JPS58193448A - アミラ−ゼの分析方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アミラーゼの分析方法及び分析装置に関する
。より詳しくは、酵素電極を用い友アミラーゼの分析方
法及び分析装置に関する。

従来、アミラーゼ量の分析方法としては、（１）デンプ
ンがアミラーゼによって次第に分解されるのをヨードデ
ンプン反応で追跡するアミロクラスチック法、１２）ア
ミラーゼにより分解されて生じたマルトースの還元力を
測定するサツカロジェニック法ｔ（３）色素を交差結合
させ次不溶性の着色デンプンを基質としてアミラーゼの
作用で遊離した可溶性色素を比色測定するクロモジェニ
ックテプストレート法等がある。しかし、これらの方法
は、特に試料が生体液である場合、その中に含まれてい
る各種の物質、例えば、尿素、尿酸、タンパク質、糖、
ビタミンＣ等が測定妨害物質となり、このため測定精度
に欠ける難点をもち、又、分析操作が煩雑であり、分析
時間も長い等の欠点を有する。

こうした欠点を解消する方法として、近時酵素法が開発
され、これに属するものとしては、（４）可溶性デンプ
ンを基質としてα−アミラーゼにより生成したマルトー
スをマルトフォスフアリラーゼにより分解し、更にβ−
フォスフォグルコムターゼ、グルコース−６−リン酸脱
水素酵素、６−７オスフオグルコン酸脱水素酵素を用い
る３段階の酵素反応を経て、最終的に生じたＮＡＤＨ（
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）量を測
定するマルトース・ホスホリラーーｆ法、（５１α−グ
ルコシダーゼによりマルトースをグルコースに分解し、
このグルコースを測定するα−グルコシダーゼ法等があ
る。これらの酵素法は酵素の基質特異性を利用するため
、前記（１）〜（３）の方法に比し、測定妨害物質の影
響を受けない長所があるが、しかし、分析時間が長く、
酵素や補酵素の分析試薬が高価であり、又、装置が複雑
であるなどの欠点がある。

これらの欠点を除い念力法として、すでに本発明者らの
一人は、特開昭５６−９７８６３として、試料をアミラ
ーゼの基質液に加え、この混合液をグルコース量の測定
できる酵素電極からなる第１検知器に接触させて試料中
に当初から存在するグルコース量を測定し、次に、該検
知器からの流出液をマルトース及びグルコース量の測定
できる酵素電極からなる第２検知器に接触させてマルト
ースに由来するグルコースと当初から存在するグルコー
スとの総量を測定し、そして、第２検知器と第１検知器
で得られた出力信号の差からアミラーゼ量を測定する方
法を提案した。この方法は、測定妨害物質による影響を
受けにくく、測定ａ度が高く、分析時間が短く、分析操
作も簡便で、高価な分析試薬も必要とせず、かつ、分析
装置の構造も簡単である。

しかし、この方法においても、分析時間を非常に短縮し
ようとすると、マルトースの生成が不十分のため、酵素
電極中で生じるグルコース量が十分でなく、当初から試
料中に存在するグルコースのバックグラウンドの信号が
大きくなり、結果として８／Ｎ比が悪くなり十分な分析
精度が得られにくいことが明らかとなった。また、塘尿
病患者の試料のように当初からグｌコースのバックグラ
ウンドが大きいときも同様な結果となる。また、分析装
置も酵素電極が２本、あるいは差動増幅装置が必要とな
り、複雑で高価になるなどの問題があった。

本発明の目的は、測定妨害物質であるグルコースの影蕃
を除去して分析精度を上げ、かつ分析時間を短縮したア
ミラーゼ量の分析方法及び分析装置を提供することにあ
る。

本発明のアミラーゼ分析方法は、酵素電極を用いて試料
中のアミラーゼ量を分析するアミラーゼの分析方法にお
いて、アミラーゼの基質液にグルコースを基質とする酵
素を加え、これに試料を加えるか、又は上記基質液に試
料を加え、これをグルコースを基質とする固定化酵素に
接触させることにより、当初より試料中に存在したグル
コースを他の物質に変換してグルコースによる酵素電極
のパックグランドをなくしたのち、その処理液をマルト
ース量を測定し得る酵素電極に接触させ、アミラーゼの
作用により生成したマルトース量を測定することにより
、試料中のアミラーゼ量を検出することを特徴とする。

