CN113084187A - 一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，包括以下步骤：将氯化十六烷基吡啶加入到超纯水中，再依次加入四氯金酸水溶液、四氯钯酸钠水溶液、硝酸银水溶液，混合均匀，得到混合溶液，在剧烈搅拌下，再将预先制备得到的硼氢化钠水溶液快速加入制备得到的混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌反应，直至形成棕色纳米溶胶，将获得的纳米溶胶溶液在水浴中继续反应后得到金银钯三金属过氧化物模拟酶。采用本发明公开的技术方案提供了一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，该制备方法具有简单、快速、高效、无需特殊合成条件等优点。本发明同时公开上述制备方法在制备金属纳米酶中的应用。

Description

一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及金属酶催化领域，尤其涉及的是一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法及其应用。
背景技术
辣根过氧化物酶(HRP)可有效催化H2O2参与的有机及无机化合物氧化反应，被广泛应用于临床诊断和免疫测定。但HRP作为一种天然酶，具有易变性，制备过程复杂，需要特殊的存储条件等缺点。一些纳米材料，例如金纳米，四氧化三铁，具有固有的过氧化物酶催化活性。这些具有内在酶模拟活性的纳米材料通常被称作为纳米酶。纳米酶易于制备，稳定性高，成本低，克服了天然酶易变性和难以保存等缺点而备受关注。将纳米酶与比色分析法相结合，可大大提高检测的灵敏度。因此，纳米酶在催化反应、分析检测、生物传感等领域具有巨大的应用潜力。
在纳米酶的合成中，金属纳米酶具有合成方法稳定，催化机理明确和易于表面修饰等优点，受到广泛关注。其中，如金纳米颗粒和银纳米颗粒由于合成方法简单，合成产率高，稳定性好，生物相容性良好以及对许多重要反应都具有催化活性而受到特别青睐。钯纳米颗粒具有可调控的催化活性，也开始引起一些关注。
中国专利申请号为：110238411A公开了“一种具有过氧化物酶活性的金属纳米颗粒及制备方法”。但是，单金属纳米催化酶和双金属纳米催化酶的催化活性仍需进一步提高。此外，还需要对纳米催化酶的催化活性进行调控，以适用于不同催化反应体系。通过将多种金属元素组合在一起可制备多金属纳米催化酶。多金属纳米催化酶是一种复合型纳米催化剂。与单金属纳米催化酶相比，多金属纳米催化酶可将属于各个单金属材料的多种功能组合在一起，从而具有由多组分协同催化效应带来的更优的催化性能。且通过调控多金属纳米催化酶各个组分的含量，还可方便实现多金属纳米催化酶的催化性能的调控。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法及其应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，制备方法包括以下步骤：
(1)将氯化十六烷基吡啶加入到超纯水中，再依次加入20-200μL 50mM四氯金酸水溶液、50-200μL 50mM硝酸银水溶液、50-200μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀，得到混合溶液；
(2)在剧烈搅拌下，再将预先制备得到的0.1M 2-5mL硼氢化钠水溶液快速加入步骤(1)中制备得到的混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌反应0.5-1小时，直至形成棕色纳米溶胶，将获得的纳米溶胶溶液在35-50℃水浴中继续反应4-10小时后得到金银钯三金属过氧化物模拟酶。
优选地，所述金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法还包括分离纯化。
优选地，分离纯化的方法如下：
将步骤(2)中水浴反应后所得溶胶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀物用超纯水或双蒸水重新溶解。
优选地，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为4：1：1；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为200μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为50μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为50μL。
优选地，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：4：1；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为50μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为200μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为50μL。
优选地，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：1：4；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为50μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为50μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为200μL。
