくは１６８時間（７日間）以上、最も好ましくは２４０時間（１０日間）以上の期間にわたり連続的に行う。前記期間は、その上限は特に限定されないが、例えば３３６時間（１４日間）以内である。センサ３００によればこの期間中の液体試料中の過酸化水素濃度が１５μＭ未満に維持される。前記期間中の液体試料の過酸化水素濃度は、より好ましくは１０μＭ以下に維持される。
　上記の特徴を有するセンサ３００の好ましい実施形態では、対極６０が、液体試料と接触する部分６０ａに、過酸化水素を分解する触媒を含む。過酸化水素の発生は、主に、対極６０上における、液体試料中の酸素（Ｏ２）が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へ還元される反応により生じると考えられる。特に、作用極１０ａ，１０ｂ上で酸化反応を行う被検物質の測定において、対極６０上での過酸化水素の発生が問題なり得る。作用極１０ａ，１０ｂ上で酸化反応を行う被検物質の測定としては、被検物質の酸化に関与する酸化酵素、脱水素酵素等を含む試薬層１５ａ，１５ｂを備える作用極１０ａ，１０ｂを用いた測定が挙げられる。液体試料と接触する部分６０ａに、過酸化水素を分解する触媒を含む対極６０を備えるセンサ３００によれば、測定時に、対極６０上で液体試料中の酸素（Ｏ２）は水（Ｈ２Ｏ）へ還元されるため、過酸化水素の発生が抑制される。また、作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂに含まれる試薬のなかには、測定時に過酸化水素を発生する反応を伴う試薬がある（例えば酸化酵素、脱水素酵素）。本実施形態によれば、作用極１０ａ，１０ｂ上で発生した過酸化水素もまた、対極６０に含まれる前記触媒により水へと分解されるため、測定中の液体試料中の過酸化水素濃度の上昇が抑制され得る。
　第３の開示において、前記触媒は、例えば、金属を含む触媒であることができる。金属を含む触媒は、カタラーゼ等の有機触媒と比較して、安定性が高いため好ましい。金属を含む触媒としては、白金、ニッケル、パラジウム、鉄、マンガン及びタングステンから選択される１以上を含む触媒が好ましく、特に白金を含む触媒が好ましい。これらの金属を含む触媒は、過酸化水素を分解する活性が高いため好ましく、なかでも白金を含む触媒は、触媒活性及び安定性の観点から特に好ましい。
　第３の開示において、前記触媒は、対極の、液体試料と接触する部分に含まれていればよく、液体試料と接触する部分のみに含まれていてもよいし、対極の全体に含まれていてもよい。また、前記触媒は、少なくとも液体試料と接触する部分の表面を被覆する膜として対極に含まれていてもよいし、対極の全体または少なくとも液体試料と接触する部分を構成する導電性材料に分散した状態で含まれていてもよい。
　第３の開示において、前記触媒が、液体試料と接触する部分の表面を被覆する膜として含まれる対極の例としては、例えば、前記触媒として利用できる金属を、スパッタリング、メッキ等の手段により、液体試料と接触する部分の表面上に成膜して得られた対極や、液体媒体中に前記触媒の粒子を含む分散液を、液体試料と接触する部分の表面上に塗布し乾燥させて得られた対極が挙げられる。このうち、液体媒体中に前記触媒の粒子を含む分散液を用いて得られた対極は、塗布や印刷等の簡便な方法で作成できるため好ましい。前記触媒の粒子としては、前記金属の粒子が挙げられ、特に白金粒子が好ましい。白金粒子としては、平均粒子径が１μｍ未満、例えば８００ｎｍ以下、好ましくは６００ｎｍ以下の白金ナノ粒子が好ましい。
　第３の開示において、前記触媒が、対極の全体または少なくとも液体試料と接触する部分を構成する導電性材料に分散した状態で含まれている対極の例としては、前記触媒の粒子及び導電性材料の粒子を含むペースト状又は液状の組成物を用いて、全体または少なくとも液体試料と接触する部分を形成して得られる対極が挙げられる。この態様の対極は、基板上での対極の形成時と同時に前記触媒を含ませることができるため、少ない工程数で作製することができる。前記触媒の粒子としては、前記金属の粒子が挙げられ、特に白金粒子が好ましい。白金粒子の好ましい態様は上記の通りである。
　第３の開示において、対極は、カーボン、金等を導電性材料として含むことができ、特にカーボンを導電性材料として含むことが好ましい。カーボンとしては、ガラス状カーボン、カーボンブラック、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボン、グラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレン等の導電性炭素材料が使用できる。
　第３の開示において、対極における前記触媒の含有量は、前記触媒の種類や活性に応じて適宜設定することができる。例えば、対極の全体または少なくとも液体試料と接触する部分が、導電性材料としてのカーボンと、前記触媒としての白金粒子を含む場合、前記白金粒子を、前記カーボンに対して例えば０．５重量％以上、好ましくは１重量％以上、より好ましくは３重量％、特に好ましくは５重量％以上、上限は特に限定されないがコスト面から好ましくは５０重量％以下（前記白金粒子の前記カーボンに対する割合は例えば０．５重量％以上、５０重量％以下）、さらに好ましくは３０重量％以下、最も好ましくは１０重量％以下の量で含むことができる。カーボンと白金粒子との割合をこの範囲とすることにより、測定期間における液体試料中の過酸化水素濃度の上昇を抑制することができる。
　図示しないが、第３の開示において、対極の表面は、保護膜により更に被覆されていてもよい。対極を被覆する保護膜は、陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物、特に、側鎖に陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物を含むことが好ましい。ここで陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物としては、スルホン酸基を有する構成単位を含む重合体化合物が挙げられ、好ましくは側鎖にスルホン酸基を有するパーフルオロ化合物を構成単位に含む重合体化合物であり、特に好ましくはテトラフルオロエチレンとパーフルオロ－２－（２－フロオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテルとのコポリマーであり、最も好ましくはＮａｆｉｏｎ（登録商標）である。液体試料中に含まれ得る、塩化物イオン、有機酸イオン等の陰イオンは、白金触媒等の、過酸化水素を分解する触媒の活性に悪影響を与える可能性がある。対極を、陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物を含む保護膜により被覆することで、陰イオンの対極への接触を阻止することができ、前記触媒の活性低下を抑制することができる。
　一方、本開示に係るセンサ３００において、作用極１０ａ，１０ｂの作用極導電層１１ａ，１１ｂは、少なくとも液体試料と接触する部分１１ａ１，１１ｂ１が、好ましくは全体が、過酸化水素を分解する触媒を含まないことが好ましい。センサ３００の作用極１０ａ，１０ｂの作用極導電層１１ａ，１１ｂが前記触媒、特に白金を含む触媒、を含む場合、測定時のバックグラウンドノイズの増加、電流応答値の低下の可能性が生じ得る。過酸化水素を分解する触媒を含まない作用極導電層１１ａ，１１ｂ又は前記部分１１ａ１，１１ｂ１としては、過酸化水素を分解する触媒を含まないカーボン、金等の導電性材料の層又はその部分が挙げられる。
　作用極１０ａ，１０ｂの作用極導電層１１ａ，１１ｂは、より好ましくは、作用極導電層１１ａ，１１ｂを作用極、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極を参照極、白金電極を対極として備える三極式電解セルを用い、リン酸緩衝生理食塩水中で前記作用極導電層に－０．２Ｖ～０．３Ｖ（対前記銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極）の範囲の電位を印加したときに測定される電流値が±５．５ｎＡ／ｍｍ２以下である、という条件を満たす。この条件を満たす作用極導電層１１ａ，１１ｂを備えるセンサ３００は、被検物質を測定する際のバックグラウンド電流が十分に小さく、センサの応答性が高いため好ましい。このような作用極導電層１１ａ，１１ｂとしては、カーボンを含むカーボン導電層が挙げられ、より好ましくは、白金を含む触媒等の、過酸化水素を分解する触媒を含まないカーボン導電層が挙げられる。ここでカーボンとは、対極６０の導電性材料に関して例示したものが使用できる。なお電流値が±５．５ｎＡ／ｍｍ２以下であるとは、作用極として用いた作用極導電層１１ａ，１１ｂの、リン酸緩衝生理食塩水と接触する部分の、垂直方向の投影面積１ｍｍ２あたりの電流値の絶対値が５．５ｎＡ以下であることを意味する。上記の三極式電解セルを用いた電流値の測定は、具体的には、上述する＜第３の開示／実験５＞に記載の手順で行うことができる。
　本発明者らは更に、本開示に係るセンサ３００において、対極６０の、液体試料と接触する部分６０ａが、白金を含む触媒を含む態様では、低電位で、大きな絶対値の負電流を流すことができるという予想外の効果を見出した。したがって、液体試料と接触する部分６０ａに白金を含む触媒を含む対極６０は、白金を含む触媒を含まない対極と比較して、より少ない面積で効率的に対極として機能できるため、センササイズの縮小化に寄与できる。このため、本開示に係るセンサ３００では、対極６０の投影面積を、作用極導電層１１ａ，１１ｂの投影面積に対して、好ましくは２５０％以下、より好ましくは１００％以下、好ましくは３％以上（前記対極の投影面積が、前記作用極導電層の投影面積に対して、例えば３％以上、２５０％以下）、より好ましくは１０％以上とすることが可能である。また液体試料と接触する部分６０ａに白金を含む触媒を含む対極６０を備えるセンサ３００は、図示するように、作用極１０ａ，１０ｂを複数設ける場合にも適している。なお対極６０の投影面積とは、対極６０の液体試料と接触する部分６０ａ（対極第１開口部３０２が形成する凹部の底面に相当）の、垂直方向の投影面積を指す。作用極導電層１１ａ，１１ｂの投影面積とは、作用極導電層１１ａ，１１ｂの液体試料と接触する部分１１ａ１，１１ｂ１（作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂが形成する凹部の底面に相当）の、垂直方向の投影面積を指し、作用極１０ａ，１０ｂが複数存在する場合にはその合計面積を指す。
＜第３の開示の実施例＞
　第３の開示に係るセンサの実験１～７では、第３の開示のセンサの実施例及び比較例として、図５４に示す構成のセンサ３００を使用した。
　各実験で用いたセンサの特徴は実験１～７において個別に説明する。各実験で用いたセンサに共通する材料および製造方法の概略を先に説明する。
（基板）
　第１の開示の実施例と同様に、絶縁性の基板２として、図５４で図示する形状のポリエチレンテレフタレートからなる厚さ１８８μｍの基板を用いた。
（導電層）
　絶縁性の基板２の第１面２ａ上に、実験１～７で記載の所定のカーボンペーストを適用し１４０℃で１時間加熱することにより、第１の開示に関する図１と同様の形状の作用極導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１及び対極（対極導電層）６０、並びに、それらの各々に電気的に接続された配線５０を、厚さ５μｍのカーボン導電層により形成した。
（第１絶縁層）
　続いて、カーボン導電層が配置された基板２の第１面２ａ上に、フッ化ビニリデンとヘキサフルオロプロピレンとを含むコポリマーを含むフッ素樹脂からなる、基板２の第１面２ａ及びカーボン導電層を覆う、カーボン導電層上の部分の厚さが５μｍの第１絶縁層３を積層した。第１絶縁層３の製造方法は第１の開示の実施例に記載した通りである。
