DD142248A1 - Enzymelektrode zur bestimmung von maltose,alpha-amylase und staerke - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Kon . tration von Maltose und Stärke sowie der Aktivität von α-Amylase. Sie kann in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden. Das Ziel besteht darin, ein spezifisches Verfahren zu entwickeln, das bei einfacher Handhabung kurze Meßzeiten aufweist und das neben der quantitativen Bestimmung der α-Amylaseaktivität auch die Bestimmung der Konzentration von Maltose oder Stärke in der gleichen Probe erlaubt. Die erfindungsgemäße Enzymelektrode besteht aus einer O2" oder Elektrode, die mit einer Enzymschicht aus Glukoseoxidase und Glukoamylase bedeckt ist. Zur Bestimmung von Maltose und a-Amylase wird diese Enzymschicht durch einen Dialyseschlauch von der Meßlösung abgetrennt, während zur Stärkebestimmung die Enzymschicht direkt mit der Meßlösung in Kontakt steht. Das Verfahren zur Bestimmung von Maltose, α-Amylase und Stärke ist gut handhabbar, durch den Einsatz von Enzymen, spezifisch und durch deren Wiederverwendbarkeit billig.'

Description

'Erfinder F. Scheller (ZIM) D. Pfeiffer (ZIM) H₀ Weise (ItM)

Enzymelektrode zur Bestimmung von Maltose, oC-Amylase und Stärke - -

Anwendungsgebiet

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von Ci-Amylase sowie der Konzentration von Maltose und Stärke. Das Verfahren ist vor. allem für den Einsatz in der Notfalldiagnostik bei akuter Pankreatitis geeignet«, wobei eine Unterscheidung zwischen normaler und erhöhter Enzymaktivität im Serum notwendig ist» Weiterhin besitzt die Bestimmung der oL τ-Amyläse, Maltose und Stärke in der Lebensmit-" telindustrie z„ B. bei der Gewinnung von Zuckern aus Stärke, in der Backwarehindustrie_s der Bierbereitung sowie.in Brennereien eine große Bedeutung und das erfindungsgemäße Verfahren ist für diese Gebiete geeignet»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die verbreitesten Methoden zur Messung von o4~Amylase.basieren auf dem.Abbau gefärbter Stärkekomplexe (Jod-Stärke, Farbstoff-Stärke)« Diese Methoden benötigen zur Auswertung ein Colorimeter«, Die Jod-Stärke-Reaktion ist zwar einfach zu handhaben/ aber das Substrat ist schwer zu standardisieren, so daß ihre Aussagekraft nur begrenzt ist. Die Farbstoff-Stärke-Methode erlaubt zwar eine gute Differenzierung zwischen normaler und erhöhter i\-Amylase-Aktivität _} aber sie erfordert zeitaufwen-

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dige Prozeduren wie zentrifugieren^ dekantieren und Bezugsmessungen, . · . Die zur Stärkebestimmung eingesetzte Liciitetreuungstechnik ist im allgemeinen zu ungenau, auch die Reduktionsmethode für Maltose und $(-Amylase ist.zu unspezifisch. Gekoppelte enzymatische Assays für Maltose undß(-Amylase sind zwar spezifisch aber durch den Einsatz von zusätzlichen Enzymreaktionen sehr zeit- , aufwendig und teuer (D. Lehan£_s P..Wissert, G. Lum und A.Levy, .Clinical Chemistry 2^₅ 1Ο61₉ 1977)«

In der Lebensmittelindustrie wird außerdem eine viskosimetrische Methode zur Bestimmung der ci-Amylaseaktivität eingesetztj die aber ebenfalls, zu zeitaufwendig ist . (Messzeit 1 Std«, je Probe) (P. Anderegg, P. Schur und H. Pfenninger, Schweiz _t Brauerei-Rdsch. 87, 239 (1976).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Vorteile der amperometrischen Enzymelektrode, d. h. kurze Meßzeit, kleines Probenvolumen, hohe Spezifität durch Verwendung von Enzymreaktionen sowie häufige Verwendbarkeit der Enzyme für viele Meßproben auf die Bestimmung der Aktivität von oC-Amylase sowie .der Konzentrationsbestimmung von Maltose und Stärke anzuwenden« Außerdem soll die Methode die gleichzeitige Bestimmung der Konzentration niedermolekularer Saccaride und der o{-Amylaseaktivität in der gleichen Meßprobe erlauben.

