DD280790A1 - BIOSENSOR AND METHOD FOR DETERMINING MEDIATORS - Google Patents
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Abstract
Biosensor und Verfahren zur Bestimmung von Mediatoren. Anwendungsgebiet ist die medizinische Diagnostik. Der Biosensor ist dadurch gekennzeichnet, dass vor einer Sauerstoffelektrode ein den Mediator oxidierendes und ein den Mediator reduzierendes Enzym aufgebracht sind. Als mediatoroxidierendes Enzym wird Laccase oder Peroxidase, als mediatorreduzierendes Enzym wird Cytochrom b2, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase verwendet.Biosensor and method for determining mediators. Field of application is medical diagnostics. The biosensor is characterized in that a mediator oxidizing and a mediator-reducing enzyme are applied in front of an oxygen electrode. The mediatoroxidierendes enzyme is laccase or peroxidase, as a mediatorreduzierendes enzyme cytochrome b2, glucose oxidase, glutamate, diaphorase or lactate oxidase is used.
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zur Bestimmung von elektrochemisch aktiven Medi atoren, z. B. Hydrochinon, Ferrozyanid oder Ferrocenderivaten. Dor Biosensor und das Verfahren eignen sich besonders zur elektrochemischen Messung der Aktivität hydrolytischer Enzyme, z. B. von alkalischer Phosphatase und Esterasen. Das Verfahren ist vor allem für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik, zur Enzymaktivitätsbestimmung oder für Enzymimmunoassays geeignet.The invention relates to a biosensor and a method for the determination of electrochemically active mediators, for. As hydroquinone, ferrocyanide or ferrocene derivatives. Dor biosensor and the method are particularly suitable for the electrochemical measurement of the activity of hydrolytic enzymes, eg. B. of alkaline phosphatase and esterases. The method is particularly suitable for use in medical diagnostics, enzyme activity determination or enzyme immunoassays.
Die untere Nachweisgrenze für die amperometrische Bestimmung von Mediatoren liegt bei etwa 1 μιηοΙ/Ι. Wasaetal. (J.Chem. Soc. Jpn (1984), 1397) erzielten für die elektrochemische Bestimmung von Diphenolen (z.B. Hydrochinon [HQ]) durch elektrochemische Rezyklisierung eine Steigerung der Empfindlichkeit um den Faktor 10-20, indem sie das Enzym Laccase (EC 1.10.3.2) an der Oberfläche einer Kohleelektrode fixierten. Dieses Enzym oxidiert HQ zu Benzochinon (BQ) unter Verbrauch von Sauerstoff. An der Elektrode wird das BQ wieder zu HQ reduziert, so daß es wieder durch die Laccase oxidiert werden kann. Solche „katalytischen Ströme" sind auch von anderen Enzymen, z.B. Katalase (mit H2O2), gefunden woiden. Die empfindliche Bestimmung von Substraten und Kofaktoren mittels enzymatischer Rezyklisierung ist Gegenstand des DD-WP 222896 und beschrieben in Schubert et al.. Anal. Chim. Acta 169 (1985) 391. Für die elektrochemische Bestimmung der Enzymaktivitäten über die Anzeige der Bildungsgeschwindigkeit von Mediatoren sind bei den bekannten Nachweismethoden lange Vorinkubationszeiten oder große Probenvolumina notwendig.The lower detection limit for the amperometric determination of mediators is about 1 μιηοΙ / Ι. Wasaetal. (J.Chem.Soc. Jpn (1984), 1397) achieved an increase in sensitivity by a factor of 10-20 for the electrochemical determination of diphenols (eg hydroquinone [HQ]) by electrochemical recycling, by using the enzyme laccase (EC 1.10 .3.2) fixed to the surface of a carbon electrode. This enzyme oxidizes HQ to benzoquinone (BQ) while consuming oxygen. At the electrode, the BQ is again reduced to HQ so that it can be oxidized again by the laccase. Such "catalytic streams" are also found by other enzymes, eg catalase (with H 2 O 2 ) The sensitive determination of substrates and cofactors by enzymatic recycle is the subject of DD-WP 222896 and described in Schubert et al., Anal Chim. Acta 169 (1985) 391. For the electrochemical determination of enzyme activities via the display of the rate of formation of mediators, long preincubation times or large sample volumes are necessary in the known detection methods.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der rrfindung ist es, die nachweisbare Menge an Mediatoren und damit die Zeil bzw. das Probevolumen bei der Messung von F ymaktivitäten zu reduzieren.The aim of the r rfindung is to reduce the detectable level of mediators, and thus the Zeil or the sample volume ymaktivitäten in the measurement of F.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biosensor und ein Verfahren zur Bestimmung von Mediatoren, wie Hydrochinon oder andere Diphenole, Ferrocyanid sowie Ferrocen und seine Derivate, und damit von Hydrolasen zu entwickeln. Dabei soll die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbessert werden.The object of the invention is to develop a biosensor and a method for the determination of mediators, such as hydroquinone or other diphenols, ferrocyanide and ferrocene and its derivatives, and thus of hydrolases. The detection sensitivity is to be improved considerably.