DD291846A5

DD291846A5 - Verfahren zur empfindlichen bestimmung von substanzen mit einem biosensor

Info

Publication number: DD291846A5
Application number: DD33734490A
Authority: DD
Inventors: Florian Schubert; Frieder Scheller; Gillis Johansson; Dorothea Pfeiffer; Juergen Lutter
Original assignee: Adw Ddr; Chemical Center University Of
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 1991-07-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur empfindlichen Bestimmung von Substanzen mit einem Biosensor. Anwendungsgebiet ist u. a. die chemische Analytik, die klinische Diagnostik, die Lebensmittelindustrie und Biotechnologie. Das Verfahren wird mit einem Biosensor mit immobilisierten, sequentiell wirkenden Enzymen durchgefuehrt, der in eine Meszloesung taucht, zu der erfindungsgemaesz das Cosubstrat der Indikatorenzymreaktion 2-60 Minuten nach Zusatz der zu bestimmenden Substanz gegeben wird.{Verfahren; Biosensor; immobilisierte, sequentiell wirkende Enzyme; Meszloesung; Cosubstrat}

Description

Diese Reaktion wird am Transduktor angezeigt, z. B. durch elektrochemische Oxidation des Coprodukts oder durch angekoppelte Oxiclasoroaktionen mit einer Sauerstoffelektrode. Durch die Produktakkumulation ist mit dom Verfahren die Analytbestimmung mit hoher Empfindlichkeit möglich. Als Enzyme werden beispielsweise Glucosedehydrogenaso, Lactatdehydrogenase und Lactatmonooxygenase verwendet. Glucosedehydrogenase katalysiert die Oxidation des Analyten Glucose mit NAD⁺ unter Bildung von NADH. Nach einer Reaktionszeit von 12-18 Minuten wird das in der Enzymschicht akkumulierte NADH mittels Start durch Pyruvatzugabe in der gekoppelten Indikatorreaktion:

NADH + Pyruvat + H⁺ -> Lactat + NAD⁺ ' Lactat + O₂ -> Acetat + CO₂ + H₂O

oxidiert. Der Sauerstoffverbrauch wird mit einer O₂-Elektrode angezeigt.

Anstelle von Glucosedehydrogenase werden beispielsweise zur Analyse von Glycerol, Glutamat oder Glucose-6-phosphat die entsprechenden Dthydrogenasen verwendet. Als Indikatorenzym wird auch Diaphorase und als Cosubstrat dann Kaliumferricyanid verwendet. Zur Bestimmung von ADP verwendet man die Enzyme Pyruvatkinase, Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Erfindungsgomäß wird das Cosubstrat Glucose 15-25 Minuten nach Zusatz des Analyten ADP in die Meßlösung gegeben.

Der Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Möglichkeit, mit einem Biosensor mit geringem Analysenaufwand unter Anwendung des Akkumulationsprinzips sehr empfindlich 'tie Konzentration von Substanzen bestimmen zu können.

Ausführungsbeispiele

1. Beispiel

In einer Polyurethanschicht aus einer Dialysemembran werden 0,3mg (70U) Glucosedehydrogenase, 0,1 mg (94U) Lactatdehydrogenase undO,7mg (8,5U) Lactatmonooxygenase immobilisiert. Die Membran wird, die Enzyme dabei in Richtung zur Elektrode, auf der Polyethylenfolie einer Sauerstoffelektrode mit einem O-Ring fixiert. Die Elektrode wird an einen Polarographen mit Schreiber angeschlossen und auf -0,6V polarisiert. Der so pärparierto Biosensor taucht in 2 ml auf 25⁰C thermostatierten, gerührten 0,1 M Tris-HCI-Puffer, pH7,0, mit 1OmM MgCI₂ und 1 mM NAD⁺. Wenn sich ein stationärer Grundstrom eingestellt hat, werden 20 plainer wäßrigen Glucoselösu ng zugegeben. Nach 15 min werden 20 μΙ einer wäßrigen 0,1 M Pyruvatlösung zugegeben. Der Strom fallt ab und durchläuft ein Minimum. Die Meßzelle wird entleert, gespült und für die nächste Messung gefüllt. Auf diese Weise werden Glucose-Standardlösungen von 1 mM, 2mM, 3mM,5mM und 8mM gemessen und aus den Differenzen des Grundstroms und der jeweiligen Strom-Minima wird eine Kalibrationskurve für Glucose gebildet. Zur Analyse einer Fermentationsprobe werden 20μΙ der Probe in die Meßlösung gegeben und nach 15min wird mit Pyruvat gestartet. Aus dem Strompeak kann mit Hilfe der Eichkurve die Glucosekonzentration in der Probe ermittelt werden.

2.Beispiel

30 U Glucose-6-phosphatdehydrogenase, 15 U Hexokinase und 15 U Pyruvatkinase werden in 5%iger Gelatine immobilisiert. Die Enzymmembran wird auf einer Polyethylenmembran-bedeckten Clark-Sauerstoffelektrode mit Hilfe eines 0-Ringes fixiert. Der Sensor wird an ein pO₂-Meter angeschlossen. Alle Stromänderungen werden mit einem Schreiber registriert.

Der so vorbereitete Sensor taucht in 2 ml einer 0,1 M Tris-Pufferlösung, pH7,5, die 1OmM MgCI₂,1OmM KCI, 1,5mM Phenazinmethosulfat und 1,5 mM NADP⁺ enthält. Nach Einstellung des Grundstromes werden 20 μΙ wäßriger ADP-Lösung zur Meßlösung gegeben. 20 Minuten später wird durch Zugabe von 1 mM Glucose die Anzeigereaktion gestartet. Der Strom fällt ab und der im Strom-Zeit-Verlauf auftretende Peak dient als Meßsigna!. Zwischen den Messungen v/ird die Maßzelle mit Pufferlösung gespült.