さらに本発明のアミラーゼ分析方法は、まずアミラーゼ
の基質液を気泡により一定体積に分節し、この分節され
九基質液に試料を加え、これをグルからなる検知器に検
知されない物質に変え、この流出液をマルトースを測定
する酵素電極より成る検知器に接触させ、アミラーゼの
触媒作用によって生成したマルトース量を測定しこれよ
り試料中のアミラーゼ量を知ることを特徴とする。

基質液を気・泡と気泡とによって所定体積に分節する方
法は、前述の酵素を用いる場合（固定化されていない酵
素）にも行なって効果がある。

本発明のアミラーゼ分析装置は、試料の流路に沿って上
流側より、アミラーゼの基質とグルコースを基質とする
酵素を含む緩衝液供給部、試料注入部、反石部、マルト
ースを検知する酵素電極、及び該電極で得られた信号管
増巾、記録する装置を具備することを特徴とする。さら
に上記緩衝液供給部と試料注入部の間に気泡発生部を加
えることもできる。

また、本発明の他のアミラーゼ分析装置は、試料の流路
に沿って上流側よりアミラーゼの基質を含む緩衝液供給
部、気泡発生部、試料注入部、マルトースを測定できる
酵素電極、とくに固定化グルコシダーゼ／グルコースオ
キシダーゼ１１ト酸素電極又は過酸化水素電極とを組合
せた酵素電極が設置されていることを特徴とする。

アミラーゼは、その基質であるデンプン、デキストリン
、グルコーゲン等の多糖類をマルトースに分解する酵素
であり、α型とβ型の２８１類がある。α型は人間を含
む動物の臓器、植物、微生物中に存在し、β型は麦芽、
サツマイモ等の植物中に含まれ、人体には存在しない。

α−アミラーゼは多糖類をα−マルトースに分解する性
能を奄ち、β−アミラーゼはデンプン等を分子の末端か
ら切断してβ−マルトースに分解する性能を有する。

本発明の分析方法及びその装置は、もちろんα−アミラ
ーゼ及びβ−アミラーゼのいずれに４ｂ適用できるが、
特に、生体液、例えば、人又は動物のだ液、血液中に存
在するα−アミラーゼに対する適用が重要視される。生
体液中のα−アミラーゼ活性を測定することにより各種
疾病の診断が可能であり、このため、近時α−アミラー
ゼの分析が臨床検査の分野で特に注目されているからで
ある。

本発明は、酵素の反応特異性を有効に利用するものであ
り、α−アミラーゼの例をとると、その原理は下記の酵
素反応によって説明される。

α−グリコシタ―ゼ α−マルトース十Ｈ，Ｏ−−９２グルコース　　　［株
］グ吠トスホしグーゼ グルコース＋Ｈ，０＋Ｏ１−一一一一一一一うグルコン
酸＋Ｈ１０，（へ）すなわち、試料中に当初より存在す
るグルコースは（Ｉ）式の反応により他の物質に変換さ
れ酵素電極のバックグラウンドとなり得なくなる。また
０式の反応により試料中のα−アミラーゼは緩衝液中に
含むα−アミラーゼの基質である多糖類を加水分解して
α−マルトースを生成する。このα−マルトースは酵素
電極の固定化酵素層を通過するとき・、ｅｖ）式の反応
によりグルコン酸と０．０．に分解される。この場合、
反応系中では動式によりＯ２の減少、またはＨ８０！の
増加がみられる。従って、これらの増減を測定すること
によりグルコースの濃度が測定でき、グルコースを測定
するこトニヨリマルトース量が測定できる。このマルト
ース量はアミラーゼより生成されるので、アミラーゼ量
に比例する。つまり試料中にグルコースのバックグラウ
ンドが無ければ、グルコース量を測定すればアミラーゼ
竜を測定できることになる。

α−アミラーゼの基質例えば、可溶性デンプン、デキス
トリン、アミロース、アミロペクチン等の多糖類及びマ
ルトペンタオース、マルトテトラオース等の少糖類を溶
かした緩衝液と混合し、基質液とする。緩衝液としては
、グルコースを基質とする酵素アミラーゼ、α−グリコ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼの４種の酵素の安定
領域でかつ、それらの至適なｐＨ領域に近いｌ）Ｈ領域
を持つ緩衝液であればよく、具体的には例えばリン酸緩
衝液等が適当である。

本発明で用いられるグルコースを基質とする酵素類の例
としては、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、
グルコースアイツメラーゼ、クルコースデヒドロゲナー
ゼ（１，１，ｌ、４７）、グルコースデヒドロゲナーゼ
（１，Ｉｓ　９９．ａ）などがある。これらの酵素は単
独、２攬以上混合して、または補酵素や、他のグルコー
スを基質としない酵素を添加することにより用いられる
。例えばグルコースオキシダーゼは反応生成物としてＨ
ｌｏ、を生じ、この生成物は酵素電極のバックグラウン
ドになるため、更にこの系にカタラーゼを入れ生成した
島０．を直ちに分解し酵素電極に不治性な物質にし几り
、またへキソキナーゼの例では補酵素としてムＴＰを添
加して用いる。