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mii einem Biosensor gelöst, der auf der Oberfläche einer Sauerstoffelektrode ein den reduzierton Mediator unter Sauerstoffverbrauch oxidierendes Enzym gemeinsam mit einem den oxidierten Mediator reduzierendes Enzym enthält. Als den reduzierten Mediator oxidierendes Enz°.~n wird Laccase oder Peroxidas verwendet. Als den oxidierten Mediator reduzierendes Enzym wird Cytochrom b2, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Diaphorase oder Lactatoxidase verwendet. Die Fixierung erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Immobilisierung in Membranen. Der Biosensor taucht in eine übliche gerührte Meßlösung. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der Meßvorlage das Substrat des den Mediator reduzierenden Enzyms im Überschuß zugesetzt wird. Durch Wahl der Substratvorlage in einem limitieranden Konzentrationsbereich werden die Rezyklisierung des Mediators und damit die Empfindlichkeit gezielt gesteuert. Die Substratkonzentration liegt zwischen 10 μιηοΙ/Ι und 10mmol/l. Das ist dann von Bedeutung, wenn mit einem Sensor über ein weites Konzentrationsgebiet Mediatorbestimmungen durchgeführt werden sollen.According to the invention, this object is achieved by a biosensor which contains on the surface of an oxygen electrode an enzyme which oxidizes the reduced oxygen mediator together with an enzyme which reduces the oxidized mediator. Laccase or peroxidase is used as the reduced mediator oxidizing enzyme. As the oxidized mediator reducing enzyme, cytochrome b 2 , glucose oxidase, glutamate oxidase, diaphorase or lactate oxidase is used. The fixation is carried out by methods known per se by immobilization in membranes. The biosensor dips into a standard stirred measuring solution. The method is characterized in that the substrate is added to the substrate of the mediator reducing enzyme in excess. By selecting the substrate template in a limited concentration range, the recycle of the mediator and thus the sensitivity are controlled in a targeted manner. The substrate concentration is between 10 μιηοΙ / Ι and 10mmol / l. This is important if mediator determinations are to be carried out with a sensor over a wide concentration range.
Der zu bestimmende reduzierte Mediator wird unter Sauerstoffv :rbrauch durch E1 (Gl. 1) enzymatisch oxidiert. Durch das zweite immobilisierte Enzym, E 2 (Gl. 2) wird der Mediator unter Substratverbrauch und Produktbildung wieder reduziert und kann deshalb erneut oxidiert werden. Durch diese kontinuierliche Rezyklisierung des Mediators wird, verglichen mit der Konzentration des ursprünglichen vorliegenden reduzierten Mediators, ein Vielfaches von Sauerstoff verbraucht.The reduced mediator to be determined is enzymatically oxidized by E1 (equation 1) under oxygen abuse. The second immobilized enzyme, E 2 (equation 2), reduces the mediator again under substrate consumption and product formation and can therefore be reoxidized. This continuous recycle of the mediator consumes a multiple of oxygen compared to the concentration of the original reduced mediator present.
:·:ϊ·οιϊ + U0 -ώ!-^ :ij0X + T1^Q: ·: Ϊ · οιϊ + U 0 -ώ! - ^: ij0X + T 1 ^ Q
Ao "~ (2) Ao "~ (2)
ί,ιοχ -π 3 -si=-^ Uvoä ψ P ί, ιοχ -π 3 -si = - ^ Uvoä ψ P
Mred: reduzierter MediatorMred: reduced mediator
Λ/Ιοχ: oxidier er MediatorΛ / Ιοχ: oxidize the mediator
S: SubstratS: substrate
P: ProduktP: product
Die Anzeige des Sauerstoffverbrauchs hei -60OmV (vs Ag/AgCI) mit einer Elektrode führt deshalb zu einer höheren Empfindlichkeit für die Mediatoren als bei der direkten elektrochemischen Anzeige des reduzierten bzw. oxidierten Mediators. Im Gegensatz »ur Rezyklisierung des Mediators im elektrochemisch-enzymctischen Zyklus erfolgt die Reaktion bei der vorliegenden Erfindung in der gesamten Enzymschicht. Deshalb ist die Verstärkung wesentlich höher als bei der heterogenen (elektrochemischen) Reaktion, wo Oxidation und Reduktion räumlich getrennt ablaufen.The indication of oxygen consumption -60 Omv (vs Ag / AgCl) with one electrode therefore results in a higher sensitivity for the mediators than in the direct electrochemical display of the reduced or oxidized mediator. In contrast to the recycle of the mediator in the electrochemical-enzymatic cycle, the reaction in the present invention occurs throughout the enzyme layer. Therefore, the gain is much higher than in the heterogeneous (electrochemical) reaction, where oxidation and reduction occur spatially separated.