优选地，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：1：1；所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为100μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为100μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为100μL。
优选地，所述氯化十六烷基吡啶的加入量为0.1g。
本发明同时公开采用上述制备方法在制备金属纳米酶中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1.提供了一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，该制备方法具有简单、快速、高效、无需特殊合成条件等优点。
2.所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶具有固有的模拟过氧化物酶的催化活性。所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶可有效催化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，邻苯二胺(OPD)和2,20-叠氮基双(3)-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)与H2O2之间的显色氧化反应，分别产生蓝色、黄色和绿色溶液。
3.本发明所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶，通过调控合成前驱体溶液中金、银、钯元素的摩尔比，可调控金银钯三金属过氧化物模拟酶的催化性能，以有效催化不同显色反应。
4.本发明所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶，以TMB、ABTS或OPD为显色剂，H2O2为底物，其Michaelis-Menten常数Km值小于天然酶HRP和许多报道的具有过氧化物酶活性的纳米酶，表明金银钯三金属过氧化物模拟酶对H2O2具有显著更高的亲和力。
5.本发明提供了一种基于金银钯三金属过氧化物模拟酶的比色分析方法，检测氧化氢或和硫化氢根离子。上述比色分析方法简单、快速、选择性好。
附图说明
图1是本发明实施例1中200μL 50mM四氯金酸+50μL 50mM硝酸银+50μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1TNPs的透射电镜照片；
图2是本发明实施例1中200μL 50mM四氯金酸+50μL 50mM硝酸银+50μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1TNPs的X射线能谱图；
图3是本发明实施例1中200μL 50mM四氯金酸+50μL 50mM硝酸银+50μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs的金、银、钯元素成像图；
图4是本发明实施例1中200μL 50mM四氯金酸+50μL 50mM硝酸银+50μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs的X射线衍射图；
图5是本发明实施例1中50μL 50mM四氯金酸+200μL 50mM硝酸银+50μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag4Pd1 TNPs的透射电镜照片；
图6是本发明实施例1中50μL 50mM四氯金酸+50μL 50mM硝酸银+200μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs的透射电镜照片；
图7是本发明实施例1中100μL 50mM四氯金酸+100μL 50mM硝酸银+100μL 50mM四氯钯酸钠所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1TNPs的透射电镜照片；
图8是本发明实施例2中金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的TMB和H2O2氧化反应紫外可见吸收光谱图；
图8中，A为250μL Au1Ag1Pd4 TNPs+250μL 40mM TMB+500μL 0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
B为250μL Au4Ag1Pd1 TNPs+250μL 40mM TMB+500μL 0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
C为250μL Au1Ag4Pd1 TNPs+250μL 40mM TMB+500μL 0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
D为250μL Au1Ag1Pd1 TNPs+250μL 40mM TMB+500μL 0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
E为250μL 40mM TMB+500μL 0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
图9是本发明实施例3中金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs与金纳米、银纳米、钯纳米、金银纳米、金钯纳米、银钯纳米催化TMB和H2O2反应的的紫外可见吸收光谱图；
图10是本发明实施例4中Au1Ag4Pd1 TNPs催化OPD和H2O2氧化反应紫外可见吸收光谱图；
图10中，曲线A为250μL Au1Ag4Pd1 TNPs+250μL 40mM OPD+500μL0.1M H2O2的紫外可见吸收光谱图；
曲线B为250μL 40mM OPD+H2O2的紫外可见吸收光谱图；