ヶｘ：ｒ−、ｔｔ、＊、：ｔｓエイ、ワ。エヵよ　　　
゛□としては、例えば「固定化酵素」　（千畑一部編、
講談社サイエンティフィック、１９７５Ｎｃ記載されて
いる方法を用いることができる。また固定化酵素の形態
としては、チューブ、ビーズ、膜、コイル等があるが特
に制約を受けるものはない。

望ましくは、試料の流れを乱さないような、例えばチュ
ーブのようなものが適当であるが、これに限定されるも
のではない。

本発明に用いる酵素電極はα−グリコシダーゼ／グルコ
ースオキシダーゼと酸素電極又は過酸化水素電極とを組
合せた酵素電極であり、酵素は固定化膜として使用する
ことができる。本発明に用いられる酸素又は過酸化水素
電極は市販のガルバニ型及びクラーク型の電極が適当で
ある。

本発明の分析装置においては試料の流路に沿って、上流
側よりアミラーゼの基質とグルコースを基質とする酵素
類を含む緩衝液のタンクとポンプよりなる緩衝液供給部
、試料注入部、試料反応部、マルトースを検知する酵素
電極、および酵素電極で得られた信号を増巾、記録する
装置が具備されている。

本発明の他の分析装置は、試料の流路に沿って上流側よ
りアミラーゼの基質を含む緩衝液供給部、気泡発生部、
試料注入部、グルコースを基質とする固定化酵素部、マ
ルトースを検知できる酵素電極より成る検知部が具備さ
れている。

以下、本発明を図面によって説明する。第１図は本発明
の実施例であるα−アミラーゼの分析装置の系統図であ
り、図中１は基質および酵素類含有緩衝液タンク、２は
試料注入部、３は流路系、４は反応部、５は検知器、６
はポンプ、７は増巾器、８は記録計を示す。第１図にお
いて、ポンプ６により導かれる流路系３に沿って、基質
および酵素類含有緩衝液タンク１から流出した同液に対
し試料注入部２から試料が混入される。この流液は反応
部４で前記０式に従って酵素反応が起り基質の一部が試
料中に含まれるアミラーゼの作用によりマルトースに分
解されると同時に酵素を極５のバックグラウンドとなる
グルコースはα）式に従って酵素電極５の不活性な反応
物に変換される。

続いてこの流液は酵素電極５を通過し、このとき前記の
マルトース量が測定される。

第２図は酵素電極の概略図を示し、図中９は陵面 素又は過酸化水素電極、１０はその作用ｐ、１１は固定
化酵素膜を装着するための０−リング、１２はα−グリ
コシダーゼとグルコースオキシダーゼを同時に固定した
酵素膜である。この酵素膜に流液が接触すると、その中
に含まれている１ルトースは前記価、（転）式の反応を
起す。この結果、Ｈ２Ｏ，の生成やＯｌの減少が起り、
酸素又は過酸化水素電極に、その量に比例した電流が流
れるため、この電流はリード線１３を通じて増巾器７に
送られ増巾され、記録計８で表示される。

第３図は、特定の装置機能及び操作手段により定まるマ
ルトースの注入量と記録計出力との関係の１例を表わし
、ここで表示された出力の値は第３図から明らかなよう
にマルトース量に比例し、マルトース量はアミラーゼ量
に比例するので、アミラーゼ蓋が測定できる。

第４図は、試料中に含まｎでいるアミラーゼ量と記録計
の出力との関係を測定した分析例であり、これによれば
、本発明の分析装置により、一定の分析値が得られるこ
とが明らかである。

第５図は、本発明の他のα−アミ？−ゼ分析装置の系統
図である。図中２１は基質を含んだ緩衝液タンク、２２
はポンプ、２３は気泡発生器、２４は試料注入部、２５
は流路系、２６はグルコースを基質とする固定化酵素部
、２７は基質とアミラーゼの反応部、２８はフローセル
、２９はマルトースを検知する酵素電極の検知器、３０
は導線、３１は増巾器、３２は記録計を示す。第５図に
おいて、ポンプ２２により導かれる流路系２５に沿って
、基質含有緩衝液タンク２１から流出した同液に対し、
気泡発生部２３より一定時間々隔で気泡を発生させ一定
体積に分節する。次に同液に対し、試料注入部２４より
試料が注入される。