　第１絶縁層３の、第１作用極導電層１１ａ上の作用極第１開口部３０３ａは、直径１．２ｍｍの円形とし、第２作用極導電層１１ｂ上の作用極第１開口部３０３ｂは、直径１．４ｍｍの円形とした。参照極第１開口部３０１は直径１．１ｍｍの円形とし、対極第１開口部３０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
（第２絶縁層）
　続いて第１絶縁層３上に、溶媒中にポリエステル系樹脂と、パーフルオロアルキル基を含むフッ素系表面改質添加剤とを含む組成物を塗布し、１４０℃で１時間加熱することにより、厚さ４０μｍの第２絶縁層４を積層した。
　作用極導電層１１ａ，１１ｂ上の第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂは、それぞれ直径２ｍｍの円形とした。参照極第２開口部４０１は直径２ｍｍの円形とし、対極第２開口部４０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
（第１作用極（グルコース測定用）試薬層）
　第１作用極導電層１１ａ上の第１絶縁層３の作用極第１開口部３０３ａ内に、水中にリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、カーボンブラック分散液、ポリマー結合型メディエータ、グルコースオキシダーゼ及び架橋剤を含む第１液体組成物Ａの０．４μＬの液滴を形成し、乾燥して、グルコースオキシダーゼ及びメディエータを含む第１試薬層１５ａを形成した。
（第２作用極（乳酸測定用）試薬層）
　第２作用極導電層１１ｂの第１絶縁層３の作用極第１開口部３０３ｂ内に、水中にカーボンブラック分散液、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリマー結合型メディエータ、乳酸オキシダーゼ、ポリイミダゾール、ポリ－Ｌ－リジン及び架橋剤を含む第２液体組成物Ａの０．６μＬの液滴を形成し、乾燥して、乳酸オキシダーゼ及びメディエータを含む第２試薬層１５ｂを形成した。
（第１作用極（グルコース測定用）保護膜）
　以下の各試薬を下記終濃度となるようにエタノールに混合し約１時間反応させて、第１液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）を調製した。
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：７４，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：８７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１６、ＮＡＲＤ社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．９ｗｔ％
　第１作用極１０ａ上の第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａ内に、前記第１液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、続いて更に前記第１液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、第１保護膜１６ａを形成した。
（第２作用極（乳酸測定用）保護膜）
　２１．５ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液（シグマアルドリッチ社製）２３０９３．６７ｍｇに、エタノール（富士フイルム和光純薬社製）６４７２．７９ｍｇ及び５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（富士フイルム和光純薬社製）１２２６．４６ｍｇを添加して分散液のｐＨを調整し（陽イオン交換基の中和処理）、ボルテックスミキサーで析出物を溶解して、１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液３０７９２．９２ｍｇを調製した。得られた１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液を第２液体組成物Ｂとした。この第２液体組成物Ｂは、低級アルコールを含む溶媒中にＮａｆｉｏｎ（登録商標）を含む。
　第２作用極１０ｂ上の第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ｂ内に、前記第２液体組成物Ｂの０．６０μＬの液滴を形成し、乾燥して、第２保護膜１６ｂａを形成した。
　続いて、上記の第１液体組成物Ｂ（Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡポリマー分散液）と同一の組成物を第３液体組成物Ｂとして以下の処理に用いた。すなわち、第２保護膜１６ｂａが形成された第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ｂ内に、前記第３液体組成物Ｂの０．６５μＬの液滴を形成し、乾燥して、第３保護膜１６ｂｂを形成した。こうして、第２保護膜１６ｂａ上に第３保護膜１６ｂｂが積層された、保護膜１６ｂを第２作用極１０ｂ上に形成した。
（参照極）
　参照極２０の断面構造は、第１の開示のセンサに関する図２２と同一であるため、図２２を参照して参照極２０の製法の概略を以下に示す。第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１内の参照極導電層２１上に、銀塩化銀ペーストを適用し、１４０℃で１時間加熱して、銀塩化銀層２２形成した。続いて、第２絶縁層４の参照極第２開口部４０１内の銀塩化銀層２２上に参照極保護膜２３を配置して、参照極２０を形成した。
＜第３の開示／実験１＞
　実験１－１：上記の方法において、白金等の触媒を含まない通常のカーボンペーストを用いてカーボン導電層を形成し、実験１－１のセンサ３００を作製した。実験１－１のセンサでは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１及び対極（対極導電層）６０がいずれも、過酸化水素を分解する触媒を含まないカーボン導電層からなる。
　実験１－２：白金等の触媒を含まない通常のカーボンペーストを用いてカーボン導電層を形成したのち、第１絶縁層３を形成する前に、対極６０上のみに白金を蒸着させた以外は、上記の手順で実験１－２のセンサ３００を作製した。実験１－２のセンサにおいて、対極６０は、第１絶縁層３の対極第１開口部３０２及び第２絶縁層４の対極第２開口部４０２を通じて露出した、液体試料と接する部分６０ａが、カーボン導電層と、その上に積層された白金蒸着膜とを含み、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び参照極導電層２１は、白金等の触媒を含まないカーボン導電層からなる。
　被検物質としてグルコース及び乳酸を含む液体試料として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（タカラバイオ　ＰＢＳ　Ｔａｂｌｅｔｓ　Ｔ９１８１）、グルコース（富士フイルム和光純薬株式会社製）、及び、乳酸ナトリウム（シグマアルドリッチ社製）を用いて、グルコース３０ｍＭ、乳酸１５．６ｍＭを含む、ｐＨを７．０に調整したＰＢＳを調製した。
　前記液体試料に、実験１－１又は実験１－２のセンサを浸漬し、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極１０ａと対極６０との間の電流値及び第２作用極１０ｂと対極６０との間の電流値を７日間連続で測定した。測定はＮ＝４で行った。
　７日間測定後の前記液体試料を用いて、下記表に示す配合に従い過酸化水素濃度測定試料を調製した。前記過酸化水素濃度測定試料の６６６ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（３７℃下）で５分間測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、上記表における前記液体試料の代わりに既知濃度の過酸化水素（富士フイルム和光純薬株式会社製）を含む溶液を配合した過酸化水素濃度測定試料を調製し、同様に６６６ｎｍの吸光度を測定することにより、過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す検量線を作製した。
　前記検量線から前記液体試料中の過酸化水素濃度を求めた。求めた過酸化水素濃度は７日間の連続測定中の液体試料からの水の蒸発量を補正した値である。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記の結果から、液体試料と接触する部分に白金蒸着膜が積層されたカーボン導電層からなる対極を備える実験１－２のセンサは、カーボン導電層のみからなる対極を備える実験１－１のセンサと比較して、液体試料中の被検物質を測定する間の、液体試料中での過酸化水素の発生を抑制または低減できたことが確認された。
＜第３の開示／実験２＞
　実験２－１：実験１－１のセンサと同じ、対極６０を含む全ての導電層がカーボン導電層からなるセンサ３００を、実験２－１のセンサとした。
　実験２－２：実験２－１のセンサにおいて、対極第１開口部３０２及び対極第２開口部４０２を通じて露出した対極６０の表面に、白金ナノ粒子分散液（シグマアルドリッチ社製、白金粒子直径：７０±６ｎｍ）を滴下し乾燥させ、続いて、２１．５ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液（シグマアルドリッチ社製）を滴下し乾燥させて保護膜（図示せず）を形成して、実験２－２のセンサ３００を作製した。こうして作製された実験２－２のセンサ３００では、対極６０の、液体試料と接触する部分６０ａが、表面に白金ナノ粒子が修飾されたカーボン導電層であり、当該部分６０ａの表面が、陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物である、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）を含む保護膜（図示せず）により被覆されている。
　実験１に記載の組成の液体試料に、実験２－１又は実験２－２のセンサ３００を浸漬し、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極１０ａと対極６０との間の電流値及び第２作用極１０ｂと対極６０との間の電流値を７日間連続で測定した。測定はＮ＝２で行った。
　７日間測定後の前記液体試料を用いて、下記表に示す配合に従い過酸化水素濃度測定試料を調製した。前記過酸化水素濃度測定試料の６６６ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（３７℃下）で５分間測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、上記表における液体試料の代わりに既知濃度の過酸化水素（富士フイルム和光純薬株式会社製）を含む溶液を配合した過酸化水素濃度測定試料を調製し、同様に６６６ｎｍの吸光度を測定することにより、過酸化水素濃度と吸光度との検量線を作製した。
　前記検量線から液体試料中の過酸化水素濃度を求めた。求めた過酸化水素濃度は７日間の連続測定中の液体試料からの水の蒸発量を補正した値である。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記の結果から、液体試料と接触する部分６０ａに白金ナノ粒子が修飾されたカーボン導電層からなる対極６０を備える実験２－２のセンサ３００は、カーボン導電層のみからなる対極６０を備える実験２－１のセンサ３００と比較して、液体試料中の被検物質を測定する間の、液体試料中での過酸化水素の発生を抑制または低減できたことが確認された。
＜第３の開示／実験３＞
　実験２－１：実験１－１及び実験２－１のセンサと同じ、対極６０を含む全ての導電層がカーボン導電層からなるセンサ３００を、実験３－１のセンサとした。