图11是本发明实施例6中基于Au1Ag4Pd1 TNPs催化的OPD显色体系检测0、15、30、60、155、250、250、310、500、625μM H2O2的溶液照片。
图12是本发明实施例6中基于Au1Ag4Pd1 TNPs催化的OPD显色体系检测H2O2的线性拟合曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：Au4Ag1Pd1 TNPs、Au1Ag4Pd1 TNPs、Au1Ag1Pd4 TNPs、Au1Ag1Pd1TNPs的制备
Au4Ag1Pd1 TNPs的制备：
(1)将0.1g氯化十六烷基吡啶加入到25mL超纯水中，再依次加入200μL 50mM四氯金酸水溶液，50μL 50mM硝酸银水溶液，50μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀。
混合溶液中Au、Ag、Pd元素的摩尔比为4：1：1。在剧烈搅拌下，再将3mL新制备的0.1M硼氢化钠水溶液快速加入混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌30分钟。之后将获得的纳米溶胶溶液在35℃水浴中继续反应4小时。
按照这个配比制备的金银钯三金属过氧化物模拟酶命名为Au4Ag1Pd1TNPs。将所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs通过离心纯化后依次进行透射电镜、X射线能谱分析、X射线元素成像和X射线衍射表征。
纯化条件为：将1mL金银钯三金属过氧化物模拟酶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀用超纯水重新溶解。
纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs透射电镜表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs形貌呈单分散的球形，粒径大小以15纳米为主，如附图1所示。
纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶X射线能谱分析表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶主要含有金、银、钯三种元素，如附图2所示。纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶X射线元素成像表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶主要含有金、银、钯三种元素，且金、银、钯三种元素均匀分布于金银钯三金属过氧化物模拟酶内部，如附图3所示。
纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶X射线衍射表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶X射线衍射衍射峰出现属于Au的(220)晶面峰，Ag的(200)和(311)晶面峰，以及Pd的(111)晶面峰，表明所制备的金银钯三金属过氧化物模拟酶的纳米合金，如附图4所示。
Au1Ag4Pd1 TNPs的制备：
(2)将0.1g氯化十六烷基吡啶加入到25mL超纯水中，再依次加入50μL50mM四氯金酸水溶液，200μL 50mM硝酸银水溶液，50μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀。混合溶液中Au、Ag、Pd元素的摩尔比为1：4：1。
在剧烈搅拌下，再将3mL新制备的0.1M硼氢化钠水溶液快速加入混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌30分钟。之后将获得的纳米溶胶溶液在35℃水浴中继续反应4小时。按照这个配比制备的金银钯三金属过氧化物模拟酶命名为Au1Ag4Pd1 TNPs。
将所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag4Pd1 TNPs通过离心纯化后依次进行透射电镜表征。
纯化条件为：将1mL金银钯三金属过氧化物模拟酶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀用超纯水重新溶解。
纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶透射电镜表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶形貌呈弯曲条状，条状的长度以13纳米为主，如附图5所示。
Au1Ag1Pd4 TNPs的制备：
(3)将0.1g氯化十六烷基吡啶加入到25mL超纯水中，再依次加入50μL50mM四氯金酸水溶液，50μL 50mM硝酸银水溶液，200μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀。混合溶液中Au、Ag、Pd元素的摩尔比为1：1：4。
在剧烈搅拌下，再将3mL新制备的0.1M硼氢化钠水溶液快速加入混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌30分钟。之后将获得的纳米溶胶溶液在35℃水浴中继续反应4小时。按照这个配比制备的金银钯三金属过氧化物模拟酶命名为Au1Ag1Pd4 TNPs。将所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs通过离心纯化后依次进行透射电镜表征。
纯化条件为：将1mL金银钯三金属过氧化物模拟酶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀用超纯水重新溶解。纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶透射电镜表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶形貌呈颗粒状，粒径大小以8纳米为主，如附图6所示。
