DD280790A1 - Biosensor und verfahren zur bestimmung von mediatoren - Google Patents

Abstract

Biosensor und Verfahren zur Bestimmung von Mediatoren. Anwendungsgebiet ist die medizinische Diagnostik. Der Biosensor ist dadurch gekennzeichnet, dass vor einer Sauerstoffelektrode ein den Mediator oxidierendes und ein den Mediator reduzierendes Enzym aufgebracht sind. Als mediatoroxidierendes Enzym wird Laccase oder Peroxidase, als mediatorreduzierendes Enzym wird Cytochrom b2, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase verwendet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zur Bestimmung von elektrochemisch aktiven Medi atoren, z. B. Hydrochinon, Ferrozyanid oder Ferrocenderivaten. Dor Biosensor und das Verfahren eignen sich besonders zur elektrochemischen Messung der Aktivität hydrolytischer Enzyme, z. B. von alkalischer Phosphatase und Esterasen. Das Verfahren ist vor allem für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik, zur Enzymaktivitätsbestimmung oder für Enzymimmunoassays geeignet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die untere Nachweisgrenze für die amperometrische Bestimmung von Mediatoren liegt bei etwa 1 μιηοΙ/Ι. Wasaetal. (J.Chem. Soc. Jpn (1984), 1397) erzielten für die elektrochemische Bestimmung von Diphenolen (z.B. Hydrochinon [HQ]) durch elektrochemische Rezyklisierung eine Steigerung der Empfindlichkeit um den Faktor 10-20, indem sie das Enzym Laccase (EC 1.10.3.2) an der Oberfläche einer Kohleelektrode fixierten. Dieses Enzym oxidiert HQ zu Benzochinon (BQ) unter Verbrauch von Sauerstoff. An der Elektrode wird das BQ wieder zu HQ reduziert, so daß es wieder durch die Laccase oxidiert werden kann. Solche „katalytischen Ströme" sind auch von anderen Enzymen, z.B. Katalase (mit H₂O₂), gefunden woiden. Die empfindliche Bestimmung von Substraten und Kofaktoren mittels enzymatischer Rezyklisierung ist Gegenstand des DD-WP 222896 und beschrieben in Schubert et al.. Anal. Chim. Acta 169 (1985) 391. Für die elektrochemische Bestimmung der Enzymaktivitäten über die Anzeige der Bildungsgeschwindigkeit von Mediatoren sind bei den bekannten Nachweismethoden lange Vorinkubationszeiten oder große Probenvolumina notwendig.

Ziel der Erfindung

Ziel der ^rrfindung ist es, die nachweisbare Menge an Mediatoren und damit die Zeil bzw. das Probevolumen bei der Messung von F ymaktivitäten zu reduzieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biosensor und ein Verfahren zur Bestimmung von Mediatoren, wie Hydrochinon oder andere Diphenole, Ferrocyanid sowie Ferrocen und seine Derivate, und damit von Hydrolasen zu entwickeln. Dabei soll die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbessert werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mii einem Biosensor gelöst, der auf der Oberfläche einer Sauerstoffelektrode ein den reduzierton Mediator unter Sauerstoffverbrauch oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den oxidierten Mediator reduzierendes Enzym enthält. Als den reduzierten Mediator oxidierendes Enz°.~n wird Laccase oder Peroxidas verwendet. Als den oxidierten Mediator reduzierendes Enzym wird Cytochrom b₂, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase verwendet. Die Fixierung erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Immobilisierung in Membranen. Der Biosensor taucht in eine übliche gerührte Meßlösung. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der Meßvorlage das Substrat des den Mediator reduzierenden Enzyms im Überschuß zugesetzt wird. Durch Wahl der Substratvorlage in einem limitieranden Konzentrationsbereich werden die Rezyklisierung des Mediators und damit die Empfindlichkeit gezielt gesteuert. Die Substratkonzentration liegt zwischen 10 μιηοΙ/Ι und 10mmol/l. Das ist dann von Bedeutung, wenn mit einem Sensor über ein weites Konzentrationsgebiet Mediatorbestimmungen durchgeführt werden sollen.

Der zu bestimmende reduzierte Mediator wird unter Sauerstoffv :rbrauch durch E1 (Gl. 1) enzymatisch oxidiert. Durch das zweite immobilisierte Enzym, E 2 (Gl. 2) wird der Mediator unter Substratverbrauch und Produktbildung wieder reduziert und kann deshalb erneut oxidiert werden. Durch diese kontinuierliche Rezyklisierung des Mediators wird, verglichen mit der Konzentration des ursprünglichen vorliegenden reduzierten Mediators, ein Vielfaches von Sauerstoff verbraucht.

:·:ϊ·οιϊ + U₀ -ώ!-^ :_{ij0X +} T₁^Q

Ao "~ (2)

ί,ιοχ -π 3 -si=-^ Uvoä ψ P

Mred: reduzierter Mediator

Λ/Ιοχ: oxidier er Mediator

S: Substrat

P: Produkt

Die Anzeige des Sauerstoffverbrauchs hei -60OmV (vs Ag/AgCI) mit einer Elektrode führt deshalb zu einer höheren Empfindlichkeit für die Mediatoren als bei der direkten elektrochemischen Anzeige des reduzierten bzw. oxidierten Mediators. Im Gegensatz »ur Rezyklisierung des Mediators im elektrochemisch-enzymctischen Zyklus erfolgt die Reaktion bei der vorliegenden Erfindung in der gesamten Enzymschicht. Deshalb ist die Verstärkung wesentlich höher als bei der heterogenen (elektrochemischen) Reaktion, wo Oxidation und Reduktion räumlich getrennt ablaufen.