　実験３－２：カーボンペーストとして、カーボン（グラファイト、カーボンブラック含有）と、前記カーボンに対して１重量％の白金粒子（平均粒子径３９０ｎｍ）とを含むカーボンペーストを用いて、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、参照極導電層２１及び対極（対極導電層）３０、並びに、配線５０を形成した以外は、上記の手順により実験３－２のセンサ３００を作製した。
　実験３－３：カーボンペーストとして、前記カーボンと、前記カーボンに対して５重量％の白金粒子とを含むカーボンペーストを用いたことを除いて、実験３－２のセンサと手順により実験３－３のセンサ３００を作製した。
　実験１に記載した組成の液体試料に、実験３－１、実験３－２又は実験３－３のセンサを浸漬し、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極１０ａと対極６０との間の電流値及び第２作用極１０ｂと対極６０との間の電流値を７日間連続で測定した。測定はＮ＝４で行った。
　７日間測定後の前記液体試料を用いて、下記表に示す配合に従い過酸化水素濃度測定試料を調製した。前記過酸化水素濃度測定試料の６６６ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（３７℃下）で５分間測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、上記表における液体試料の代わりに既知濃度の過酸化水素（富士フイルム和光純薬株式会社製）を含む溶液を配合した過酸化水素濃度測定試料を調製し、同様に６６６ｎｍの吸光度を測定することにより、過酸化水素濃度と吸光度との検量線を作製した。
　前記検量線から液体試料中の過酸化水素濃度を求めた。求めた過酸化水素濃度は７日間の連続測定中の液体試料からの水の蒸発量を補正した値である。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記の結果から、白金粒子を含むカーボン導電層からなる対極６０を備える実験３－２及び実験３－３のセンサ３００は、カーボン導電層のみからなる対極６０を備える実験３－１のセンサ３００と比較して、液体試料中の被検物質を測定する間の、液体試料中での過酸化水素の発生を抑制または低減できたことが確認された。
＜第３の開示／実験４＞
　実験３－１、３－２及び３－３で対極６０として用いた、白金を含まないカーボン導電層（以下「白金粒子なしカーボン電極」）、カーボンに対し１重量％の白金粒子を含むカーボン導電層（以下「白金粒子１％含有カーボン電極」）、及び、カーボンに対し５重量％の白金粒子を含むカーボン導電層（以下「白金粒子５％含有カーボン電極」）の電気化学的特性を調べるために、以下の実験を行った。
　白金粒子なしカーボン電極、白金粒子１％含有カーボン電極及び白金粒子５％含有カーボン電極のいずれかを作用極、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極（ＢＡＳ社製）を参照極、白金電極を対極とした三極式電解セルを構築し、各電極をポテンショスタットに接続した。前記作用極、対極及び参照極を、ｐＨ７．４±０．０５（２５℃）に調整したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（タカラバイオ　ＰＢＳ　Ｔａｂｌｅｔｓ　Ｔ９１８１；　０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、０．０１０Ｍ　ＰＯ４３＋）中に浸し、前記作用極に、前記参照極に対し±０．５Ｖの範囲の電位を掃引速度１０ｍＶ／ｓで印加してサイクリックボルタンメトリーを行った。得られたサイクリックボルタモグラムを図５８に示す。
　白金粒子の含有割合が高い電極ほど、高電位側において正の電流値の絶対値が大きく、低電位側において負の電流値の絶対値が大きい。低電位側での負の電流値は、ＰＢＳ中の酸素等の還元に起因するものと考えられる。このことは、白金粒子を含有した電極を作用極として用いる場合には、バックグラウンドノイズの増加や電流応答値の低下、酸素濃度等の環境依存の外乱の影響が大きくなり、感度が低下する可能性があることを示唆した。
　一方、白金粒子を含有した電極を対極として用いる場合、酸素等の還元による電流の増加によって、マイナス（負）の電位領域では、低電位（絶対値の小さな電位）で、大きな絶対値の負電流を流すことができる。このため白金粒子を含有した電極は、白金を含まないカーボン電極よりも、より少ない面積で効率的に対極として機能できるため、センササイズの縮小化に寄与できる。また、白金粒子を含有した電極を対極として用いた本開示のセンサを、マイナスの電位領域における低電位で駆動することにより、測定装置であるポテンショスタットへの負担を軽減させることも可能である。
＜第３の開示／実験５＞
　実験４で用いた、白金粒子なしカーボン電極及び白金粒子１％含有カーボン電極の電気化学的特性を更に調べるために、以下の実験を行った。
　白金粒子なしカーボン電極及び白金粒子１％含有カーボン電極のいずれかを作用極、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極（ＢＡＳ社製）を参照極、白金電極を対極とした三極式電解セルを構築し、各電極をポテンショスタットに接続した。前記作用極、対極及び参照極を、ｐＨ７．４±０．０５（２５℃）に調整したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（タカラバイオ　ＰＢＳ　Ｔａｂｌｅｔｓ　Ｔ９１８１；　０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、０．０１０Ｍ　ＰＯ４ ３＋）中に浸し、前記作用極に、前記参照極に対し０．３Ｖ又は－０．２Ｖの電位を印加して電流値を経時的に測定するアンペロメトリー測定を行った。作用極の面積あたりの電流値の測定結果を図５９に示す。
　図５９Ａは、白金粒子なしカーボン電極を作用極として用いた場合の測定結果を示す。図５９Ｂは、白金粒子１％含有カーボン電極を作用極として用いた場合の測定結果を示す。白金粒子なしカーボン電極を作用極として用いた場合の電流値（絶対値）は、白金粒子１％含有カーボン電極を作用極として用いた場合の電流値（絶対値）と比較して顕著に小さいことが確認された（ＡとＢとは縦軸のスケールが異なる）。この結果は、作用極導電層１１ａ，１１ｂとしては、白金粒子を含まない導電層が、バックグラウンド電流が少ないため適していることを示す。
＜第３の開示／実験６＞
　上記実験２に記載の、実験２－１のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０を含むすべての導電層が、白金粒子を含まないカーボン導電層である。
　一方、実験２－２のセンサは、実験２－１のセンサにおける対極６０のうち、測定しようとする液体試料と接触する部分６０ａが、表面に白金ナノ粒子が修飾されたカーボン導電層であり、作用極導電層１１ａ，１１ｂが、白金粒子を含まないカーボン導電層である。
　本実験６では、実験１に記載した組成の液体試料に、実験２－１又は実験２－２のセンサを浸漬し、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極１０ａと対極６０との間の電流値及び第２作用極１０ｂと対極６０との間の電流値を所定の時間、連続で測定した。測定はＮ＝２で行った。
　第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂの電流値の測定結果をそれぞれ図６０のＡ、Ｂに示す。図６０Ａに示す第１作用極１０ａの電流値は、グルコース濃度に対応する。図６０Ｂに示す第２作用極１０ｂの電流値は、乳酸濃度に対応する。作用極導電層１１ａ，１１ｂが白金粒子を含まず、対極６０のみが白金粒子を含む実験２－２のセンサと、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０がともに白金粒子を含まない実験２－１のセンサとで、応答性に顕著な違いは認められなかった。
＜第３の開示／実験７＞
　上記実験３に記載の、実験３－１のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０を含むすべての導電層が、白金粒子を含まないカーボン導電層である。
　実験３－２のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０を含むすべての導電層が、白金粒子をカーボンに対し１重量％含有するカーボン導電層である。
　実験３－３のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０を含むすべての導電層が、白金粒子をカーボンに対し５重量％含有するカーボン導電層である。
　本実験７では、実験１に記載した組成の液体試料に、実験３－１、実験３－２又は実験３－３のセンサを浸漬し、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、第１作用極１０ａと対極６０との間の電流値及び第２作用極１０ｂの電流値を所定の時間、連続で測定した。測定はＮ＝２で行った。
　第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂの電流値の測定結果をそれぞれ図６１のＡ、Ｂに示す。図６１Ａに示す第１作用極１０ａの電流値は、グルコース濃度に対応する。図６１Ｂに示す第２作用極１０ｂの電流値は、乳酸濃度に対応する。作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０が、白金粒子をカーボンに対し１重量％含有する実験３－２のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０が白金粒子を含まない実験３－１のセンサと比較して電流応答値の顕著な低下は見られなかった。一方、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０が、白金粒子をカーボンに対し５重量％含有する実験３－３のセンサは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ及び対極６０が白金粒子を含まない実験３－１のセンサと比較して、電流応答値が明らかに低下した。このことは、作用極導電層１１ａ，１１ｂにおける白金の存在は、センサの応答性を低下させることを示唆する。
＜第３の開示に関する付記＞
　細胞培養液等の液体試料中の被検物質（アラナイト）を電気化学的に測定するための、作用極と対極とを備えるセンサが従来から知られている。
　このようなセンサは、液体試料に浸漬した状態で、数日間以上の長期間にわたり、連続的に被検物質を測定する連続モニタリングの用途に用いられることがある。この場合、センサには、被検物質の検出感度が高いことに加えて、液体試料中に含まれる培養細胞への負の影響（例えば細胞毒性）がより小さいことが望まれる。
　酸化還元酵素、メディエータ等の、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を含む作用極と、対極とを備えるセンサを用いて、液体試料中の被検物質を電気化学的に測定する場合に、長時間の測定中に過酸化水素が発生し得ることが見いだされた。液体試料中の過酸化水素濃度が一定以上となると細胞に対し毒性を示す可能性がある。
　そこで第３の開示は、感度の顕著な低下を生じることなく、測定中の過酸化水素の発生を抑制する又は発生した過酸化水素を減少させることができる、作用極と対極とを備えるセンサを提供することを課題とする。
　第３の開示に係るセンサは、細胞培養液等の液体試料中の被検物質の測定に用いる場合に、感度の顕著な低下を生じることなく、測定中の過酸化水素の発生を抑制する又は発生した過酸化水素を減少させることができるため、液体試料中の過酸化水素濃度の上昇を抑制することができる。このため第３の開示に係るセンサは、液体試料中の細胞に対する負の影響が小さく、長期間にわたる連続モニタリングに好適に利用することができる。