Au1Ag1Pd1 TNPs的制备：
(4)将0.1g氯化十六烷基吡啶加入到25mL超纯水中，再依次加入100μL 50mM四氯金酸水溶液，100μL 50mM硝酸银水溶液，100μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀。混合溶液中Au、Ag、Pd元素的摩尔比为1：1：1。
在剧烈搅拌下，再将3mL新制备的0.1M硼氢化钠水溶液快速加入混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌30分钟。之后将获得的纳米溶胶溶液在35℃水浴中继续反应4小时。按照这个配比制备的金银钯三金属过氧化物模拟酶命名为Au1Ag1Pd1 TNPs。将所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1 TNPs通过离心纯化后依次进行透射电镜表征。纯化条件为：将1mL金银钯三金属过氧化物模拟酶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀用超纯水重新溶解。纯化后的金银钯三金属过氧化物模拟酶透射电镜表征结果表明，所合成的金银钯三金属过氧化物模拟酶形貌呈颗粒状，粒径大小以20纳米为主，如附图7所示。
实施例2：金银钯三金属过氧化物模拟酶催化TMB-H2O2氧化反应。
(1)按照实施例1的制备方法，制备实施例1中图1、图5、图6和图7所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au4Ag1Pd1 TNPs、Au1Ag4Pd1 TNPs、Au1Ag1Pd4 TNPs、Au1Ag1Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM TMB与250μL金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs和500μL 0.1M H2O2混合。随后添加4mL 0.2M pH＝5.25乙酸钠缓冲液。然后，将混合溶液在室温下反应20分钟。
最后，测量氧化产物的紫外-可见吸收光谱。所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化TMB与H2O2之间的氧化反应，使反应体系由无色变蓝色。
所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的TMB-H2O2显色反应在650nm显示出典型吸收峰，且在金银钯三金属过氧化物模拟酶的催化作用下，650nm处的紫外可见吸光度值比不加金银钯三金属过氧化物模拟酶提高7倍，如附图8所示。
(3)按照上述实施案例2步骤(2)，仅将Au4Ag1Pd1 TNPs替换为Au1Ag4Pd1TNPs或Au4Ag1Pd1 TNPs或Au1Ag1Pd1 TNPs，检测紫外可见吸收光谱，结果表明，通过简单调控合成金银钯三金属过氧化物酶前驱体溶液中四氯金酸水溶液、硝酸银水溶液和四氯钯酸钠水溶液的加入体积，可实现金银钯三金属过氧化物酶催化性能的调控，如图8所示。
(4)按照上述实施案例2步骤(2)，在固定H2O2浓度为0.1M的情况下，将TMB的底物浓度从320μM逐渐增加至1300μM，测定650nm处的吸收度值。在固定TMB浓度为40mM的情况下，将H2O2底物浓度从6μM逐渐增加至300μM，测定650nm处的吸收强度。然后，绘制对应的Michaelis-Menten曲线和双倒数Lineweaver-Burk曲线。根据Lineweaver-Burk曲线，计算金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs的Michaelis-Menten常数，对TMB的Km值为0.015mM，对H2O2的Km值为0.022mM。Km表征酶对底物的亲和力，Km值越低表明酶对底物的亲和力越高。金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs对TMB的Km值低于现有专利公开的技术方案(CN 110238411A，一种具有过氧化物酶活性的金属纳米颗粒及制备方法)中大部分单金属和双金属纳米酶。
金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs对H2O2的Km值大大低于技术方案(CN110238411A，一种具有过氧化物酶活性的金属纳米颗粒及制备方法)中所有单金属和双金属纳米酶。
表明本发明专利所制备金银钯三金属过氧化物模拟酶具有高的催化活性，且对H2O2具有显著提高的亲和力。
实施例3：金银钯三金属过氧化物模拟酶与金纳米、银纳米、钯纳米、金银纳米、金钯纳米、银钯纳米催化TMB-H2O2反应催化活性对比。
(1)按照实施例1的制备方法，制备实施例1中图6所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs。
(2)参照实施例1中图6金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方案，仅改变所加入金属盐的种类，制备金纳米、银纳米、钯纳米、金银纳米、金钯纳米、银钯纳米。
将0.1g氯化十六烷基吡啶加入到25mL超纯水中，再加入50μL 50mM四氯金酸水溶液，在剧烈搅拌下，再将3mL新制备的0.1M硼氢化钠水溶液快速加入混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌30分钟。之后将获得的纳米溶胶溶液在35℃水浴中继续反应4小时，制备金纳米。
参考上述步骤，将50μL 50mM四氯金酸水溶液替换为50μL 50mM硝酸银水溶液，制备银纳米。
将50μL 50mM四氯金酸水溶液替换为200μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，制备钯纳米。
将50μL 50mM四氯金酸水溶液替换为加入50μL 50mM四氯金酸水溶液和50μL 50mM硝酸银水溶液，制备金银纳米。