Mit je 20μΙ 0,2mM, 0,4mM, 0,6mM, 0,8mM und 1 mM ADP-Lösungen wird eine Eichkurve aufgenommen. Der so kalibrierte Sensor wird zur Analyse von Lösungen unbekannter ADP-Konzentration eingesetzt. Dazu werden 20 μΙ der Probe in die Meßlösung injiziert. Nach 20 Minuten wird Glucose zugegeben und über die Größe des Strompeaks die ADP-Konzentration ermittelt.

Claims

1. Verfahren zur empfindlichen Bestimmung von Substanzen mit einem Biosensor mit immobilisierten, sequentiell wirkenden Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Biosensor mit den immobilisierten, sequentiell wirkenden Enzymen (Akkumulatorenzyme und Indikatorenzyme) in eine Meßlösung taucht, zu der das Cosubstrat der Indikatorenzymreaktion 2-60 Minuten nach Zusatz der zu bestimmenden Substanz (Analyt) gegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Enzyme Glucosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase und Lactcitmonooxygenase das Cosubstrat Pyruvat 12-18 Minuten nach Zugabe des Analyk'n Glucose in die Meßlösung gegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung der Enzyme Pyruvatkinase, Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase das Cosubstrat Glucose 15-25 Minuten nach Zusatz des Analyten ADP in die Meßlösung gegeben wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur empfindlichen Bestimmung von Substanzen, wie Glucose, Glucose-6-phosphat, Glutamat, Glycerol, ADP, Phosphoenolpyruvat oder Creatinphosphat. Das Verfahren kann in der chemischen Analytik, insbesondere in der klinischen Diagnostik, Lebensmittelindustrie, Biotechnologie und biochemischen Forschung angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In der Analytikwerden in zunehmendem Maße Biosensorenzur Bestimmung von Substanzen eingesetzt. Sie enthalten meist nur ein Enzym, das die Umwandlung der zu bestimmenden Substanz (Analyt) katalysiert, wobei sich eine physikochemische Größe verändert, z. B. die Konzentration eines Cofaktors. Diese Größe, die mittels eines Transduktors (z. B. Elektrode, ionensensitiver Feldeffekttransistor) angezeigt wird, liefert ein Maß für die Analytkonzentration. Die untere Bestimmungsgrenze solcher Biosensoren liegt bei amperometrisclier Anzeige bei 10 μΜ und für Feldeffekttransistoren bei 500 μΜ. Höhere Empfindlichkeiten werden mit Verstärkungssystemen erreicht. Kulys et al. (Enzyme Microb. Technol. 3 (1981 ] 344) haben zur Verstärkung des Meßsignals für NADH eine Dehydrogenase in Kombination mit einem autoxidablen Mediator verwendet und dem Sauerstoffverbrauch bei der Autoxidation angezeigt. Hierbei wird keine sehr hohe Empfindlichkeit erreicht, da die nichtemzymatische Reaktion langsam abläuft. Eine wesentliche Empfindlichkeitssteigerung wurde mit Biosensoren mit zwei Enzymen erreicht, von denen das zweite die Umsetzung des Reaktionsprodukts des Analyten zurück zum Analyten katalysiert, der dann vom ersten Enzym wieder umgewandelt wird usw. (PS DD 222896,222897, 248605,248606, U.Wollenberger et al.. Anal. Lett. 20 (1987] 657). Mit dieser Methode der Rezyklisierung werden Bestimmungsgrenzen im nanomoiaren Konzentrationsbereich erzielt. Ihr Nachteil besteht jedoch darin, daß grundsätzlich sowohl der Analyt als auch sein Produkt angezeigt werden. Da in vielen realen Proben beide Stoffe vorliegen, ist eine Messung der wahren Analytkonzentration nicht ohne komplizierte Separation oder Differenzmessung möglich.

Höhere Empfindlichkeiten wurden auch durch Akkumulation der Reaktionsprodukte und ihren nachfolgenden elektrochemischen Nachweis erreicht (sogenanntes Stripping, J. J. Kulys et al., Anal. Chim. Acta 138(1982119). Dieses Verfahren ist jedoch aufwendig und elektrochemischen Interferenzen unterworfen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Empfindlichkeit bei der Bestimmung von Substanzen mittels Biosensoren zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, mit dem die einfache, empfindliche Bestimmung der Konzentration von Substanzen mit einem Biosensor möglich ist. Der Biosensor enthält ein Enzym, das die Umsetzung des Analyten katalysiert (Akkumulatorenzym) und ein oder mehrere Enzyme, die die Umsetzung eines Produkts dieser Reaktion unter Anzeige am Transduktor katalysieren (Indikatorenzym(eJ). Erfindungsgemäß wird das Cosubstrat der Reaktion des Indikatorenzyms zu einem definierten Zeitpunkt nach Zugabe des Analyten zur Meßlösung gegeben. Das Zeitintervall beträgt 2 bis 60 Minuten. Die Erfindung soll im weiteren noch näher erläutert werden. Nach Zugabe des Analyten zur Meßlösung wird dieser in der Reaktion des Akkumulatorenzyms zu einem Produkt umgewandelt:

Analyt -> Produkt.

Die Menge an Produkt in der Schicht des immobilisierten Enzyms steigt mit der Zeit bis zur Einstellung eines stationären Zustande

Erfindungsgemäß wird nach e'ner bestimmten Zeit die Indikatorenzymreaktion durch Zugabe ihres Cosubstrats gestartet:

Produkt + Cosubstrat -> Produkt 2 + Copiodukt.