このとき、前記■式に従って酵素反応が起り始め基質の
一部が試料中に存在するアミラーゼの作用によりマルト
ースに分解され始める。続いて、この流液はグルコース
を基質とする酵素を固定化し次固定化酵素部２６を通り
、ここで流液中に存在するグルコースは（９式に従って
検知器に不活性な物質に変換される。次に、この流液は
アミラーゼと基質の反応部２７に行き、アミラーゼと基
質の反応が更に続けられ検知すべきマルトースの生成ｔ
ｉ増加させる。最後にこの流液はフローセル２８を通り
、このとき検知器２９によりマルトース量が測定される
。

次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにより何
ら限定されるものではない。

実施例　１ 公知の方法でポリアクリルアミドゲル中に、α−グリコ
シダーゼとグルコースオキシダーゼヲ包括固定化し次固
定化酵素膜を製造した。これらの膜は、厚さが７０μｍ
で、活性が０．５　Ｉ　Ｕ／（ＷＩ”である。この膜を
０−ＩＪノグで市販の過酸化水素電極の作用面に取付け
、第２図に示すような酵素電極を得九。この電極を７０
−セルに取付け、第１図に示すような構成の分析装置を
作製した。なお、流路には内径０．５φのテフロンチュ
ーブを用いた。基質含有緩衝液には、３ｇ／ｄｔの濃度
の可溶性デンプンとそれぞれ５００　Ｕ／ｄｔのグルコ
ースオキシダーゼとカタラーゼを含有した０、１モル、
ｐ　Ｈ７，３のリン酸緩衝液を用いた。流路系全体を３
７Ｃの恒温に保ち、３７Ｃの基質含有緩衝液を０．８ｍ
ｔ／分の流速で流した。ここに注入部より各種濃度のα
−アミラーゼ液を注入し、このときの記録計の読みとの
関係を第４図に示す。

実施例　２ 上記装置を用いて同様な方法で血清を分析し、同時にこ
れを従来法で最も多く使われるプルスターチ法（クロモ
ジェニックサブストレート法の一種）で分析し、その結
果を比較した。このとき相関係数は０．９８（ｎ：１０
）となり、従来法とよく一致することがわかった。

実施例　３ 実施例１と同じ酵素電極を準備し、ま九公知の方法で内
径１日長さ２ｍのナイロンチューブの内面にグルコース
オキシダーゼ（西独ベーリンガーマンハイム社製２１０
Ｕ／ｍｇ）およびカタラーゼ（ペーリンガーマンハイム
社製６５０００Ｕ／ｌｎｇ　）を固定化した固定化酵素
チューブを得次、これらを用いて第５図に示すような分
析装置を作製し几。

なお、流路には内径０．５φのテフロンチューブを用い
た。基質含有緩衝液は５００ｍｇ／ｄｔの濃［テマルト
ペンタオースを含有シた０、１Ｍ、Ｉ）Ｈ６，８のリン
酸緩衝液を用いた。流路系全体を３７Ｃの恒温に保ち、
３７１？の基質含有緩衝液を１ｍｔ／ｍ＊の流量で流し
九。この流液を気泡発生機により１秒ごとに気泡を発生
させ分節した。この分節され次流液に注入部より各種濃
度のα−アミラーゼを注入し、このときの記録計の読み
との関係を第６図に示す。

実施例　４ 実施例３で用いた同様な方法で、グルコースが５００ｍ
ｇ／ｄｔの濃度で含有されているα−アミラーゼの各種
濃度の試料を分析した。その結果は実施例３と同様であ
りグルコースの影響は全く受けなかった。

実施例　５ ヒトの血清の試料を従来法であるクロモジェニック法と
本発明の方法で分析し、その相関係数を算出したところ
、０．９９２（ｎ＝１０）であり従来法とよく一致する
ことがわかった。