将50μL 50mM四氯金酸水溶液替换为加入50μL 50mM四氯金酸水溶液和200μL50mM四氯钯酸钠水溶液，制备金钯纳米。
将50μL 50mM四氯金酸水溶液替换为加入50μL 50mM硝酸银水溶液和200μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，制备银钯纳米。
(3)参照实施例2步骤(2)，测定Au1Ag1Pd4 TNPs、金纳米、银纳米、钯纳米、金银纳米、金钯纳米、银钯纳米催化TMB-H2O2氧化反应的紫外可见吸收光谱图。结果表明，金纳米、银纳米、钯纳米和金银纳米催化的TMB-H2O2反应在650纳米处的特征吸光度值较小，表明金纳米、银纳米、银钯纳米和金银纳米对TMB-H2O2显色反应催化活性有限。
金钯纳米和钯纳米催化的TMB-H2O2显色反应在650纳米处有较明显特征吸光度峰。相比较，Au1Ag1Pd4 TNPs催化的TMB-H2O2显色反应，在650纳米处的特征吸光度值比金钯纳米高32％，比钯纳米高54％，如图9所示。
TMB-H2O2反应在650纳米处的特征吸光度值越高，说明所产生的显色物质产量越高。结果表明，与使用相同摩尔量的Au、Ag、Pd元素所制备的金纳米、银纳米、钯纳米、金银纳米、金钯纳米、银钯纳米三种单金属纳米催化酶和三种双金属纳米催化酶相比，金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd4 TNPs对TMB-H2O2显色反应具有显著提高的催化活性。
实施例4：金银钯三金属过氧化物模拟酶催化OPD-H2O2显色反应。
(1)按照实施例1的制备方法，制备实施例1中图5所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag4Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM OPD与250μL Au1Ag4Pd1 TNPs和500μL 0.1M H2O2混合。随后添加4mL 0.2M pH＝7.4乙酸钠缓冲液。然后，将混合溶液在60℃下反应20分钟。最后，测量氧化产物的紫外-可见吸收光谱。
所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化OPD与H2O2之间的氧化反应，使反应体系由无色变黄色。所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的OPD-H2O2显色反应在420nm显示出典型的吸收峰，且在金银钯三金属过氧化物模拟酶的催化作用下，420nm处的紫外可见吸光度值比不加金银钯三金属过氧化物模拟酶提高4倍，如附图10所示。
测定金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag4Pd1 TNPs的Michaelis-Menten常数，对OPD的Km值为10.61mM，对H2O2的Km值为0.52mM。
实施例5：金银钯三金属过氧化物模拟酶催化ABTS-H2O2显色反应。
(1)按照实施例1的制备方法，制备将实施例1中图7所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM ABTS与250μL Au1Ag1Pd1 TNPs和500μL 0.1M H2O2混合。随后添加4mL 0.2M pH＝4.4乙酸钠缓冲液。然后，将混合溶液在60℃下反应20分钟。
最后，测量氧化产物的紫外-可见吸收光谱。所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化ABTS与H2O2之间的氧化反应，使反应体系由无色变绿色。所述金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的ABTS-H2O2显色反应在415nm显示出典型的吸收峰，且在金银钯三金属过氧化物模拟酶的催化作用下，415nm处的紫外可见吸光度值比不加金银钯三金属过氧化物模拟酶的反应体系提高2倍。
测定金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1 TNPs对ABTS的Km值为71.53mM，对H2O2的Km值为0.011mM。
实施例6：基于金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的OPD显色体系，检测过氧化氢。
(1)按照实施例1的制备方法，制备将实施例1中图5所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag4Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM OPD和250μL Au1Ag4Pd1 TNPs加入7.5mL 0.2M pH7.4的乙酸钠缓冲液中，得到比色检测混合液。
(3)将不同浓度的过氧化氢溶液加入上述比色检测混合液中，混合均匀后60℃反应20分钟。金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的OPD显色系统，溶液颜色随着H2O2浓度的增加从无色逐渐加深为深黄色，如附图11所示。
利用紫外可见光谱仪，检测溶液420纳米处的吸光度值。420纳米处的吸光度值随H2O2浓度的增加而线性增加，如附图12所示。线性方程为y＝0.1687+0.0012x(R2＝0.9914)，线性范围为15到625μM，计算出的检出限为5.6μM。
实施例7：基于金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的ABTS显色体系，检测过氧化氢。
(1)按照实施例1的制备方法，制备将实施例1中图7所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM ABTS和250μL Au1Ag1Pd1 TNPs加入7.5mL 0.2M pH 4.4的乙酸钠缓冲液中，得到比色检测混合液。
