DE4314417A1

DE4314417A1 - Biosensor

Info

Publication number: DE4314417A1
Application number: DE19934314417
Authority: DE
Inventors: Frieder Prof Dr Scheller; Ulla Dr Wollenberger; Alexander Dr Makower
Original assignee: Byk Gulden Italia SpA
Current assignee: SCHELLER, FRIEDER, PROF. DR., 16341 ZEPERNICK, DE
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1993-05-03
Publication date: 1994-11-10

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Biosensoren zur Bestimmung von Mediatoren, bei denen Laccase als den Mediator oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den Media tor reduzierenden Enzym vor einer Sauerstoffelektrode aufgebracht sind.

Stand der Technik

In der DD-PS 2 80 790 wird ein Biosensor zur Bestimmung von elektrochemisch aktiven Mediatoren wie z. B. Hydrochinon, Ferrozyanid oder Ferrocenderivaten vorgeschlagen, bei dem auf der Oberfläche einer Sauerstoffelektrode ein den reduzierten Mediator unter Sauerstoffverbrauch oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den oxidierten Mediator reduzierenden Enzym aufgebracht sind. Als den Mediator oxidierendes Enzym werden Laccase oder Peroxidase angegeben. Für die Reduktion des oxidierten Mediators werden Cytochrom b₂, Glucoseoxi dase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase als in Frage kommend offenbart. Die Fixierung der Enzyme auf der Sauerstoffelektrode erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Immobilisierung in Membranen. Der zu bestimmende reduzierte Mediator wird unter Sauerstoffverbrauch durch Lacca se oxidiert. Durch das zweite immobilisierte Enzym wird der oxidierte Me diator unter Substratverbrauch wieder reduziert und steht dann für eine er neute Oxidation zur Verfügung. Dieser Zyklus läuft so lange wie Substrat des den Mediator reduzierenden Enzyms in der Meßlösung vorhanden ist. Durch diese kontinuierliche Rezyklisierung des Mediators wird ein Vielfaches der Sauerstoffmenge verbraucht die zur Oxidation der in der Meßlösung vorhande nen Menge an Mediator notwendig wäre. Die Anzeige des Sauerstoffverbrauches über eine Sauerstoffelektrode bei - 600 mV (vs Ag/AgCl) führt deshalb zu einer höheren Empfindlichkeit für die Mediatoren als bei der direkten elek trochemischen Anzeige des reduzierten bzw. oxidierten Mediators. In der DD-PS 2 80 790 wird auch angegeben, daß die Mediatoren durch enzymatische Reaktionen gebildet werden können und über die Bestimmung der gebildeten Mediatoren dann die Enzymaktivität ermittelt werden kann.

Die Biosensoren nach dem Stand der Technik weisen eine Reihe von Nachteilen auf. So zeigte es sich, daß Cytochrom b₂ in Verbindung mit Laccase in der Praxis eine zu geringe Arbeitsstabilität zeigt und wegen der niedrigen spe zifischen Aktivität eine Verstärkung nur bis zu einem Faktor von etwa 200 erreichbar ist. Diapharase als Enzympartner für Laccase hat den Nachteil, daß als Coreaktand ein Überschuß des sehr teuren NADH benötigt wird. Bei Verwendung der Enzympaare Laccase mit Glucoseoxidase, Lactatoxidase und Glutamatoxidase erhält man Biosensoren, die jeweils nur für wenige Mediato ren geeignet sind, da Laccase Sauerstoff benötigt, während bei den Oxidasen eine Konkurrenz zwischen Sauerstoff und Mediator die Recyclisierung ab schwächt.

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mediatoren rezyklisierende Bi enzymelekroden zur Verfügung zu stellen, die diese Nachteile nicht aufwei sen.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Bienzymsensoren, bei denen das Enzympaar Laccase und Oligosacchariddehydrogenase und als Mediator p-Aminophenol verwendet werden, sich durch eine große Unempfindlichkeit ge genüber internen störenden Nebenwirkungen und einen hohen Verstärkungsfak tor auszeichnen.

Gegenstand der Erfindung sind daher Biosensoren zur Bestimmung von Mediato ren, bei denen Laccase als den Mediator oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den Mediator reduzierenden Enzym vor einer Sauerstoffelektrode aufge bracht sind, dadurch gekennzeichnet, daß als Mediator p-Aminophenol (AP) und als den Mediator reduzierendes Enzym Oligosacchariddehydrogenase (ODH) zugegen sind.

Weitere Gegenstände ergeben sich aus den Patentansprüchen.