　そこで本明細書では、第３の開示として、以下の付記３－１～３－１６のいずれか１以上に記載のセンサを開示する。
（付記３－１）
　液体試料中の被検物質を測定するためのセンサであって、
　作用極導電層と、前記作用極導電層上に配置された、前記被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層とを含む作用極と、
　対極と、
を備え、
　前記センサを前記液体試料中に浸漬し、前記液体試料中の前記被検物質を電気化学的に測定するとき、測定の間の、前記液体試料中の過酸化水素濃度が１５μＭ未満に維持される、センサ。
（付記３－２）
　前記対極が、前記液体試料と接触する部分に、過酸化水素を分解する触媒を含む、付記３－１に記載のセンサ。
（付記３－３）
　前記作用極導電層が、前記液体試料と接触する部分に、過酸化水素を分解する触媒を含まない、付記３－２に記載のセンサ。
（付記３－４）
　前記触媒が、金属を含む、付記３－２又は３－３に記載のセンサ。
（付記３－５）
　前記金属が、白金、ニッケル、パラジウム、鉄、マンガン及びタングステンから選択される１以上を含む、付記３－４に記載のセンサ。
（付記３－６）
　前記金属が白金を含む、付記３－４に記載のセンサ。
（付記３－７）
　前記白金が、白金粒子である、付記３－６に記載のセンサ。
（付記３－８）
　前記対極の、前記液体試料と接触する前記部分が、カーボンと、前記カーボンに対して１重量％以上の前記白金粒子とを含む、付記３－７に記載のセンサ。
（付記３－９）
　前記対極の、前記液体試料と接触する前記部分が、前記カーボンと、前記カーボンに対して５０重量％以下の前記白金粒子とを含む、付記３－８に記載のセンサ。
（付記３－１０）
　前記作用極導電層が、前記作用極導電層を作用極、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極を参照極、白金電極を対極として備える三極式電解セルを用い、リン酸緩衝生理食塩水中で前記作用極導電層に－０．２Ｖ～０．３Ｖ（対前記銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）電極）の範囲の電位を印加したときに測定される電流値が±５．５ｎＡ／ｍｍ２以下である、という条件を満たす、付記３－１～３－９のいずれか１項に記載のセンサ。
（付記３－１１）
　前記作用極導電層がカーボン導電層である、付記３－１０に記載のセンサ。
（付記３－１２）
　前記対極の投影面積が、前記作用極導電層の投影面積に対して、２５０％以下である、付記３－１～３－１１のいずれか１項に記載のセンサ。
（付記３－１３）
　前記対極の投影面積が、前記作用極導電層の投影面積に対して、１００％以下である、３－１２に記載のセンサ。
（付記３－１４）
　複数の前記作用極を備える、付記３－１２又は３－１３に記載のセンサ。
（付記３－１５）
　前記対極を被覆する保護膜を更に備える、付記３－１～３－１４のいずれか１項に記載のセンサ。
（付記３－１６）
　前記保護膜が、陽イオン交換性官能基を有する重合体化合物を含む、付記３－１５に記載のセンサ。
＜第４の開示の実施形態＞
　以下、第４の開示に係るセンサの実施形態について説明する。本実施形態では、必要以上に詳細な説明は省略する場合がある。例えば、既によく知られた事項の詳細説明や実質的に同一の構成に対する重複説明を省略する場合がある。これは、以下の説明が不必要に冗長になるのを避け、当業者の理解を容易にするためである。なお、第４の開示に係るセンサにおける構成のうち、第１の開示に係るセンサにおける構成と同じ符号を付したものについては、第１の開示に係るセンサにおける対応する構成の説明を参照することができる。
　また、出願人は、当業者が第４の開示を十分に理解するために添付図面及び以下の説明を提供するのであって、これらによって下記の「第４の開示に関する付記」に記載の事項を限定することを意図するものではない。
＜材料＞
　本明細書の第４の開示のセンサに用いることができる材料の例について説明する。
　本明細書の第４の開示のセンサに用いる絶縁性の基板の材料は特に限定されないが、例えば、本明細書の第１の開示のセンサの絶縁性の基板の材料と同じものが利用できる。
　本明細書の第４の開示のセンサの作用極、参照極及び対極が備える導電層は、カーボン、金、白金、パラジウム等の導電性材料を含む層である。導電層は、前記のような導電性材料の層を、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷法等を用いて基板の表面上に形成することにより製造することができる。導電層は、必要に応じて、レーザートリミング法を用いて所定のパターンに加工することができる。第４の開示において、作用極の導電層を作用極導電層、参照極の導電層を参照極導電層と称する場合がある。第４の開示において、対極の導電層に関しては、導電層自体が対極を構成するため、単に対極と称する。
　本明細書の第４の開示のセンサの配線もまた、導電層と同様の導電性材料により構成することができる。
　本明細書の第４の開示のセンサは、液体試料に浸漬して液体試料中の所定の被検物質（アナライト）を検出するために用いられる。液体試料は水を溶媒として含む液体試料であることが好ましい。液体試料としては、細胞培養液や、生体から取得された血液を用いて調製された液体試料が挙げられる。被検物質の例は、本明細書の第１の開示のセンサによる被検物質に関して記載の通りであり、特に好ましくはグルコース及び乳酸から選択される１以上である。
　本明細書の第４の開示のセンサの作用極は、作用極導電層上に配置された、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を備える。当該試薬は被検物質に応じて適宜選択することができる。当該試薬としては、酸化還元酵素とメディエータ（電子伝達物質）との組み合わせ、又は、酸化還元酵素を含むことができる。酸化還元酵素は補酵素を含むことができる。
　酸化還元酵素としては、酸化酵素又は脱水素酵素が挙げられる。酸化還元酵素の具体例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りであり、特に好ましくは、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼであることができる。
　また、メディエータは特に限定されず、その例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第４の開示のセンサの作用極が備える試薬層は、前記試薬に加えて、更に緩衝剤、親水性高分子化合物、導電性炭素フィラー、架橋剤等の成分を含むことができる。親水性高分子化合物及び導電性炭素フィラーの例は、本明細書の第１の開示のセンサに関して記載の通りである。
　本明細書の第４の開示のセンサの作用極は、試薬層上に配置された第１保護膜と、第１保護膜上に配置された第２保護膜とを更に備える。第１保護膜と第２保護膜とを総称して保護膜と称する場合がある。試薬層上の保護膜は、試薬層に含まれる試薬の保護膜外への漏出を防止又は抑制し、且つ、保護膜外に存在する被検物質が透過可能な膜であることができる。このような性質を有する試薬層上の第１保護膜及び第２保護膜を構成する材料の好ましい態様については後述する。
　本明細書の第４の開示のセンサの参照極は保護膜を備えることができる。参照極の保護膜は、高分子化合物を含むことができる。このような高分子化合物としては、作用極の試薬層上に配置される第１保護膜又は第２保護膜が含む後述する高分子化合物が例示でき、第２保護膜が含む高分子化合物が特に好ましい。
　本明細書の第４の開示のセンサにおいて、絶縁性の基板上に配置された作用極及び対極を含む電極の、液体試料と接触する部分以外の部分は、絶縁層により被覆されていることが好ましい。絶縁層は絶縁性樹脂を含むことができる。絶縁層は２層以上の多層構造であることができる。多層構造の絶縁層は、例えば、絶縁性の基板及び導電層上に配置された第１絶縁層と、第１絶縁層上に配置された第２絶縁層とを含むことができる。第１絶縁層と第２絶縁層を構成する材料の好ましい態様は、第１の開示に係るセンサに関して説明した通りである。
＜センサ４００の概要＞
　第４の開示の一実施形態に係るセンサ４００について図面を参照して説明する。
　本実施形態のセンサ４００は、図６２～６４に示すように、絶縁性の基板２と、基板２の第１面２ａ上に配置された第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０と、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０のそれぞれと電気的に接続された配線５０を備える。本実施形態のセンサ４００は作用極を２つ含むが、図示しない別の実施形態では、作用極は１つのみであってもよく、３つ以上であってもよい。以下の説明では、第１作用極１０ａ及び第２作用極１０ｂを区別しない場合は、作用極１０ａ，１０ｂと表現する場合がある。また、第１作用極１０ａ、第２作用極１０ｂ、参照極２０及び対極３０を総称して、電極と表現する場合がある。また、本実施形態のセンサ４００は電極として作用極、参照極及び対極を含む三極式センサであるが、参照極を含まず作用極及び対極のみを含む二極式センサであってもよい。図示しないが、参照極及び／又は対極は、作用極が配置された基板とは別の基板上に設けられていてもよい。
　センサ４００は、第１の開示のセンサ１に関して図２１に示すのと同様に、液体試料Ｘに浸漬して液体試料Ｘ中の所定の被検物質を検出するために用いられる。液体試料及び被検物質の具体例は、＜材料＞の欄に記載の通りである。
　センサ４００の第１作用極１０ａは、図６４に示すように、作用極導電層１１ａと、液体試料中の被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１５ａと、試薬層１５ａ上に配置された第１保護膜１８ａａと、第１保護膜１８ａａ上に配置された第２保護膜１８ａｂとを備える。試薬の好ましい態様は、＜材料＞の欄に記載の通りである。なお、図示しないがセンサ４００の第２作用極１０ｂの断面構造は、図６４に示す第１作用極１０ａの断面構造と実質的に同一であり、図６４において、第１作用極１０ａが第２作用極１０ｂに、作用極導電層１１ａが作用極導電層１１に、試薬層１５ａが試薬層１５ｂに、第１保護膜１８ａａが第１保護膜１８ｂａに、第２保護膜１８ａｂが第２保護膜１８ｂｂに、保護膜１８ａが保護膜１８ｂに置き換えられた構造である。
　センサ４００の作用極１０ａ，１０ｂの試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料中の被検物質を酸化する試薬を含む場合、センサ４００の電極に所定の電圧を印加した条件下で、被検物質から作用極導電層１１ａ，１１ｂに電子が移動する。同様に、試薬層１５ａ，１５ｂが、液体試料中の被検物質を還元する試薬を含む場合、作用極導電層１１ａ，１１ｂから被検物質に電子が移動する。移動する電子の量は被検物質の濃度に依存するため、センサ４００の作用極１０ａ，１０ｂを流れる電流値又は電流値の変化に基づき、液体試料中の被検物質の濃度又は濃度変化を測定することができる。
　センサ４００は、液体試料中の被検物質を分析するための分析装置を構成することができる。分析装置としては、図２４に示す分析装置１００において、第１の開示に係るセンサ１が、第４の開示に係るセンサ４００に置換された、センサ４００と、分析ユニット１０２と、制御ユニット１０４とを備える分析装置が挙げられる。この分析装置の機能は、図２４に示す分析装置１００に関して説明した通りである。
＜センサ４００の構造＞
　第４の開示に係るセンサ４００の構造について、図６２並びにその断面図である図６３及び６４を参照して説明する。なお第４の開示に係るセンサ４００の参照極２０の構造は、第１の開示に係るセンサ１の参照極２０の構造と同じである。このため図２２を参照した、第１の開示に係るセンサ１の参照極２０の説明を、第４の開示に係るセンサ４００の参照極２０の説明として引用する。