(3)将不同浓度的过氧化氢溶液加入上述比色检测混合液中，混合均匀后60℃反应20分钟。利用紫外可见光谱仪，检测溶液415纳米处的吸光度值。金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的ABTS显色系统，在415纳米处的吸光度值随过氧化氢浓度的增加而线性增加，线性方程为y＝0.2661+0.0033x(R2＝0.9945)，线性范围为6到625μM，计算出的检出限为3.1μM。
实施例8：基于金银钯三金属过氧化物模拟酶催化的ABTS-H2O2显色反应，检测硫化氢根离子。
(1)按照实施例1的制备方法，制备将实施例1中图7所述金银钯三金属过氧化物模拟酶Au1Ag1Pd1 TNPs。
(2)将250μL 40mM OPD、250μL Au1Ag1Pd1 TNPs和500μL 0.1M H2O2加入4mL 0.2MpH 7.4乙酸钠缓冲液，得到比色检测混合液。
(3)将不同浓度的HS—溶液加入上述比色检测混合液中，混合均匀后室温反应20分钟。利用紫外可见光谱仪，检测溶液415纳米处的吸光度值。HS—可以有效抑制金银钯三金属过氧化物模拟酶的过氧化物酶样活性。415纳米处的吸光度值随HS—浓度的增加而线性减小，线性方程为y＝1.35-0.52x(R2＝0.9916)，线性范围为5到160μM，计算出的检出限为2.3μM。
以不同金属离子，包括K+，Fe2+，Ca2+，Mg2+和Zn2+、半胱氨酸、谷氨酸、葡萄糖、尿素和乳糖作为干扰物，所述干扰物对金银钯三金属过氧化物模拟酶的过氧化物酶样活性几乎没有抑制作用。所提供的基于金银钯三金属过氧化物模拟酶的比色分析方法检测硫化氢根离子，具有良好的选择性。
进一步通过检测胎牛血清中HS—含量，研究本发明所提供基于金银钯三金属过氧化物模拟酶的HS—比色分析法的实际应用能力。
用pH＝7.0的磷酸盐缓冲液将胎牛血清样品稀释1000倍。在最初的胎牛血清样本中未检测到HS—。然后，将不同浓度的HS—加入上述胎牛血清中。检测HS—的回收率在89.54％至108.9％之间，相对标准偏差(RSD低于2.84％)。
表明本发明所提供的基于金银钯三金属过氧化物模拟酶的比色分析方法，可用于实际血清样品中的硫化氢根离子的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
(1)将氯化十六烷基吡啶加入到超纯水中，再依次加入20-200μL 50mM四氯金酸水溶液、50-200μL 50mM硝酸银水溶液、50-200μL 50mM四氯钯酸钠水溶液，混合均匀，得到混合溶液；
(2)在剧烈搅拌下，再将预先制备得到的0.1M 2-5mL硼氢化钠水溶液快速加入步骤(1)中制备得到的混合溶液中，并在室温下剧烈搅拌反应0.5-1小时，直至形成棕色纳米溶胶，将获得的纳米溶胶溶液在35-50℃水浴中继续反应4-10小时后得到金银钯三金属过氧化物模拟酶。
2.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法还包括分离纯化。
3.根据权利要求2所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方法如下：
将步骤(2)中水浴反应后所得溶胶在12500rpm下离心30分钟，去除上清液后，将沉淀物用超纯水或双蒸水重新溶解。
4.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为4：1：1；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为200μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为50μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为50μL。
5.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：4：1；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为50μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为200μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为50μL。
6.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：1：4；
所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为50μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为50μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为200μL。
7.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中前驱体混合溶液中所得Au、Ag、Pd三种元素的摩尔比为1：1：1；所述四氯金酸水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯金酸水溶液的加入体积为100μL；所述硝酸银水溶液的摩尔浓度为50mM，所述硝酸银水溶液的加入体积为100μL；所述四氯钯酸钠水溶液的摩尔浓度为50mM，所述四氯钯酸钠水溶液的加入体积为100μL。
8.根据权利要求1所述的金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法，其特征在于，所述氯化十六烷基吡啶的加入量为0.1g。
9.一种采用如权利要求1-8任意一项所述金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法在制备金属纳米酶中的应用。
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