Als Substrat für die Oligosacchariddehydrogenase werden Oligosaccharide eingesetzt, sowie Glucose. Die Oligosaccharide werden hierbei zu den ent sprechenden Lactonen oxidiert, wobei die durch Laccase-Katalyse gebildete oxidierte form des Mediators reduziert wird. Der Mediator p-Aminophenol wird unter Sauerstoffverbrauch zu Quinonimin oxidiert, das wieder zu Amino phenol reduziert wird.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Biosensoren besteht darin, daß die Co substrate Glucose und Sauerstoff der beiden Enzyme in den üblichen klini schen Untersuchungsproben (z. B. Blut oder Serum) in ausreichender Menge vorhanden sind. Die überraschend hohe Verstärkung wird daher erreicht, ohne daß ein Zusatz von Cosubstraten erforderlich ist.

Zur Herstellung der Elektroden wird eine Bienzymschicht auf der Polyethy lenmembran einer Sauerstoffelektrode fixiert und mit einer Cellulose-Di alysemembran abgedeckt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden auf einer Gelatinemembran 300 bis 400, vorzugsweise 330 bis 370 Einheiten pro cm² ODH und 6000 bis 8000, vorzugsweise 6600 bis 7400 Einheiten /cm² Lacca se fixiert. Bei einem Potential von - 600 mV wird der Sauerstoffverbrauch als stationäre oder differentielle Strom/Zeit-Kurve verfolgt.

Die Enzyme sind käuflich erhältlich. Beispielsweise ist Laccase von Pyricu laria oryzae mit einer Aktivität von 144 U/mg Feststoff bei der Sigma Chem. GmbH, Deutschland zu beziehen. Laccase von Polyporus versicolor mit einer Aktivität von 3500 U/mg lyophylisierten trockenen Pulvers wurde vom Armeni schen Institut für Biochemie, Eriwan erhalten. ODH von Staphylococcus spec. mit einer Aktivität von 170 U/mg kann von Toyo Jozo, Japan, bezogen werden.

Die günstigste Verstärkung erreicht man bei einem pH-Wert von 5,5 in phos phatgepufferter Lösung. Die Rezyklisierung ist abhängig von der Konzentra tion des Substrats von ODH. Im falle von Glucose tritt oberhalb einer Kon zentration von 0,4 mmol/l keine weitere Verstärkung mehr ein.

Eine Linearität zwischen Signal und Menge an Aminophenol wird bis zu einer Konzentration von 1,5 mmol/l p-Aminophenol in Abwesenheit von Glucose be obachtet. In Gegenwart von Glucose, d. h. wenn die Verstärkung durch Rezyk lisierung möglich ist, wird eine Linearität bis zu einer Konzentration von 0,5 mmol/l festgestellt. Die geschätzten Empfindlichkeiten im linearen Kon zentrationsbereich betragen 33 nA l/mmol bei Abwesenheit von Glucose und 82500 nA l/mmol im falle der Verstärkung durch Glucose. Man erhält also einen Verstärkungsfaktor von 2500. Bei Verwendung von Hydrochinon gemäß dem Stand der Technik anstelle von p-Aminophenol als Mediator, beobachtet man dagegen einen Verstärkungsfaktor von nur 170. In Gegenwart von Glucose kann p-Aminophenol bis zu 5 mmol/l bestimmt werden.

Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß p-Aminophenylphosphat weder mit noch ohne Glucose zu einem detektierbaren Signal führt. Dies erlaubt die Konstruktion von pseudohomogenen Sandwich Enzym-Immunoassays. Ein er ster spezifischer Antikörper für einen Analyten wird auf der Bienzymelek trode immobilisiert. Ein zweiter für den Analyten spezifischer Antikörper wird mit alkalischer Phosphatase markiert. Durch Bestimmung der durch die alkalische Phosphatase freigesetzten Menge an p-Aminophenol aus zugesetztem p-Aminophenylphosphat kann auf die Menge des Analyten geschlossen werden. Es steht damit eine äußerst empfindliche Methode für die Bestimmung von Analyten zur Verfügung, die nur eine kurze Inkubationszeit und ein geringes Probenvolumen benötigt.

Claims

1. Biosensoren zur Bestimmung von Mediatoren, bei denen Laccase als den Mediator oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den Mediator reduzierenden Enzym vor einer Sauerstoffelektrode aufgebracht sind, dadurch gekennzeich net, daß als Mediator p-Aminophenol (AP) und als den Mediator reduzierendes Enzym Oligosacchariddehydrogenase (ODH) zugegen sind.

2. Biosensoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat des Enzyms Oligosacchariddehydrogenase Glucose zugesetzt wird.

3. Verwendung der Biosensoren nach Anspruch 1 für pseudohomogene Immuno assays, bei denen ein erster spezifischer Antikörper für einen Analyten auf dem Biosensor immobilisiert ist, und in der zu bestimmenden Probe ein zwei ter für den Analyten spezifischer, mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper sowie p-Aminophenylphosphat zugegen sind.