　センサ４００は、絶縁性の基板２と、基板２の第１面２ａ上に配置された、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極３０、参照極導電層２１、配線５０を備える。なお、第４の開示に係るセンサ４００の図示する実施形態では、対極３０は全体が導電層からなる。対極のうち導電層の部分を特に指すために、「対極導電層」又は「対極の導電層」と称することもできる。基板２の第１面２ａ上にはさらに、第１絶縁層３が配置されており、第１絶縁層３上にさらに第２絶縁層４が配置されている。第１絶縁層３の上面の、基板２の第１面２ａからの高さは、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極３０、参照極導電層２１及び配線５０の、基板２の第１面２ａからの高さよりも大きい。このため、第１絶縁層３の一部は、作用極導電層１１ａ，１１ｂ、対極３０、参照極導電層２１及び配線５０上に配置される。
　図６３に示すように、第１絶縁層３は、対極３０の一部と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した対極第１開口部３０２を備える。更に第２絶縁層４は、第１絶縁層３の対極第１開口部３０２の全体と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した対極第２開口部４０２を備える。対極第１開口部３０２及び対極第２開口部４０２を通じて、対極３０は外部に露出している。センサ４００を液体試料に浸漬したとき、対極第１開口部３０２により形成される凹部の底面に位置する対極３０の部分が液体試料と接触する。
　図６４に示すように、作用極１０ａ，１０ｂは、作用極導電層１１ａ，１１ｂと、作用極導電層１１ａ，１１ｂ上に配置され、被検物質の酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂを含む。試薬層１５ａ，１５ｂにおける前記試薬の好ましい態様は＜材料＞の欄に記載の通りである。
　第１の開示と同様に、第１作用極１０ａの「試薬層１５ａ」と、第２作用極１０ｂの「試薬層１５ｂ」とを区別するために、前者を第１作用極１０ａの「第１試薬層１５ａ」、後者を第２作用極１０ｂの「第２試薬層１５ｂ」と表現する場合がある。また、第１作用極１０ａの試薬層１５ａが有する試薬を「第１試薬」、第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂが有する試薬を「第２試薬」と表現する場合がある。センサ４００は、好適な実施形態において、複数の作用極１０ａ，１０ｂを備え、複数の作用極１０ａ，１０ｂのうち第１作用極１０ａの第１試薬層１５ａに含まれる第１試薬と、第１作用極１０ａとは異なる第２作用極１０ｂの第２試薬層１５ｂに含まれる第２試薬とは、互いに異なる。この好適な実施形態に係るセンサ４００は、第１試薬が、液体試料中の第１被検物質の酸化還元反応に関与し、第２試薬が、液体試料中の第１被検物質とは異なる第２被検物質の酸化還元反応に関与することができるため、液体試料中の、第１被検物質及び第２被検物質を含む複数の被検物質を検出するために用いることができる。
　図６４に示すように、作用極１０ａ，１０ｂは、試薬層１５ａ，１５ｂ上に配置された、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａと、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａ上に配置された、第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂとからなる保護膜１８ａ，１８ｂを備える。
　図６４に示すように、第１絶縁層３は、作用極導電層１１ａ，１１ｂの各々の一部と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂを備える。更に第２絶縁層４は、第１絶縁層３の作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂの全体を内包する部分と重なる位置に形成された、基板２の厚さ方向Ｔに貫通した作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂを備える。試薬層１５ａ，１５ｂは、作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂに内包され、試薬層１５ａ，１５ｂの外周縁は、作用極第１開口部３０３ａ，３０３ｂの内周縁により規定される。第１保護膜１８ａａ，１８ｂａ及び第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂは、作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂに内包され、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａ及び第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂの外周縁は、作用極第２開口部４０３ａ，４０３ｂの内周縁により規定される。
＜センサ４００の第１保護膜及び第２保護膜の特徴＞
　第４の開示に係るセンサ４００は、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａが、陽イオン交換性官能基を含む第１重合体化合物を含み、第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂが、陽イオン性官能基を含む第２重合体化合物を含むことを特徴とする。この特徴を有するセンサは、液体試料に浸漬した状態で、数日間以上の長期間にわたり連続的に被検物質を測定する連続モニタリングの用途に用いた場合でも、第１保護膜と第２保護膜との剥離が生じず、安定した測定が可能である。
　従来から、プロトンなどの陽イオンを試薬層と液体試料との間で輸送するために陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物（例えばテトラフルオロエチレンとパーフルオロ－２－（２－フロオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテルとの共重合体化合物）を含む第１保護膜を試薬層上に設け、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物（例えばＰ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンとポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのブロック共重合体化合物））を含む第２保護膜を第１保護膜上に更に設けた二層構造の保護膜を含むセンサが知られている。本発明者らはこのセンサを液体試料中に浸漬して被験物質の連続的な電気化学的測定を行う場合、３日間を超える長時間の経過後に、検出される電流値が大きく変化する異常値が検出され正確な測定ができない事象が発生し得ることを見出した。そして異常値を示したセンサでは、第１保護膜と第２保護膜との間で剥離が生じていたことを確認した。
　そして本発明者らは、鋭意検討の結果、上記の特徴を有する第１保護膜と第２保護膜とを備える第４の開示に係るセンサにより上記の問題が解決できることを見出した。第１保護膜の第１重合体化合物は、陽イオン交換性官能基（すなわち、陰イオン性官能基）を含み、一方で、第２保護膜の第２重合体化合物は、陽イオン性官能基を含むため、第１保護膜と第２保護膜とは、界面において静電結合により密着し、剥離が抑制されるものと考えられる。
　第４の開示において、第１保護膜に含まれる第１重合体化合物は、陽イオン交換性官能基を有するものであればよく、好ましくは、側鎖に陽イオン交換性官能基を有するものである。陽イオン交換性官能基としては、スルホン酸基が好ましい。側鎖にスルホン酸基を有する第１重合体化合物は、好ましくは側鎖にスルホン酸基を有するパーフルオロ化合物を構成単位に含む重合体化合物であり、より好ましくは側鎖にスルホン酸基を有するパーフルオロ化合物と、側鎖にイオン性官能基を有さないパーフルオロ化合物とを構成単位に含む共重合体化合物であり、特に好ましくはテトラフルオロエチレンとパーフルオロ－２－（２－フロオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテルとの共重合体化合物であり、最も好ましくはＮａｆｉｏｎ（登録商標）である。
　第４の開示において、第２保護膜に含まれる第２重合体化合物は、陽イオン性官能基を含むものであればよく、好ましくは、側鎖に陽イオン性官能基を有するものである。分析しようとする液体試料のｐＨが長期間の測定中に変動する場合があることから、第２重合体化合物における陽イオン性官能基はｐＨ非依存性の陽イオン性官能基であることが好ましく、特に、第四級アンモニウムカチオンを含む官能基であることが好ましい。第四級アンモニウムカチオンは、好ましくは、第三級アミンとエポキシ基との反応に由来する。第三級アミンとしてはピリジル基が挙げられ、特に４－ピリジル基が挙げられる。
　第２重合体化合物は、陽イオン性官能基を含む第１単位と、疎水性官能基を含む第２単位とを含み、第２重合体化合物の構成単位の全量に対する第２単位の比が５０モル％以上であることが好ましい。このような第２重合体化合物は疎水性が高いため、第４の開示に係るセンサを細胞培養液等の水系の液体試料中で浸漬して長時間測定する場合でも、第２保護膜が水により膨潤せず、第１保護膜との界面の剥離が抑制され易い。第２重合体化合物における、疎水性官能基を含む第２単位の含有量の上限は特に限定されないが、例えば第２重合体化合物の構成単位の全量に対する第２単位の比が７０モル％以下であることができる。疎水性官能基としては、炭素数１～１０の飽和炭化水素基が挙げられる。例えば、炭素数１～１０の飽和炭化水素基を含む一価アルコールによるメタクリル酸エステル又はアクリル酸エステル、具体例としてはｔｅｒｔ－ブチルメタクリレート、に由来する第２単位が好ましい。
　陽イオン性官能基を含む第１単位と、疎水性官能基を含む第２単位とを含む第２重合体化合物は、例えば、第三級アミンを含む第３単位と疎水性官能基を含む前記第２単位とを含む未架橋重合体化合物と、２以上のエポキシ基を含む架橋剤化合物とを、一定時間反応させることにより、前記第３単位の第三級アミンと、前記架橋剤化合物のエポキシ基とを反応させて、前記第３単位を、第四級アンモニウムカチオンを含む前記第１単位に変換することにより得られる。この場合、前記第３単位中の第三級アミンに対し、前記架橋剤化合物のエポキシ基を、好ましくは６．８モル％以上、より好ましくは２３モル％以下（前記第３単位中の第三級アミンに対し、前記架橋剤化合物のエポキシ基を例えば６．８モル％以上、２３モル％以下）、となるように反応させることにより、得られる第２重合体化合物が、高密度の第四級アンモニウムカチオンを有することとなり、第１保護膜と第２保護膜との間の静電結合が強固となるため好ましい。ここで、前記未架橋重合体化合物中の前記第３単位の第三級アミンに対する、前記架橋剤化合物のエポキシ基の割合（モル％）の算出の際は、第三級アミンのモル数は前記第３単位のモノマーの分子量に基づき算出することができ、エポキシ基のモル数は前記架橋剤化合物の分子量（前記架橋剤化合物が重合体化合物である場合は、その数平均分子量を一律の分子量とみなす）に基づき算出することができる。
　前記未架橋重合体化合物における、第三級アミンを含む第３単位としては、４－ビニルピリジンに由来する構成単位が好ましい。
