-
-
Beschreibung
-
Verfahren zur Bestimmung von « -Amylase Die Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Bestimmung von 4 -Amylase (nachfolgend einfach als Amylase bezeichnet)
in Proben mittels einer Enzymelektrode.
-
Bei Amylase handelt es sich um ein Enzym, das Polysaccharide, wie
Stärke, Dextrine,Glycogen oder Pektin, die in den Eingeweiden von Tier und Mensch
sowie in Pflanzen und Mikroorganismen vorkommen, zu Maltose abbauen. Da darüber
hinaus eine Diagnose verschiedener Leiden durch quantitative Amylasebestimmung in
lebenden Körperflüssigkeiten, wie Blut, möglich ist, hat die Amylasebestimmung in
jüngster Zeit gesteigerte Aufmerksamkeit erhalten.
-
Als Bestimmungsmethoden für Amylase stehen zur Verfügung (1) die amyloklastische
Methode, wobei der allmähliche Abbau von Stärke durch Amylase mittels der Jod-Stärke-Reaktion
verfolgt wird, (2) die saccharogene Methode, wobei das Reduktionsvermögen der durch
den Abbau mittels Amylase erzeugten Maltose bestimmt wird, und (3) die chromogene
Substratmethode, wobei eine kolorimetrische Bestimmung von löslichen Färbemitteln
erfolgt, die durch die Einwirkung der Amylase auf das Substrat freigesetzt werden,
d.h., unlösliche gefärbte Stärke, die mit dem Färbemittel verknüpft war, usw. Die
genannten Methoden, insbesondere in Fällen, wo es sich um lebende Körperflüssigkeiten
handelt,
lassen jedoch in ihrer Meßgenauigkeit zu wünschen übrig,
da verschiedene Stoffe, wie Harnstoff, Harnsäure, Proteine, Zucker und Vitamin C,
die in den Proben enthalten sind, die Messung stören und darüber hinaus die Analyse
kompliziert und langwierig machen.
-
Zur Uberwindung dieser Nachteile hat man kürzlich enzymatische Methoden
entwickelt. Hierzu gehören (4) die Maltose-Phosphorylase-Methode, wobei die Menge
an NADH (reduziertes Nikotinamid-adenin-dinucleotid) bestimmt wird, die letztlich
durch den Abbau der Maltose erzeugt wird, wobei letztere aus der Reaktion von löslicher
Stärke als Substrat mit Di -Amylase herrührt; hierzu finden eine Malophosphorylase
und die nachfolgenden drei Stufen enzymatischer Reaktionen unter Verwendung von
B-Phosphoglucomutase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und 6-Phosphorgluconsäure-dehydrogenase
Verwendung, und (5) die ot -Glucosidase-Methode, wobei die durch den Abbau von Maltose
mit 4 -Glucosidase erzeugte Glucose bestimmt wird.
-
Diese enzymatischen Methoden haben den Vorteil, daß sie, im Vergleich
zu den vorgenannten Methoden (1) bis (3) durch die Messung störende Stoffe nicht
beeinflußt werden, und zwar wegen der Spezifität des Enzyms für das Substrat.
-
Sie besitzen andererseits die Nachteile, daß Ganzblutbestimmungen
nicht möglich sind und die Analyse länger dauert, teure Analysereagentien, wie Enzyme
und Coenzyme, und aufwendige Apparaturen erfordert.
-
Eine weitere Methode zur Amylasebestimmung mittels Enzymelektroden
ist in der JP-OS 97863/81 beschrieben. Bei dieser Methode wird die Menge der ursprünglich
vorhandenen Glucose in einer Probe dadurch bestimmt, daß man die Probe zu einer
Substratflüssigkeit für die Amylase hinzufügt und die erhaltene Mischlösung mit
der ersten Enzymelektrode in Berührung bringt, die die Menge an Glucose messen kann,
und zur Bestimmung der Gesamtmenge an von
Maltose herrührender Glucose
und der ursprünglich vorhandenen Glucose dadurch bestimmt, daß man die Mischlösung
mit der zweiten Enzymelektrode in Berührung bringt, die die Mengen an Maltose und
Glucose messen kann, wodurch die Amylasemenge durch die Differenz der von den beiden
Enzymelektroden herrührenden Ausgangssignale gemessen wird. Diese Methode erfordert
zwei Enzymelektroden und ist darüber hinaus mit dem Problem einer außergewöhnlich
hohen endogenen Glucosekonzentration behaftet, was z.B. ein schlechtes S/N-Verhältnis
liefert, wenn Blutproben von Diabetikern Verwendung finden.