Werden Mediatoren durch enzymatische Reaktionen gebildet, z. B. die Bildung von Hydrochinon bei der Hydrolyse von Dihydroxyphenylphosphat durch alkalische Phosphatase, so können mit dem erfindungsgemäßen Biosensor und Verfahren dieses Reaktionsprodukt empfindlich nachgewiesen werden und damit eine bestimmung der entsprechenden Enzymaktivität nach kurzer Inkubationszeit bzw. mit geringen Probevolumina erfolgen.Are mediators formed by enzymatic reactions, eg. As the formation of hydroquinone in the hydrolysis of dihydroxyphenyl phosphate by alkaline phosphatase, it can be detected sensitively with the biosensor and method of this reaction product and thus carried out a determination of the corresponding enzyme activity after a short incubation period or with low sample volumes.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher beschrieben.The invention will be further described by examples.
AusführungsbeispieiAusführungsbeispiei
1. Beispiel1st example
Ein etwa 3mm x 3mm großes Stück einer Bienzymmembran, bestehend aus in Gelatine eingeschlossener Laccase (120U/cm2) und Cytochrom b2 (25 U/cm2), wird mittels einer Dialysenmembran auf die Polyethylenmembran der auf -60OmV vs Ag/AgCI polarisierten Sauerstoffelektrode gespannt. Die präparierte Bienzymelektrode taucht in eine gerührte Meßvorlage aus Phosphatpuffer (Sörensen), pH 6,5, ein. Nach Einstellen des Grundstromes werden der Meßvorlage 10 mmol/l Lactat zugesetzt. Bei anschließender Zugabe von 1 μητιοΙ/Ι Hydrochinon erfolgt ein Sauerstoffvarbrauch, der zu einer Stromerniedrigung führt. Dia in der Enzymschicht ablaufenden Reaktionen sind im folgenden Schema dargestellt.An about 3mm x 3mm piece of a bienzyme membrane consisting of gelatin-entrapped laccase (120U / cm 2 ) and cytochrome b 2 (25 U / cm 2 ) is polarized by a dialysis membrane onto the polyethylene membrane of -60mV vs Ag / AgCl Oxygen electrode stretched. The prepared Bienzymelektrode immersed in a stirred test sample of phosphate buffer (Sörensen), pH 6.5, a. After adjusting the background current of the sample 10 mmol / l lactate are added. Subsequent addition of 1 μητιοΙ / Ι hydroquinone takes place a Sauerstoffvarbrauch, which leads to a reduction in current. Dia in the enzyme layer running reactions are shown in the following scheme.
1/2O2x ^H2O1 / 2O 2x ^ H 2 O
^ Laccase^ Laccase
HQ BQHQ BQ
5^ Cytoohron b S~ * N 5 ^ Cytoohron b S ~ * N
Pyruvat LaotatPyruvate Laotat
Nach jeder Messung wird dia Meßzelle gespült. Nach Aufnahme einer Bezugskurve mit entsprechenden Hydrochmorikonzentrationen von 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0μηιοΙ/Ι können Meßprobjn vermessen v/erden.After each measurement, the measuring cell is rinsed. After taking a reference curve with corresponding hydrochororon concentrations of 0.1; 0.5; 1.0; 2.0; 4,0μηιοΙ / Ι can be measured.
Steuerung der EmpfindlichkeitControl of sensitivity
Bezugskurven für HQ werden unter Zusatz folgender Lactatkonzentrationen anstelle von 10 mmol/l aufgenommen; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0 9; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6mmol/l.Reference curves for HQ are recorded with the addition of the following lactate concentrations instead of 10 mmol / l; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0 9; 1.0; 1.2; 1.4; 1.6 mmol / l.