Darlegung des Wesenä der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es_? eine Enzymelektrode zur ampero-, metrischen Bestimmung der Aktivität von ?C-Amylase.und der ' Konzentration von Maltose und Stärke zu entwickeln«, Die erfindungsgemäße Enzymelektrode besteht aus einer Op- oder HgOg-anzeigenden Elektrode, die mit einer Enzymschicht aus Glukoseoxidase und Glukoamylase bedeckt ist. Zur Bestimmung von Maltose und ß( -Amylase wird diese Enzymschicht durch ei,- nen Dialyseschlaucii von der Meßlösung abgetrennt ₉ während zur Stärkebestimmung die Enzymschicht direkt mit der Meßlösung in Kontakt steht. Bei der Bestimmung der o<!-Amylaseaktivität in

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Gegenwart von Glukoamylase wird die Differenz zwischen dem Meßwert mit der GOD-Glukoamylase-Elektrode (Gesamtamylase) und einer nur G,OD-renthalt enden Enzymelektrode (Glukoamylaseaktivität) gebildet. Die Abtrennung der 13-Amylaseaktivität erfordert eine Hitzedesaktivierung dieses Enzyms,,

Q>( -Amyläse spaltet in Stärke 1 ,4- 06 -glykosidische Bindungen' im Inneren des Moleküls ₉ wodurch niedermolekulare Bruchstücke entstehen. Das Endprodukt des Abbaus ist Maltose. Während gelöste Stärke mit einem Molekulargewicht über 50,000 nicht ' durch Dialysemembranen passieren kann, gelangen die niedermolekularen Bruchstücke durch dieses "Sieb". Auf diese Weise ist eine Trennung des Substrates von den Reaktionsprodukten bzw« eine Bestimmung von Maltose in Gegenwart von Stärke mögliche Die erfindungsgemäße Enzymelektrode nutzt dieses Prinzip zum nachweis der in der ...Meßlösung gebildeten Reaktionsprodukte bei

oC -Amyläse sowie zur Messung von Maltose aus_o Die.Enzymschicht enthält die Enzyme Glukoamylase und Glukoseoxidase. Durch die Glukoamylase wird jeweils der endständige .Glukoserest der niedermolekularen Saccaride abgespaltet und durch die Glukoseoxidase erfolgt die Oxydation zu Glukonsäure unter Sauerstoffverbrauch· Der Sauerstoffverbrauch ist damit ein Maß für die Konzentration an niedermolekularen Saccariden in der Meßlösung bzw. seine zeitliche Änderung ist der o(-Amylaseaktivität proportional. Die Indikation des Meßwertes kann entweder auf der Messung des Sauerstoffverbrauches oder der Bildung von Wasserstoffperoxid mit einer Platinelektrode erfolgen. . Die erfindungsgemäße Enzymelektrode₉ die Glukoamylase und GIukoseoxidase enthält, gibt für Glukose oder Maltose ein stationäres Meßsignalj d_e h. sie zeigt die Konzentration dieser Zukker an. Damit ergibt sich aus dem Anfangswert der Stromzeitkurve die Konzentration von Glukose bzw. von Maltose _s während das Gebiet des linearen Anstiegs ein Maß für die Amylaseaktivität der Meßprobe darstellt*

In der eriindungsgemäßen'Enzymelektrode wi:...... c -s in cu,.:- '",:. :

ten enzymatischen Methode (D,. lT.ikolelis_s 1'. ., .:..· c· I a. ..;...,'..; ,. C'hem, 50,, 1,665, 19?3) benutzte Enzym Maltose durch'dia 10..U gere und stabilere _vGj.lucoamylau'e ersetzt* Dc;, durch wird c._e ?: B-liimajig von Stärke erst möglich*

Du3 Verfahren ^ur Bestimmung von Maltose „ χ -Amy la se und οϊ-ist gut handhabbars durch den Einsatz von .;.:;,-iyu:en spezifisc und durch deren Wiederverwendbarkeit

Ajigf uhr ungsbei spiele

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Aus führ ungs be is pi .3.:.; läutert werden.

Beispiel 1

4-00 IE Glukoseoxidase und 500 13 Glukoamylase v;e:^;a:;.;i lait A.c amid zu einem PiIm von 0₉1 mm Dicke und einer Flach? ."O/: δ c fotopolymerisiert«, Diese Enzymschicht wird auf eine unK^bair Op-Slektrode so aufgebracht, daß sich eine S;':2-.yinprobe vao 3 3.mm auf der Polyethylenmembran unmittelbar vor der ?iai.j..u.·...,) trode befindet.» Über die Enzymschicht wird eine folyure\;-;u-::. folie (siehe DDRr-PatentscJarift 131414) mit einem Spannring . den Elektrodenmantei gezogen.