-
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Methode zur Amylasenbestimmung
zur Verfügung zu stellen, die Messungen an Ganzblutproben ermöglicht, durch die
Messung störende Stoffe nicht beeinträchtigt wird, eine hohe Meßgenauigkeit bei
kurzen Analysezeiten ermöglicht, analytisch einfach durchführbar ist, keine teuren
Analysereagentien erfordert und in einer einfachen Analyseapparatur durchführbar
ist.
-
ErfindungsgemäB wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur
Amylasebestimmung in Proben mittels einer Enzymelektrode, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man die Probe zu einer Pufferlösung hinzusetzt, die erhaltene Mischlösung
mit einer Enzymelektrode in Berührung bringt, die Glucose und Maltose messen kann,
um die Menge an ursprünglich in der Probe vorhandener Glucose zu bestimmen, dann
ein Amylasesubstrat zu der Mischlösung hinzusetzt zur Erzeugung von Maltose unter
Einwirkung der in der Probe vorhandenen Amylase, die Menge der Maltose mittels dieser
Elektrode mißt, die Gesamtmenge an von der Maltose herrührender Glucose und der
ursprünglich vorhandenen Glucose mißt, und dann die Amylasemenge aus der Differenz
zwischen der Gesamtmenge und der anfänglich vorhandenen Glucosemenge bestimmt.
-
Das Verfahren der Erfindung zur Amylasebestimmung in Proben mittels
einer Enzymelektrode ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung
zu der Probe hinzusetzt, die erhaltene Mischlösung mit einer Enzymelektrode in Berührung
bringt, die die Mengen an Glucose und Maltose messen kann (nachfolgend als Enzymelektrode
bezeichnet), um die ursprünglich in der Probe vorhandene Glucose zu messen, dann
ein Amylasesubstrat zu der Mischlösung hinzusetzt zur Erzeugung von Maltose mittels
der in der Probe enthaltenen Amylase, die Maltosemenge mittels der Elektrode mißt,
die Gesamtmenge an von Maltose herrührender Glucose und ursprünglich anwesender
Glucose mißt, und dann die Amylase aus der Differenz zwischen dieser Menge und der
anfänglich anwesenden Glucosemenge bestimmt.
-
Zur effektiven Nutzung der Bestimmungsspezifität wird erfindungsgemäß
eine einzige Enzymelektrode verwendet.
-
Das Meßprinzip ist anhand der nachfolgenden Enzymreaktionen erläutert.
-
Saccharide + nH20
n Maltose (Stärke u.dgl.) + Oligosaccharide (I) Ot-MaltQse + H2 0
2 Glucose (11) Glucose + H20 + 02
Gluconsäure + H202 (III) Mit anderen Worten, bei der Bestimmung von Glutose wird
bei der Oxidation von Glucose mit Glucoseodydase Sauerstoff, 02 verbraucht und Wasserstoffperoxid,
H202 gebildet (Gleichung III). Sauerstoff und Wasserstoffperoxid sind im Gegensatz
zu Glucose einer elektrochemischen Messung zugänglichJund und deshalb läßt sich
die Glucosekonzen-
tration indirekt durch die elektrochemische Messung
der Sauerstoffabnahme oder der Wasserstoffperoxidzunahme bestimmen, die die Reaktionen
begleiten. Bei der Bestimmung der Maltose wird d -Maltose, die aus Sacchariden (Substrat)
unter Einwirkung der Amylase in der Probe gemäß Reaktionsgleichung (I) gebildet
wird, unter Einwirkung des Enzyms oC -Glucosidase mit Wasser gemäß Reaktionsgleichung
(II) unter Bildung von 2 Mol Glucose umgesetzt, worauf die Glucose unter Einwirkung
des Enzyms Glucoseoxidase mit Wasser und Sauerstoff gemäß Reaktionsgleichung (III)
unter Bildung von Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. In diesem Fall
ist es genau das gleiche wie bei der Messung der Glucose, nämlich daß die Glucosemenge
indirekt durch die elektrochemische Messung der Zunahme der Wasserstoffperoxidmenge
oder der Abnahme der Sauerstoffmenge gemessen werden kann. Die hier gemessene Glucosemenge
ist die Gesamtmenge an Glucose aus °C-Maltose, die aus dem Substrat unter der Einwirkung
der Amylase gebildet worden ist, und der ursprünglich in der Probe vorhandenen Glucose.