Werden Mediatoren durch enzymatische Reaktionen gebildet, z. B. die Bildung von Hydrochinon bei der Hydrolyse von Dihydroxyphenylphosphat durch alkalische Phosphatase, so können mit dem erfindungsgemäßen Biosensor und Verfahren dieses Reaktionsprodukt empfindlich nachgewiesen werden und damit eine bestimmung der entsprechenden Enzymaktivität nach kurzer Inkubationszeit bzw. mit geringen Probevolumina erfolgen.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher beschrieben.

Ausführungsbeispiei

1. Beispiel

Ein etwa 3mm x 3mm großes Stück einer Bienzymmembran, bestehend aus in Gelatine eingeschlossener Laccase (120U/cm₂) und Cytochrom b₂ (25 U/cm²), wird mittels einer Dialysenmembran auf die Polyethylenmembran der auf -60OmV vs Ag/AgCI polarisierten Sauerstoffelektrode gespannt. Die präparierte Bienzymelektrode taucht in eine gerührte Meßvorlage aus Phosphatpuffer (Sörensen), pH 6,5, ein. Nach Einstellen des Grundstromes werden der Meßvorlage 10 mmol/l Lactat zugesetzt. Bei anschließender Zugabe von 1 μητιοΙ/Ι Hydrochinon erfolgt ein Sauerstoffvarbrauch, der zu einer Stromerniedrigung führt. Dia in der Enzymschicht ablaufenden Reaktionen sind im folgenden Schema dargestellt.

1/2O_2x ^H₂O

^ Laccase

HQ BQ

⁵^ Cytoohron b S~ * N

Pyruvat Laotat

Nach jeder Messung wird dia Meßzelle gespült. Nach Aufnahme einer Bezugskurve mit entsprechenden Hydrochmorikonzentrationen von 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0μηιοΙ/Ι können Meßprobjn vermessen v/erden.

Steuerung der Empfindlichkeit

Bezugskurven für HQ werden unter Zusatz folgender Lactatkonzentrationen anstelle von 10 mmol/l aufgenommen; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0 9; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6mmol/l.

Aus der erhaltenon Schar von Bezugskurven mit unterschiedlichen Anstiegen und linearen Bereichen wird eine solche ausgewähii, auf deren linearen Teil diezu erwartende HQ-Konzentraiion der Meßprobe liegt. Für die Messung der Probe wird die für diese Bezugskurve vorgelegte Lactatkonzentration der Meßvorlage zugesetzt und nach Einstellung des stationären Grundstroms die Probe zugegeben Nach Einstellung des neuen Stromwertes wird aus der Bezugskurve die gesuchte HQ-Konzuntration ermittelt.

2.Beispiel

Laccase (12OU/cm²) wird mit Glutamatoxidase (1,2 U/cm²) in Gelatine coimmobiüsiert. Diese Membran wird auf die Polyethylmembran einer Sauorstoffelektrode gelegt und mit einer Dialysemembran bedeckt fixiert. Die Elektrode wird in 2 ml einer Phosphatpufferlösung, pHfi,8, getaucht und auf 25⁰C thermostaten. In diese Lösung werden 10mmol/l Glutamat vorgelegt. Nach Einstellung des Grundstromes der auf -60OmV vs Ag/AgC! polarisierten Bienzymelektrode wird die Reaktion mit HQ gestartet. HQ wird unter Sauersioifverbraur.il oxidiert. Das Produkt BQ reagiort durch Glutamatoxidase katalysiert mit Glutamat zu a-Ketoglutarat unter Regenerierung von HQ, das erneut in den Zyklus eingeht. Mit unterschiedlichen HQ-Konzentrationen wird auf diese Weise eine Eichkurve aufgenommen. In einem externen gerührten temperierten Gefäß werden 100μΙ einer alkalischen Phosphataselösung (aP) unbekannter Aktivität in 2 ml der Inkubationslösung, bestehend aus 1 mmol/l Triethanolaminpuffer, pH9,8,0,5mmol/l MgCI₂ und 10mmol/l Dihydroxyphenylphosphai, pipettiert.

Nach 1min VorinKübation werden dieser Probe 50μΙ entnommen und in die gerührte Meßvorlage des Bienzymsensors zugesetzt und aus der Stromerniedrigung mittels der Eichkurve das durch aP gebildete ΗΩ bestimmt. Aus diesem Wert wird die Aktivität der aP (μηηοΙ/Ι min) berechnet.

Claims (4)

1. Biosensor zur Bestimmung von Mediatoren, dadurch gekennzeichnet, daß ein den Mediator oxidierendes und ein den Mediator reduzierendes Enzym gemeinsam vor einer Sauerstoffelektrode aufgebracht sind.

2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als mediatoroxidierendes Enzym Laccase oder Peroxidase, als mediatorreduziurendes Enzym Cytochrom b₂, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase eingesetzt wird.

3. Verfahren zur Bestimmung von Mediatoren mit dem Biosensor, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat des mediatorreduzierenden Enzyms der Meßvorlage zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratkonzentration zwischen 1υμηιοΙ/Ι und 10mmol/l liegt.