Aus der erhaltenon Schar von Bezugskurven mit unterschiedlichen Anstiegen und linearen Bereichen wird eine solche ausgewähii, auf deren linearen Teil diezu erwartende HQ-Konzentraiion der Meßprobe liegt. Für die Messung der Probe wird die für diese Bezugskurve vorgelegte Lactatkonzentration der Meßvorlage zugesetzt und nach Einstellung des stationären Grundstroms die Probe zugegeben Nach Einstellung des neuen Stromwertes wird aus der Bezugskurve die gesuchte HQ-Konzuntration ermittelt.From the obtained group of reference curves with different slopes and linear regions, one chooses such that the linear part of it is the expected HQ concentration of the test sample. For the measurement of the sample, the lactate concentration submitted for this reference curve is added to the sample and the sample is added after the steady-state basic current has been set. After the new current value has been set, the desired HQ concentration is determined from the reference curve.
2.Beispiel2.Example
Laccase (12OU/cm2) wird mit Glutamatoxidase (1,2 U/cm2) in Gelatine coimmobiüsiert. Diese Membran wird auf die Polyethylmembran einer Sauorstoffelektrode gelegt und mit einer Dialysemembran bedeckt fixiert. Die Elektrode wird in 2 ml einer Phosphatpufferlösung, pHfi,8, getaucht und auf 250C thermostaten. In diese Lösung werden 10mmol/l Glutamat vorgelegt. Nach Einstellung des Grundstromes der auf -60OmV vs Ag/AgC! polarisierten Bienzymelektrode wird die Reaktion mit HQ gestartet. HQ wird unter Sauersioifverbraur.il oxidiert. Das Produkt BQ reagiort durch Glutamatoxidase katalysiert mit Glutamat zu a-Ketoglutarat unter Regenerierung von HQ, das erneut in den Zyklus eingeht. Mit unterschiedlichen HQ-Konzentrationen wird auf diese Weise eine Eichkurve aufgenommen. In einem externen gerührten temperierten Gefäß werden 100μΙ einer alkalischen Phosphataselösung (aP) unbekannter Aktivität in 2 ml der Inkubationslösung, bestehend aus 1 mmol/l Triethanolaminpuffer, pH9,8,0,5mmol/l MgCI2 und 10mmol/l Dihydroxyphenylphosphai, pipettiert.Laccase (12OU / cm 2 ) is coimmobilized with glutamate oxidase (1.2 U / cm 2 ) in gelatin. This membrane is placed on the polyethylene membrane of an acidic electrode and fixed covered with a dialysis membrane. The electrode is in 2 ml of a phosphate buffer solution, pHfi, 8, dipped and thermostated at 25 0 C. In this solution 10mmol / l glutamate are submitted. After setting the base current of -60OmV vs Ag / AgC! polarized Bienzymelektrode the reaction is started with HQ. HQ is oxidized under Sauersioifverbraur.il. The product BQ reacts with glutamate oxidase catalyzed with glutamate to a-ketoglutarate with regeneration of HQ, which re-enters the cycle. With different HQ concentrations, a calibration curve is recorded in this way. In an externally stirred, temperature-controlled vessel, 100 μl of an alkaline phosphatase solution (aP) of unknown activity are pipetted into 2 ml of the incubation solution consisting of 1 mmol / l triethanolamine buffer, pH9.8, 0.5 mmol / l MgCl 2 and 10 mmol / l dihydroxyphenylphosphine.
Nach 1min VorinKübation werden dieser Probe 50μΙ entnommen und in die gerührte Meßvorlage des Bienzymsensors zugesetzt und aus der Stromerniedrigung mittels der Eichkurve das durch aP gebildete ΗΩ bestimmt. Aus diesem Wert wird die Aktivität der aP (μηηοΙ/Ι min) berechnet.After 1 min VorinKübation 50μΙ of this sample are removed and added to the stirred Meßvorlage the Bienzymsensors and determined from the current reduction by means of the calibration curve formed by aP ΗΩ. From this value, the activity of the aP (μηηοΙ / Ι min) is calculated.
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Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD30180887A DD280790A1 (en) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | BIOSENSOR AND METHOD FOR DETERMINING MEDIATORS |
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| DD280790A1 true DD280790A1 (en) | 1990-07-18 |
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| DD30180887A DD280790A1 (en) | 1987-04-14 | 1987-04-14 | BIOSENSOR AND METHOD FOR DETERMINING MEDIATORS |
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|---|---|
| DD (1) | DD280790A1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994025618A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Byk Gulden Italia S.P.A. | Enzymatic amplification systems |
| WO1999054545A1 (en) * | 1998-04-16 | 1999-10-28 | Pulp And Paper Research Institute Of Canada | Oxidase process for pulp and dye oxidation |
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-
1987
- 1987-04-14 DD DD30180887A patent/DD280790A1/en unknown
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