Aus der Differenz zwischen dem Ausgangssignal aus der Messung der Maltose, die der
Gesamtglucosemenge entspricht, und dem Ausgangssignal, das der anfänglichen Glucosemenge
entspricht, wird die Amylase bestimmt.
-
Die erfindungsgemäß verwendete Enzymelektrode besteht aus einer immobilisierten
Enzymmembran, bei der Glucoseoxidase und « -Glucosidase immobilisiert sind, und
einem Meßwertwandler, der auf elektrochemischem Weg die unter der katalytischen
Einwirkung der Enzyme in der chemischen Reaktion gebildeten oder abgebauten Stoffe
bestimmen kann.
-
Als Meßwertwandler können marktübliche galvanische oder polarographische
Sauerstoffelektroden oder polarographische Peroxidelektro den dienen.
-
Erfindungsgemäß geeignete Substrate sind Polysaccharide, wie lösliche
Stärke, Amylose, Amylopectin, und Oligosaccharide,
wie Maltopentaose
und Maltotetraose, wobei Oligosaccharide im allgemeinen bevorzugt sind. Diese werden
im allgemeinen in einer Pufferlösung gelöst und in Form einer wäßrigen Lösung verwendet.
-
Erfindungsgemäß sind alle Pufferlösungen geeignet, soweit sie einen
pH-Bereich aufweisen, der dem stabilen Bereich der drei Enzyme Amylase, cL -Glucosidase
und Glucoseoxidase angehört. Phosphatpufferlösungen sind geeignete Beispiele.
-
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen erläutert.
Es zeigen: Fig. 1 in schematischer Darstellung eine erfindungsgemäß verwendete Enzymelektrode,
Fig. 2 die Veränderung des erfindungsgemäß erhaltenen Ausgangssignals, und Fig.
3 die Stromabhängigkeit von dem -Glucosidase/Glucoseoxidase-Aktivitätsverhältnis.
-
Fig. 1 zeigt eine Sauerstoff- oder Wasserstoffperoxidelektrode 1 mit
einer Meßoberfläche 2. Eine Enzymmembran 4, in der zwei Enzyme, o( -Glucosidase
und Glucoseoxidase, immobilisiert sind (nachfolgend als Enzymmenbran bezeichnet)
ist mittels eines O-Rings 3 außerhalb der MeBoberfläche 2 der Sauerstoff- oder Wasserstoffperoxidelektrode
1 befestigt. Die Elektrode besitzt eine Zuführung 5. Die Enzymelektrode ist mit
einer Meßzelle verbunden, die mit Thermostat und Rühreinrichtung ausgerüstet ist.
Eine bestimmte Menge Phosphatpufferlösung wird der Meßzelle zugesetzt, die bei konstanter
Temperatur im Bereich von 30-400C unter Rühren gehalten wird. Wird in die Zelle
eine Probe injiziert, so kommt in der Probe anfänglich vorhandene
Glucose
mit der Enzymmembran 4 in Berührung, wodurch die Reaktion gemäß Reaktionsgleichung
(III) ausgelöst wird.
-
Wenn eine bestimmte Menge des Substrats zugesetzt wird, nachdem der
Stromwert des Ausgangssignals etwa einen konstanten Wert erreicht hat, wird die
Reaktion gemäß Reaktionsgleichung (I) unter der Einwirkung der Amylase in der Probe
unter Bildung von k -Maltose ausgelöst. Diese i -Maltose kommt mit der Enzymmembran
4in Berührung, wodurch die in den Reaktionsgleichungen (II) und (III) dargestellten
Reaktionen ausgelöst werden. Der Anstieg des Stromwertes, der das Ausgangssignal
zu dieser Zeit darstellt, wird durch die Einwirkung der X -Amylase hervorgerufen.
Die Veränderungen dieser Stromwerte sind in Fig.2 dargestellt. In Fig. 2 ist t der
Zeitpunkt der Einspritzung der Probe und t1 der Zeitpunkt der Substratzugabe. il
ist der Stromwert, der von anfänglich in der Probe vorhandener Glucose und Maltose
herrührt, und der hierüber hinausgehende Stromanstieg rührt von der Amylase her.
Die Amylasemenge kann dadurch bestimmt werden, daß man die Stei-#i#t gung der Stromwerte
d t bestimmt.