　前記未架橋重合体化合物の好ましい例としては、４－ビニルピリジンとｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートとの共重合体化合物が挙げられる。当該共重合体化合物は、より好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートに由来する第２単位を、４－ビニルピリジンに由来する第３単位とｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートに由来する第２単位の全量に対して好ましくは５０モル％以上、より好ましくは７０モル％以下（前記第２単位の、前記第３単位と前記第２単位の全量に対する割合が例えば５０モル％以上、７０モル％以下）含有する。４－ビニルピリジンとｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートとの共重合体化合物はブロック共重合体化合物であることが特に好ましい。前記未架橋重合体化合物の分子量は特に限定されないが、例えば数平均分子量（Ｍｎ）が１５０，０００～５００，０００であることができる。
　２以上のエポキシ基を含む架橋剤化合物は、例えば両末端にそれぞれエポキシ基を有する直鎖状化合物であり、好ましくは、両末端がそれぞれグリシジル基により修飾されたポリアルキレングリコール化合物であり、具体的には、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルであることができる。ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルの分子量は特に限定されないが、例えば数平均分子量（Ｍｎ）が２００～２，０００であることができる。
＜センサ４００の製造方法＞
　第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂが、第三級アミンとエポキシ基との反応に由来する第四級アンモニウムカチオンを含む第１単位と、疎水性官能基を含む第２単位とを含む、第２重合体化合物を含む、第３の開示に係るセンサ４００の好ましい製造方法は、
　第三級アミンを含む第３単位と疎水性官能基を含む第２単位とを含む未架橋重合体化合物と、２以上のエポキシ基を含む架橋剤化合物とを、アルコール中に含む混合物を、２０℃以上の温度条件で６時間以上保持することにより、前記第３単位の前記第三級アミンと、前記架橋剤化合物の前記エポキシ基とを反応させて、前記第３単位を、前記第四級アンモニウムカチオンを含む前記第１単位に変換して、前記第１単位と前記第２単位とを含む前記第２重合体化合物をアルコール中に含む、第２保護膜形成用組成物を得る第１工程と、
　前記第２保護膜形成用組成物を、
　基板２と、
　基板２上に配置された、作用極導電層１１ａ，１１ｂと、
　作用極導電層１１ａ，１１ｂ上に配置された、試薬層１５ａ，１５ｂと、
　試薬層１５ａ，１５ｂ上に配置された、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａと、
を備えるセンサ部品の、
第１保護膜１８ａａ，１８ｂａ上に被覆し、乾燥させて、前記第２重合体化合物を含む第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂを形成する第２工程と、
を含む。
　この方法によれば、第１工程において、未架橋重合体化合物における第３単位の第三級アミンと、架橋剤化合物のエポキシ基との架橋反応が十分に進み、第四級アンモニウムカチオンの密度が高い第２重合体化合物を含む、第２保護膜形成用組成物を得ることができる。第１工程における温度条件はより好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上であり、上限はアルコールの沸点未満であることが好ましく、例えばアルコールとしてエタノールを用いる場合は７８℃未満であることが好ましい。第１工程における反応時間は好ましくは１２時間以上であり、上限は特に限定されないが例えば４８時間以下（第１工程における反応時間は例えば１２時間以上、４８時間以下）である。アルコールとしてはエタノール、メタノール、プロパノールが好ましく、エタノールが特に好ましい。美香共重合体化合物及び架橋剤化合物の好ましい態様は上述の通りである。
　第２工程では、前記第２保護膜形成用組成物を、第１保護膜１８ａａ，１８ｂａ上に塗布又は滴下して被覆し、続いて溶媒であるアルコールを揮発させることにより乾燥させて、第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂを形成する。
　この方法では、第１工程において事前に架橋を行うため、第２工程での、第２保護膜１８ａｂ，１８ｂｂの形成後に更に架橋処理を行う必要がない。このため、酵素等の試薬を含む試薬層１５ａ，１５ｂが、架橋処理時の熱により損傷を受けるリスクを低減することができる。
＜第４の開示の実施例＞
　第４の開示に係るセンサの実験８～１０では、第４の開示のセンサの実施例及び比較例として、図６２において、第２作用極１０ｂを備えず作用極として第１作用極１０ａ（以下、「作用極１０ａ」とする）のみを備えた構成のセンサ４００を使用した。
　各実験で用いたセンサの特徴は実験８～１０において個別に説明する。各実験で用いたセンサに共通する材料および製造方法の概略を先に説明する。
（基板）
　第１の開示の実施例と同様に、絶縁性の基板２として、図６２で図示する形状のポリエチレンテレフタレートからなる厚さ１８８μｍの基板を用いた。
（導電層）
　絶縁性の基板２の第１面２ａ上に、カーボンペーストを適用し１４０℃で１時間加熱することにより、第１の開示に関する図１と同様の形状の作用極導電層１１ａ、参照極導電層２１及び対極（対極導電層）３０、並びに、それらの各々に電気的に接続された配線５０を、厚さ５μｍのカーボン導電層により形成した。
（第１絶縁層）
　続いて、カーボン導電層が配置された基板２の第１面２ａ上に、フッ化ビニリデンとヘキサフルオロプロピレンとを含むコポリマーを含むフッ素樹脂からなる、基板２の第１面２ａ及びカーボン導電層を覆う、カーボン導電層上の部分の厚さが５μｍの第１絶縁層３を積層した。第１絶縁層３の製造方法は第１の開示の実施例に記載した通りである。
　第１絶縁層３の、作用極導電層１１ａ上の作用極第１開口部３０３ａは、直径１．２ｍｍの円形とした。参照極第１開口部３０１は直径１．１ｍｍの円形とし、対極第１開口部３０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
（第２絶縁層）
　続いて第１絶縁層３上に、溶媒中にポリエステル系樹脂と、パーフルオロアルキル基を含むフッ素系表面改質添加剤とを含む組成物を塗布し、１４０℃で１時間加熱することにより、厚さ４０μｍの第２絶縁層４を積層した。
　作用極導電層１１ａ上の第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａは、直径２ｍｍの円形とした。参照極第２開口部４０１は直径２ｍｍの円形とし、対極第２開口部４０２は１．８ｍｍ×２．１ｍｍの長方形とした。
（作用極試薬層）
　第１絶縁層３の作用極第１開口部３０３ａ内において、作用極導電層１１ａ上に、終濃度３ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、終濃度１４ｍｇ／ｍＬ（カーボンブラック濃度）のカーボンブラック分散液、ポリマー結合型メディエータ、終濃度３２００Ｕ／ｍＬのＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ及び終濃度０．１ｍＭ（結合部位の濃度）の架橋剤を含むグルコース測定用試薬液０．４ｍｇを塗布、乾燥させ、グルコースデヒドロゲナーゼ及びメディエータを含む試薬層１５ａを形成した。
（作用極保護膜）
　第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａ内において、試薬層１５ａ上に、第１保護膜１８ａａを形成し、第１保護膜１８ａａ上に第２保護膜１８ａｂを形成して、第１保護膜１８ａａと第２保護膜１８ａｂとからなる二層構造の保護膜１８ａを形成した。第１保護膜１８ａａ及び第２保護膜１８ａｂの具体的な製造方法については、実験８～１０において説明する。
（参照極）
　参照極２０の断面構造は、第１の開示のセンサに関する図２２と同一であるため、図２２を参照して参照極２０の製法の概略を以下に示す。第１絶縁層３の参照極第１開口部３０１内の参照極導電層２１上に、銀塩化銀ペーストを適用し、１４０℃で１時間加熱して、銀塩化銀層２２形成した。続いて、第２絶縁層４の参照極第２開口部４０１内の銀塩化銀層２２上に参照極保護膜２３を配置して、参照極２０を形成した。
＜第４の開示／実験８＞
（作用極保護膜）
　２１．５ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液（シグマアルドリッチ社製）２３，０９３．６７ｍｇに、エタノール（富士フイルム和光純薬社製）６，４７２．７９ｍｇ及び５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（富士フイルム和光純薬社製）１，２２６．４６ｍｇを添加して分散液のｐＨを調整し（陽イオン交換基の中和処理）、ボルテックスミキサーで析出物を溶解して、１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液３０，７９２．９２ｍｇを調製した。得られた１６．１２ｗｔ％濃度のＮａｆｉｏｎ（登録商標）分散液を、第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａ内の試薬層１５ａ上に、０．６ｍｇ塗布し乾燥して、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物としてＮａｆｉｏｎ（登録商標）を含む第１保護膜１８ａａを形成した。
　続いて、以下に示す２成分を記載の終濃度となるようにエタノールに混合し、室温（２５℃±３℃）で約１時間反応させることにより、２種類の第２保護膜形成用組成物を調製した。Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡは、所定分子量のポリ－４－ビニルピリジン（Ｐ４ＶＰ）と、所定分子量のポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレート（ｔＢｕＭＡ）との、ブロック共重合体である。
　実験８－１の第２保護膜形成用組成物：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：７４，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：８７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１６、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．９１ｗｔ％
　実験８－２の第２保護膜形成用組成物：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度２．０ｗｔ％
　第２絶縁層４の作用極第２開口部４０３ａ内の第１保護膜１８ａａ上に、実験８－１又は実験８－２の第２保護膜形成用組成物を０．６５ｍｇ塗布し乾燥して、実験８－１又は実験８－２の第２保護膜１８ａｂを形成した。
　実験８－１の第２保護膜１８ａｂを備えるセンサ４００を、実験８－１のセンサとした。
　実験８－２の第２保護膜１８ａｂを備えるセンサ４００を、実験８－２のセンサとした。
　被検物質を含む液体試料として、ＲＰＭＩ－１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ（シグマアルドリッチ社製　Ｒ１３８３）、グルコース(富士フイルム和光純薬株式会社製)、乳酸ナトリウム(シグマアルドリッチ社製）用いて、終濃度としてグルコース３０ｍＭ、乳酸１５ｍＭを含む、ｐＨを６．５に調整したＲＰＭＩ培地を調製した。
　前記液体試料に、実験８－１又は実験８－２のセンサを浸漬し、作用極１０ａに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、作用極１０ａと対極３０と間の電流値を約１４日間連続で測定した。測定はＮ＝１２で行った。