以上の実施例より本発明は一本の酵素電極で試料中に当
初より存在したグルヘスの影響を受けることなく簡便、
迅速に正確に測定できる。

また、その分析装置はバックグラウンドを検出するグル
コース用の検知器は不要であり、その九め複雑な差動増
巾装置も不要で装置が簡単になる。

その分析結果は、測定訪客物質の影響を受けず測定精度
において極めて優れている。

したがって、本発明は、特に生体液中のα−アミラーゼ
量を測定して疾病の診断に役立たせる５床検査の分野に
おいて極めて有用な分析方法及び分析装置ということが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一具体例であるα−アミラーゼの分析
装置の系統図、第２図はマルトースの検知器である酵素
電極の概略図、第３図はマルトースの注入部と記録計の
出力との関係の１例を表わした図、第４図は前記分析装
置によるα−アミラーゼの測定例を示す図、第５図は本
発明の他の実施例である分析装置の系統図、第６図は前
記分析装置によるα−アミラーゼの測定例を示す図であ
る。 １・・・基質および酵素類含有緩＠液タンク、２・・・
試料注入部、３・・・流路系、４・・・反応部、５・・
φ検知器、６・・・ポンプ、７・・・増巾器、８・・・
記録計、９・・・酸素電極又は過酸化水素電極、１０・
・・作用面、１１・・・０−リフタ、１２・・・固定化
α−グリコシダーゼ／グルコースオキシダーゼ膜、１３
・・・リード巌、２１・・・緩衝液タンク、２２・・・
ポンプ、２３・・・気泡発生器、２４・・・試料注入部
、２５・・・流路系、２６・・・グルコースを基質とす
る固定化酵素部、２７・・・反応部、２８・・・フロー
セル、２９・・・酵素電極の検知器、３０・・・導線、
３１・・・増巾器、３２・・・記録計。 代理人　弁理士　薄田利幸 ■　　１　　図 第　２　図 ￥Ｊ３図 ・ブＩＳ乏　　　　　　　　五゛１１：句ｌＯｌθθ　
　　ｌθθθ　　　Ｉ０ρθθベーアぐラーせ量　（ツ
Ｅヤ’ｆ、４ｋ）￥Ｊ　５　　目

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素電極を用いて試料中のアミラーゼ量を分析する
   アミラーゼの分析方法において、アミラーゼの基質液に
   グルコースを基質とする酵素を加え、これに試料を加え
   るか、又は上記基質液に試料を加え、これをグルコース
   を基質とする固定化酵素に接触させることによ抄、当初
   より試料中に存在したグルコースを他の物質に変換した
   のち、その処理液をマルトース量を測定し得る酵素電極
   に接触させ、アミラーゼの作用により生成したマルトー
   ス量を測定することにより、試料中のアミラーゼ量を検
   出することを特徴とするアミラーゼの分析方法。 ２、当初より試料中に存在したンルコースを他の物質に
   変換する方法が、アミラーゼの基質液にグルコースを基
   質とする酵素を加え、これに試料を加えるものである特
   許請求の範囲第１項記載のアミラーゼの分析方法。 ３、上記アミラーゼの基質液にグルコースを基質とする
   酵素を加え喪液を気泡と気泡とによって所定体積に分割
   したのち、これに試料を加えることを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載の・アミラーゼの分析方法。 ４、当初より試料中に存在したグルコースを他の物質に
   変換する方法が、上記アミラーゼの基質液に試料を加え
   、これをグルコースを基質とする固定化酵素に接触させ
   るものである特許請求の範囲第１項記載のアミラーゼの
   分析方法。 ５、上記アミラーゼの基質液を気泡と気泡とによって所
   定体積に分割し九のち、試料を加えることを特徴とする
   特許請求の範囲第４項記載のアミラーゼの分析方法。 ６、試料の流路に沿って上流側より、アミラーゼの基質
   及びグルコースを基質とする酵素類を含む緩衝液供給部
   、゛試料注入部、反応部、マルトースを検知する酵素電
   極及び該酵素電極で得られた信号を増巾、記録する装置
   を有することを％−徽とする試料中のアミラーゼ分析装
   置。 ７．上記酵素電極が、固定化α−クリコシダーゼ／グル
   コースオキシダーゼ膜と、酸素又は過酸化水素電極とを
   組合せたものである特許請求の範囲第６項記載のアミラ
   ーゼ分析装置。 ８、上記緩衝液供給部と試料注入部の間にさらに気泡発
   生部を有する特許請求の範囲第６項又は第７項記載のア
   ミラーゼ分析装置。 ９、試料の流路に沿って上流側より、アミラーゼの基質
   を含む緩衝液供給部、気泡発生部、試料゛注入部、グル
   コースを基質とする固定化酵素部、マルトースを検知で
   きる酵素電極及び骸電極から得られ比信号を増巾、記録
   する装置を有することを特徴とする試料中のアミラーゼ
   分析装置。 １０、上記酵素電極が、固定化α−グリコシダーゼ／グ
   ルコースオキシダーゼ膜と、酸素又は過酸化水素電極と
   を組合せたものである特許請求の範囲第９項記載のアミ
   ラーゼ分析装置。