-
Bei der Enzymmembran der Enzymelektrode ist es bevorzugt, daß 4 -Glucosidase
und Glucoseoxidase immobilisiert sind in einem Aktivitätsverhältnis von 1/2 bis
1/20. Das Aktivitätsverhältnis kann hierbei als IU-Verhaltnis zwischen den Enzymen
angesehen werden. Zur Festlegung des Aktivitätsverhältnisses zwischen den beiden
Enzymen in der Enzymmembran können die beiden Enzymarten vor der Immobilisierung
in dem gewünschten Aktivitätsverhältnis vermischt und dann, so wie sie sind, immobilisiert
werden. In dem genannten Bereich beobachtet man eine Zunahme des Ausgangswertes
des Sensors, wie in Fig. 3 dargestellt.
-
Fig. 3 zeigt diesen Sensor-Ausgangswert, wenn eine Enzymelektrode
mit einer eC -Glucosidase/Glucoseoxidase-Enzymmembran in verschiedenen Verhältnissen
in eine Durchflußzelle eingebaut wird, der Durchfluß 0,1 Mol/ e Phosphat-
pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,0 beträgt und 10 A Liter wäßrige Maltoselösung mit einer
Maltosekonzentration von 200 mg/dl eingespritzt werden.
-
Darüber hinaus ist es selbstverständlich möglich, eine quantitative
Amylasebestimmung nach dem Verfahren der Erfindung selbst dann durchzuführen, wenn
man eine Enzymmembran verwendet, in der die beiden Enzyme in einem Mischungsverhältnis
außerhalb des bevorzugten Bereiches vorliegen.
-
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
-
Beispiel 1 Es wird eine Acetylcellulose-Enzymmembran verwendet, in
der oL -Glucosidase und Glucoseoxidase nach dem in der US-PS 4 307 195 beschriebenen
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymmembranen immobilisiert sind.
-
Die erhaltene Enzymmembran-besitzt eine Dicke von 30 ßm, eine Aktivität
an o( -Glucosidase von 2 IU/cm2 und eine Aktivität an Glucoseoxidase von 5 IU/cm2.
Diese Enzymmembran wird mit einer Wasserstoffperoxidelektrode ausgerüstet, wobei
man eine Enzymelektrode erhält. Diese Elektrode wird in eine mit Rühreinrichtung
und Thermostat ausgerüstete Meßzelle eingebaut. Die Meßzelle wird konstant bei 370C
gehalten und mit 350 ij Liter einer 0,1 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gefüllt.
In diese Zelle werden 25 ß Liter geprüftes Serum gegeben, das die Amylase als Probe
und 80 mg/dl Glycose enthält. Zu diesem Zeitpunkt beträgt t1 20 sec. und i1 100
nA in Fig.2.
-
Wenn 10 A Liter Maltopentaose in einer Konzentration von 1,5 x 1aO
Mol/t zum Zeitpunkt t1 zugesetzt werden, beträgt n 5 nA/min.
-
Beispiel 2 Es wird eine-Enzymmembran mit einem Aktivitätsverhältnis
von -Glucosidase zu Glucoseoxidase von 1/5 gemäß Beispiel 1 hergestellt. Ein geprüftes
Serum wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 untersucht. Zu diesem Zeitpunkt hat
t einen Wert von 15 sec., i beträgt 100 nA und 4 ist 10 nA/min in Fig. 2.
-
Beispiel 3 Ein Blutserum wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1
untersucht und gleichzeitig wird die Probe nach der Jod-Stärke-Methode (eine Art
chromogene Substratmethode) analysiert, die häufig zu Vergleichszwecken herangezogen
wird. Hierbei beträgt der Korrelationskoeffizient 0,995 (n = 20), was bedeutet,
daß das erfindungsgemäß erhaltene Ergebnis sehr gut mit der konventionellen Methode
übereinstimmt.
-
Wie vorstehend dargelegt, kann nach dem Analysenverfahren der Erfindung
im lebenden Körper enthaltene Amylase in einer einfachen Methode und in unkomplizierten
Apparaturen ohne Verwendung teurer Analysereagentien in kurzer Zeit bestimmt werden.
Darüber hinaus wird das Analysenergebnis nicht durch anfänglich vorhandene Glucose,
Maltose und andere die Messung beeinträchtigende Stoffe beeinflüßt, weshalb eine
ausgezeichnete Meßgenauigkeit gegeben ist.
-
Das Verfahren der Erfindung ist deshalb sehr gut auf dem Gebiet der
klinischen Untersuchungen zur Bestimmung von Amylase im lebenden Körper geeignet
und erleichtert hierbei die Diagnose. Selbstverständlich lassen sich nach dem Verfahren
der Erfindung nicht nur Amylase, sondern auch Glucose, Maltose und Glucose und Maltose
erzeugende Stoffe bestimmen.