　電流値の測定結果を図６５に示す。図６５Ａは実験８－１のセンサを用いた測定結果を示し、図６５Ｂは実験８－２のセンサを用いた測定結果を示す。
　Ｍｎ：７４，０００のＰ４ＶＰとＭｎ：８７，０００のｔＢｕＭＡとを含むＰ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡを含み、ＰＥＧＤＧＥを終濃度０．９１ｗｔ％で含む第２保護膜形成用組成物から形成された第２保護膜１８ａｂを備える実験８－１のセンサの一部のサンプルでは、測定開始から４日間以上経過すると電流値の異常高値が検出された。
　一方、Ｍｎ：１２０，０００のＰ４ＶＰとＭｎ：２７０，０００のｔＢｕＭＡとを含むＰ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡを含み、ＰＥＧＤＧＥを終濃度２．０ｗｔ％で含む第２保護膜形成用組成物から形成された第２保護膜１８ａｂを備える実験８－２のセンサでは、測定開始から４日間以上経過後も電流値の異常高値が検出されなかった。
　この結果は、第２保護膜１８ａｂ中の、疎水性官能基を含むｔＢｕＭＡ由来単位の比率及び架橋剤化合物の濃度を高めることにより、長期間の測定中の電流値の異常高値の発生を抑制できることを示唆する。
＜第４の開示／実験９＞
　第２保護膜形成用組成物の組成として、エタノール中に下記の終濃度でＰ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ及びＰＥＧＤＧＥを含む、２種類の組成を設計した。なお第４の開示に関し以下に示す実験において、Ｐ４ＶＰ由来のピリジンに対する、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基の割合（モル％）の算出において、Ｐ４ＶＰのモノマーの分子量に基づき算出したＰ４ＶＰ由来のピリジンのモル数と、ＰＥＧＤＧＥの数平均分子量（一律のＰＥＧＤＧＥの分子量とみなす）に基づき算出したＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基のモル数とを用いた。
　組成Ａ（４－ビニルピリジン由来のピリジンに対し、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基が１０．１７モル％）：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．９ｗｔ％
　組成Ｂ（４－ビニルピリジン由来のピリジンに対し、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基が６．７７モル％）：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．６ｗｔ％
　組成Ａの成分をエタノール中に含む混合物を、４０℃で１６時間保持することで事前架橋して、実験９－１の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　組成Ｂの成分をエタノール中に含む混合物を、４０℃で１６時間保持することで事前架橋して、実験９－２の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　組成Ｂの成分をエタノール中に含む混合物を、５３℃で１６時間保持することで事前架橋して、実験９－３の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　第２保護膜形成用組成物として、実験９－１、実験９－２、実験９－３の第２保護膜形成用組成物を用いて作用極１０ａの第２保護膜１８ａｂを形成した以外は、実験８と同じ手順により、実験９－１、実験９－２、実験９－３のセンサを作製した。
　実験８で用いたのと同じ液体試料に、実験９－１、実験９－２又は実験９－３のセンサを浸漬し、作用極１０ａに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、作用極１０ａと対極３０との間の電流値を約１４日間連続で測定した。測定は、実験９－１はＮ＝８、実験９－２はＮ＝１２、実験９－３はＮ＝４で行った。
　電流値の測定結果を図６６に示す。図６６Ａは実験９－１のセンサを用いた測定結果を示し、図６６Ｂは実験９－２のセンサを用いた測定結果を示し、図６６Ｃは実験９－３のセンサを用いた測定結果を示す。
　Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡとＰＥＧＤＧＥとを混合後に一定時間反応させて事前架橋した第２保護膜形成用組成物を用いて形成された第２保護膜１８ａｂを、陽イオン交換性官能基を含むＮａｆｉｏｎ（登録商標）を含む第１保護膜１８ａａ上に備えるセンサでは、長期間の測定中の電流値の異常高値の発生を抑制できることが示唆された。また、事前架橋の際の温度を高めることにより、長期間の測定中の電流値の異常高値の発生を更に抑制できることが示唆された。
＜第４の開示／実験１０＞
　第２保護膜形成用組成物の組成として、エタノール中に下記の終濃度でＰ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ及びＰＥＧＤＧＥを含む、３種類の組成を設計した。
　組成Ｃ（４－ビニルピリジン由来のピリジンに対し、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基が２２．６７モル％）：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度２．０ｗｔ％
　組成Ｄ（４－ビニルピリジン由来のピリジンに対し、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基が１０．１７モル％）：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．９ｗｔ％
　組成Ｅ（４－ビニルピリジン由来のピリジンに対し、ＰＥＧＤＧＥ由来のエポキシ基が６．７７モル％）：
・Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡ（ポリ－４－ビニルピリジンのＭｎ：１２０，０００、ポリ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートのＭｎ：２７０，０００、Ｍｗ／Ｍｎ：１．１５、ポリマーソース社製）、終濃度５．７２ｗｔ％
・ＰＥＧＤＧＥ（ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、Ｍｎ：～１，０００、シグマアルドリッチ社製）、終濃度０．６ｗｔ％
　組成Ｃの成分をエタノール中に含む混合物を、室温（２５℃±３℃）で約１時間保持することで事前架橋して、実験１０－１の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　組成Ｄの成分をエタノール中に含む混合物を、４０℃で１６時間保持することで事前架橋して、実験１０－２の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　組成Ｅの成分をエタノール中に含む混合物を、５３℃で１６時間保持することで事前架橋して、実験１０－３の第２保護膜形成用組成物を調製した。
　第２保護膜形成用組成物として、実験１０－１、実験１０－２、実験１０－３の第２保護膜形成用組成物を用いて作用極１０ａの第２保護膜１８ａｂを形成した以外は、実験８と同じ手順により、実験１０－１、実験１０－２、実験１０－３のセンサを作製した。
　続いて、作製された実験１０－１、実験１０－２及び実験１０－３のセンサを、それぞれ、乾燥剤共存下、６０℃で１４日間保存した。この保存は劣化を加速させることを目的とする。
　６０℃で１４日間保存後の各センサを、実験８で用いたのと同じ液体試料に浸漬し、作用極１０ａに、参照極２０（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して１００ｍＶの電圧を印加し、作用極１０ａと対極３０との間の電流値を１０日間連続で測定した。測定はＮ＝４で行った。測定開始２４時間後の電流値（Ｎ＝４の平均）を１００％とし、それよりも後の時点で測定された電流値（Ｎ＝４の平均）を相対値で表した。
　電流値の測定結果を図６７に示す。
　Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡとＰＥＧＤＧＥとを混合後に６時間以上の時間反応させて事前架橋した第２保護膜形成用組成物を用いて形成された第２保護膜１８ａｂを、陽イオン交換性官能基を含むＮａｆｉｏｎ（登録商標）を含む第１保護膜１８ａａ上に備える実験１０－２及び１０－３のセンサは、実験１０－１のセンサと比較して、温度加速試験後の電流値の変動が小さいことが確認された。また、事前架橋の際の温度を高めることにより、温度加速試験後の電流値の変動をさらに小さくできることが確認された。これらの結果は、Ｐ４ＶＰ－ｔＢｕＭＡとＰＥＧＤＧＥとを混合後に２０℃以上の温度条件で６時間以上反応させて事前架橋した第２保護膜形成用組成物を用いて、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）を含む第１保護膜１８ａａ上に第２保護膜１８ａｂを形成することにより、長期安定性に優れたセンサを実現できることを示唆する。
＜第４の開示に関する付記＞
　細胞培養液等の液体試料中の被検物質（アラナイト）を電気化学的に測定するための、酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層を含む作用極を備えるセンサが従来から知られている。
　このようなセンサは、液体試料に浸漬した状態で、数日間以上の長期間にわたり連続的に被検物質を測定する連続モニタリングの用途に用いられることがある。この場合、センサには、測定期間における安定した測定を可能にするために、応答性の変化が小さいことが求められる。
　そこで本明細書の第４の開示は、液体試料中に浸漬した状態で長期間測定を行った場合でも応答性の変化が小さく安定した測定が可能なセンサ及びその製造方法を提供することを課題とする。第４の開示に係るセンサは、長期間にわたる連続モニタリングの用途に好適に用いることができる。
　具体的には、本明細書では、第４の開示として、以下の付記４－１～４－１０のいずれか１以上に記載のセンサ及びその製造方法を開示する。
（付記４－１）
　絶縁性の基板と、前記基板上に配置された作用極とを備えるセンサであって、
　前記作用極は、
　前記基板上に配置された作用極導電層と、
　前記作用極導電層上に配置された、酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層と、
　前記試薬層上に配置された、陽イオン交換性官能基を含む第１重合体化合物を含む第１保護膜と、
　前記第１保護膜上に配置された、陽イオン性官能基を含む第２重合体化合物を含む第２保護膜と
を備えることを特徴とするセンサ。
（付記４－２）
　前記第２重合体化合物は、前記陽イオン性官能基を含む第１単位と、疎水性官能基を含む第２単位とを含み、前記第２重合体化合物の構成単位の全量に対する前記第２単位の比が５０モル％以上である、付記４－１に記載のセンサ。
（付記４－３）
　前記陽イオン性官能基は、ｐＨ非依存性である、付記４－１又は４－２に記載のセンサ。
（付記４－４）
　前記陽イオン性官能基は、第三級アミンとエポキシ基との反応に由来する、第四級アンモニウムカチオンを含む、付記４－３に記載のセンサ。
（付記４－５）
　前記反応が、前記第三級アミンと、前記第三級アミンに対し６．８モル％以上の前記エポキシ基との反応である、付記４－３に記載のセンサ。
（付記４－６）
　前記第２重合体化合物が、２以上のエポキシ基を含む架橋剤化合物により架橋されている、４－ビニルピリジンとｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートとの共重合体化合物である、付記４－１～４－５のいずれか１項に記載のセンサ。
（付記４－７）
　絶縁性の基板と、前記基板上に配置された作用極とを備え、
　前記作用極は、