Die präparierte Enzymelektrode taucht in die fit einem Ha_e;..;; rührer bewegte Meßlösung, sie^ist an ein ;··^Γ:. -Meter mit Sc^vber "angeschlossen. ie Meßzelle wird durch einen Xühlrj.antol auf 25⁰C temperiert„ In der Meßzelle befinde-,0. sich 2 -s:"· ei'-. Iprozentigen Stärkeic^:3ung_? die 0_s1 M Phosphatpuffer v\^. pV'. c enthält. Nachdem der Grundwert eingestellt wird, wird .Ir--Eichkurve durch Zugabe von ^ev-3i;^;.s 20 au einer· Gluko.-o.: ,;;,: mit. 250 mg/dl aufgenommene Dasu werden 5 succesive Zugaco. durchgeführt und die Eöhe des stationären V/,·...-tes ermittel"c,_a lach Erneuerung der Meßlösung erfolgt eine c.aloge Eichung mit .Maltose« Zur eigentlichen Messung wird .A:r.e Probe von 50 /Ul Serum zur Mcßlosung gegeben^ Die H ^;. ·:.·; 2 Signals^ -5·. sich aus der Extrapolation des Anx'angsansv:.,- ;·: ..nd des -ua.:v-}. auftretenden lineare.;! Gebietes ergibt^ lie~:-:,:^:v. -nit '-Ii'se :" ·· Sichkurve für Glukose, aie Glukose'jo^aentr?-¹ ' . ;,r Sariio-r ,

Aus dem Anstieg des linearen Gebietes wird die Maltosemenge, die je Zeiteinheit gebildet wird (z. B. im Zeitraum von 5 15 Mn. nach. Probenzugabe) über die Eichkurve für Maltose bestimmt. Die Aktivität der oC-Amylase ergibt sich unmittelbar aus diesem Wert.

Beispiel 2 . .

Analog zu Beispiel 1 erfolgt die Herstellung der Enzymschicht.*- Diese Enzymschicht wird auf eine Dialysemembran, aufgebracht,. die auf der Stirnseite eines Elektrodenmantels befestigt ist« Über der Enzymschicht wird eine weitere Dialysemembran sowie · eine Polyurethanfolie gespannt« Die weitere Präparation der Elektrode erfolgt.wie in Z.med.Lab.Diagnostik (18, 312 (1977)) beschrieben wurde. Die Elektrode.wird mit einem umgebauten ρOg-Meter auf 600· mV polarisiert. Nachdem der Grundstrom einen konstanten Wert eingenommen hat, wird eine Eichkurve für Maltose und Glukose, wie in Beispiel 1, aufgenommen. Danach werden 50. All eines mikrobiellen Enzympräparates zur Meßlösung zugesetzt. In Analogie zu Beispiel 1 ergibt der Anfangsteil der Stromzeitkurve die Maltosekonzentration, während das Ii- . neare Gebiet, das etwa 3 Minuten nach Probenzugabe auftritt·, die Amyläseaktivität liefert. Zur Abtrennung der Glukoamylaseaktivität wird die zeitliche Abhängigkeit der Glukosekonzentration mit einer Enzymelektrode gemessen, die nur Glukoseoxidase enthält» Über die Eichkurven für Glukose kann dann die Glukoamylaseaktivität von der Gesamtamylaseaktivität abgezogen werden.

Beispiel 3

40 IE Glukoseoxidase und 20 IE Glukoamylase werden mit 5 yul Glutaraldehyd an 6 cm Seide fixiert. Diese Enzymschicht wird direkt auf der Polyethylenmembran der in Beispiel 1 beschriebenen Og-^Elektrode befestigt .ohne daß ein Dialyseschlaucli zur Lösungsseite angebracht wird.

Die so präparierte Enzymelektrode taucht zur Stärkemessung in eine gerührte 0,1 ml Pufferlösung pH 5,5. Zur Eichung wurden '

definierte Mengen einer konzentrierten Zulkowski-Stärke-Lösung zugegeben. Als Meßwert dient entweder der stationäre Wert des Abfalls des O₂-Stromes oder die Anfangsneigung der Strom-Zeit-Kurve (kinetisches Prinzip). ' Die Bestimmung der Stärkekonzentration in den Proben erfolgt analog dazu über die Eichkurven. ;

2

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch ' .

   T. Enzymelektrode zur Bestimmung von Maltose, ^-Amylase und Stärke, gekennzeichnet durch eineO₂- oder H₂0p-anzeigende Elektrode, die mit einer Enzymschicht aus Glukoseoxidase und Glukoamylase bedeckt ist, welche ggf. mit einem Dialyseschlauch bedeckt ist.
2. 2*· Verfahren zur Bestimmung von Maltose und Amylase unter Einsatz der Enzymelektrode (mit Dialyseschlauch) nach Punkt 1, dd.gk., daß die Maltosekonzentration aus dem Anfangsteil J) der Stromzeitkurve und die C^-Amylaseaktivität, aus dem konstanten Anstieg bestimmt wird.