　前記基板上に配置された作用極導電層と、
　前記作用極導電層上に配置された、酸化還元反応に関与する試薬を含む試薬層と、
　前記試薬層上に配置された、陽イオン交換性官能基を含む第１重合体化合物を含む第１保護膜と、
　前記第１保護膜上に配置された、第三級アミンとエポキシ基との反応に由来する第四級アンモニウムカチオンを含む第１単位と、疎水性官能基を含む第２単位とを含む、第２重合体化合物を含む第２保護膜と
を備えることを特徴とするセンサの製造方法であって、
　第三級アミンを含む第３単位と前記疎水性官能基を含む前記第２単位とを含む未架橋重合体化合物と、２以上のエポキシ基を含む架橋剤化合物とを、アルコール中に含む混合物を、２０℃以上の温度条件で６時間以上保持することにより、前記第３単位の前記第三級アミンと、前記架橋剤化合物の前記エポキシ基とを反応させて、前記第３単位を、前記第四級アンモニウムカチオンを含む前記第１単位に変換して、前記第１単位と前記第２単位とを含む前記第２重合体化合物をアルコール中に含む、第２保護膜形成用組成物を得る工程と、
　前記第２保護膜形成用組成物を、
　前記基板と、
　前記基板上に配置された、前記作用極導電層と、
　前記作用極導電層上に配置された、前記試薬層と、
　前記試薬層上に配置された、前記第１保護膜と、
を備えるセンサ部品の、
前記第１保護膜上に被覆し、乾燥させて、前記第２重合体化合物を含む前記第２保護膜を形成する工程と、
を含む方法。
（付記４－８）
　前記未架橋重合体化合物は、前記第３単位と、前記第２単位とを、前記第２単位が、前記第３単位と前記第２単位との全量に対して５０モル％以上の比となるように含む、付記４－７に記載の方法。
（付記４－９）
　前記混合物が、前記第３単位の前記第三級アミンに対し、前記架橋剤化合物の前記エポキシ基が６．８モル％以上となるように、前記未架橋重合体化合物と前記架橋剤化合物とを含む、付記４－７又は４－８に記載の方法。
（付記４－１０）
　前記未架橋重合体化合物が、４－ビニルピリジンとｔｅｒｔ－ブチルメタクリレートとの共重合体化合物である、付記４－７～４－９のいずれか１項に記載の方法。
　１　センサ
　２　基板
　３，３ａ，３ｂ　第１絶縁層
　３ａ１，３ｂ１　第１開口部
　３ａ１０，３ｂ１０　第１開口部の内周縁
　３ａ２，３ｂ２　撥水性の表面
　３ａ３，３ｂ３　第１絶縁層のうち第１開口部の全体を内包する部分
　４，４ａ，４ｂ　第２絶縁層
　４ａ１，４ｂ１　第２開口部
　４ａ１０，４ｂ１０　第２開口部の内周縁
　４ｂ２，４ｂ２　アルコールに対して撥液性の表面
　１０ａ，１０ｂ　作用極
　１０ａ　第１作用極
　１０ｂ　第２作用極
　１１ａ，１１ｂ　作用極の導電層
　１１ａ　第１作用極の導電層
　１１ｂ　第２作用極の導電層
　１５ａ，１５ｂ　試薬層
　１５ａ１０，１５ｂ１０　試薬層の外周縁
　１５ａ　第１作用極の第１試薬層
　１５ｂ　第２作用極の第２試薬層
　１６ａ，１６ｂ　保護膜
　１６ａ１０，１６ｂ１０　保護膜の外周縁
　１６ａ　第１保護膜
　１６ｂａ　第２保護膜
　１６ｂｂ　第３保護膜
　２０　参照極
　３０　対極
　５０　配線
　Ｃ　細胞
　Ｔ　基板の厚さ方向
　Ｘ　液体試料
　Ａ　水中の酸化還元反応に関与する試薬を含む液体組成物
　Ｂ　アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物
　１１０１、１１０１’、１１０１’’　センサ
　１２００　絶縁性の基板
　１２０１　基板の先端部
　１２０２　基板の第１面
　１２１０　本体部
　１２１１　本体部の第１端部
　１２２０　接続部
　１２２２　接続部の第２端部
　１２２３　接続部の第３端部
　１２２５　折り曲げ部
　１２３０　基端部
　１２３４　基端部の第４端部
　１３００　検出電極
　１３１０　作用極
　１３１１　作用極導電層
　１３１５　試薬層
　１３１６　作用極保護膜
　１３２０　参照極
　１３２１　参照極導電層
　１３２２　銀／塩化銀層
　１３２６　参照極保護膜
　１３３０　対極
　１３３１　対極の上面
　１５０１　作用極開口部
　１５０２　参照極開口部
　１５０３　対極開口部
　１０５０　絶縁層
　１０５１　第１絶縁層
　１０５２、１０５２ａ、１０５２ｂ、１０５２ｃ　第２絶縁層
　１０５５　非絶縁領域
　１０６１　先端開口部
　１０６２　流路
　１０６２Ａ　拡張部
　１００５　配線
　１００６　端子
　９００　センサユニット
　９５７　下方支持プレート（支持部材）
　９５７ｄ　第１係合部
　９５９　上方支持プレート（支持部材）
　９５９ａ　第２係合部
　Ｔ１　基板の厚さ方向
　Ｘ１　液体試料
　３００，４００　センサ
　６０　対極
　６０ａ　対極の液体試料と接触する部分
　１１ａ，１１ｂ　作用極導電層
　１１ａ１，１１ｂ１　作用極導電層の液体試料と接触する部分
　１８ａ　保護膜
　１８ａａ　第１保護膜
　１８ａｂ　第２保護膜

Claims (15)

  1. 　絶縁性の基板と、前記基板上に配置された作用極とを備えるセンサであって、
    　前記作用極は、
    　前記基板上に配置された導電層と、
    　少なくとも一部が前記導電層上に配置され、前記基板の厚さ方向からの平面視において前記導電層の一部と重なる位置に形成された前記厚さ方向に貫通した第１開口部と、撥水性の表面とを有する第１絶縁層と、
    　前記第１絶縁層上に配置され、前記厚さ方向からの平面視において前記第１絶縁層のうち前記第１開口部の全体を内包する部分と重なる位置に形成された前記厚さ方向に貫通した第２開口部と、アルコールに対して撥液性の表面とを有する第２絶縁層と、
    　前記第１絶縁層の前記第１開口部内に配置され、前記第１絶縁層の前記第１開口部の内周縁により規定される外周縁と、酸化還元反応に関与する試薬とを含む試薬層と、
    　前記第２絶縁層の前記第２開口部内に配置され、前記第２絶縁層の前記第２開口部の内周縁により規定される外周縁を含む保護膜と
    を備えることを特徴とするセンサ。
  2. 　前記第１絶縁層の前記表面は、フッ素樹脂を含む、
    請求項１に記載のセンサ。
  3. 　前記第２絶縁層の前記表面は、パーフルオロアルキル基を含む化合物を含む、
    請求項１又は２に記載のセンサ。
  4. 　複数の前記作用極を備え、
    　複数の前記作用極に含まれる第１作用極の第１試薬層に含まれる第１試薬と、前記第１作用極とは異なる第２作用極の第２試薬層に含まれる第２試薬とは、互いに異なる、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のセンサ。
  5. 　前記第１試薬は、グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼを含み、
    　前記第２試薬は、乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼを含む、
    請求項４に記載のセンサ。
  6. 　前記保護膜は、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第１保護膜を含む、
    請求項１～５のいずれか１項に記載のセンサ。
  7. 　前記保護膜は、前記試薬層上に配置された、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む第２保護膜と、前記第２保護膜上に配置された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第３保護膜とを含む、
    請求項１～６のいずれか１項に記載のセンサ。
  8. 　前記基板上に配置された、対極及び参照極を更に備える、
    請求項１～７のいずれか１項に記載のセンサ。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のセンサの製造方法であって、
    　前記導電層、前記第１絶縁層及び前記第２絶縁層が配置された前記基板の、前記第１絶縁層の前記第１開口部内に、水中に前記試薬を含む液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して、前記試薬層を形成すること、及び、
    　前記試薬層の形成後に、前記第２絶縁層の前記第２開口部内に、アルコール中に保護膜成分を含む液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して、前記保護膜を形成すること
    を含むことを特徴とする方法。
  10. 　前記第１絶縁層の前記表面は、フッ素樹脂を含む、
    請求項９に記載の方法。
  11. 　前記第２絶縁層の前記表面は、パーフルオロアルキル基を含む化合物を含む、
    請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記センサは、複数の前記作用極を備え、
    　前記試薬層の形成は、
    　複数の前記作用極に含まれる第１作用極の第１試薬層を、前記第１作用極の前記第１絶縁層の前記第１開口内に、水中に第１試薬を含む第１液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して形成すること、及び
    　複数の前記作用極に含まれる前記第１作用極とは異なる第２作用極の第２試薬層を、前記第２作用極の前記第１絶縁層の前記第１開口内に、水中に前記第１試薬とは異なる第２試薬を含む第２液体組成物Ａの液滴を形成したのち乾燥して形成すること
    を含む、
    請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記第１試薬は、グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼを含み、
    　前記第２試薬は、乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼを含む、
    請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記保護膜は、前記試薬層上に配置された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第１保護膜を含み、
    　前記保護膜の形成は、
    　前記試薬層の形成後に、前記第１保護膜を、前記第２絶縁層の前記第２開口部内に、アルコール中に前記４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第１液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して形成すること
    を含む、
    請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記保護膜は、前記試薬層上に配置された、陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む第２保護膜と、前記第２保護膜上に配置された、４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第３保護膜とを含み、
    　前記保護膜の形成は、
    　前記試薬層の形成後に、前記第２保護膜を、前記第２絶縁層の前記第２開口部内に、アルコール中に前記陽イオン交換性官能基を含む重合体化合物を含む第２液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して形成すること、及び
    　前記第２保護膜の形成後に、前記第３保護膜を、前記第２作用極の前記第２絶縁層の前記第２開口部内に、アルコール中に前記４－ビニルピリジンを構成単位に含む重合体化合物を含む第３液体組成物Ｂの液滴を形成したのち乾燥して形成すること
    を含む、
    請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
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