HU199191B

HU199191B - Immunological method for indicating herbicides

Info

Publication number: HU199191B
Application number: HU883763A
Authority: HU
Inventors: Wolfgang Pfeiffer; Wolfgang Mies; Rudolf H Dittel
Original assignee: Pfeiffer Bioanalytik Kg
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-18
Publication date: 1990-01-29
Also published as: ATE114817T1; CA1339721C; DE3723726A1; EP0300381B1; EP0300381A2; RU1838787C; ES2068817T3; JPH01199164A; DE3852227D1; HUT49411A; JP2659220B2; EP0300381A3; DD285421A5; US5100776A

Description

A találmány tárgya immunológiai eljárás a talaj-, illetve ivóvízben előforduló szenynyező anyagok, főleg növényvédőszerek kimutatására.

Az utóbbi időben riasztó beszámolók váltak ismertté a gyakran nagyobb szabású tisztítás nélkül ivóvízként felhasználásra kerülő talajvíz műtrágyából származó nitráttal, kémiai tisztítókból származó klórozott oldószerekkel, herbicidekkel, peszticidekkel, inszekticidekkel és bomlási termékeikkel történő szennyeződéséről. A legproblematikusabb az atrazin nevű növényvédőszer, valamint metabolitjai jelenléte az ivóvízben.

Az atrazin, amelynek kémiai neve 2-klór-4-et il-a mi no-6-izopropil-a minő-1,3,5-triazin, szagtalan fehér port képez; kereken 30 éve használják világszerte gyomirtószerként. Hatásmechanizmusa, hogy a fotoszintézist gátolja, így a „gaz gyorsan pusztul. Főleg kukoricatáblákon végzett gyomirtáshoz használják az atrazint, a Német Szövetségi Köztársaság kukoricatábláinak 90%-át kezelik vele, így évi ezer tonnával az atrazin a legnagyobb mennyiségben alkalmazott herbicid hatóanyag. Az atrazin mellett egyéb triazin-származékokat is használnak herbicidként, előfordulásuk a talaj- és élővízben bizonyított tény. Az 1. táblázat áttekintést nyújt a legfontosabb triazin-herbicidek felől.

1. táblázat

A legfontosabb triazin-herbicidek (az alapváz: lásd csatolt rajzon az (I) képletet) Ametryn: R'=-S-CH₃, R²=-NH-CH (CH3)2, R³=-NH-C2H₅

Atralon: R‘=-O-CH₃, R²=-NH-CH (CH3)2, R³=-NH-C2H₅

Atrazin: R‘=C1, R²=-NH-C2H5, R³=-NH-CH(CH3)₂

Aziprotryn: R'=-S-CH₃, R²=-NH-CH(CH3)2, R³=N3

Desmetryn: R'=-S-CH₃, R²=-NH-CH (CH3)2 R³=-NH-CH3 dipropetryn: R'=-S-C₂h₅, R²=R³=-NH-CH (CH₃)₂ methoprotryn: R‘ = -S-CH₃, R²=-NH-CH(CH3)2, R³=-NH-C3H₆-OCH, prometryn: R'=-S-CH₃, R²=R³=-NH-C3H7 propazin: R'=CI, R²=R³=-NH-C2H₅simazin: R'=C1, R²=R³=-NH-C₂H₅terbumeton: R‘=-O-CH₃, R², R³ mint terbutryn-nél terbuthylazin: R‘=C1, R², R³ mint terbutrynnél terbutryn: R'=-S-CH₃, R²=-NH-CH(CH3)2, R³=-NH-C2H5.

Hosszú időn keresztül abból indultak ki, hogy a fenti triazin-származékok alkalmazásuk után lebomlanak, talajrészecskékhez kötődnek, és nem veszélyeztetik a talajvizet. Bebizonyosodott azonban, hogy a vegyületek eléggé stabilak, és felezési idejük (amely alatt a talajban lévő hatóanyag fele lebomlik) két és öt hónap közötti idő. Homokos talajból, agyagban szegény talajból a hatóanyag vi2 szonylag könnyen kimosódik a talajvízbe, ahol a lebomlás még lassabban megy végbe, így triazin maradékot még évek múltán is felbukkanhatnak.

Az ivóvíz-rendelet, valamint a közös Piac „Irányelvek az emberi fogyasztásra kerülő víz minőségéről c. rendelete az ivóvízben még tolerálható mennyiségek maximális határértékét tartalmazza. Egyes anyagok esetén a maximális határérték 0,0001 mg/1 (lOOng/1), és az ilyen anyagok összmennyisége nem haladja meg a 0,0005 mg/1 (500 ng/1) értékét.

Hogy a kimutatás pontos legyen, az alkalmazott eljárás kimutathatósági határa 1—2 nagyságrenddel a kimutatandó koncentráció alatt kellene hogy legyen. A számításba jövő anyagok nagy száma és az alacsony határértékek azonban kémiai elemzés szempontjából nagy problémát jelentenek. Fizikai-kémiai eljárások (GC, GC-MS, HPLC) esetén a vegyi anyagok azonosítása, mennyiségi meghatározása bonyolult és drága feldúsítási eljárásokat igényel, a mérés maga költséges és időigényes, emellett a vegyületek toxicitásáról nem ad képet..Maradnak a korszerű biokémiai elemzési eljárások, mint amilyenek az immunológiai tesztek, az ún. immuno-assay tesztek, amelyekben tesztanyagként sejtek alkotórészei szerepelnek. A vízelemzés területén az immunológiai analitika igen gyors és érzékeny vizsgálati módszer, gyakran gyors, költségkímélő és hatékony környezet-feltérképezést biztosít.

Az immuno-assay módszerek nagy érzékenységű teszt-rendszerek, amelyekkel az antigén-antitest reakció alapján anyagok mennyiségi meghatározása végezhető el. Laboratóriumi állatok immunizálása révén beindítják az antitestek termelődését, majd az állat vérsavójából vagy az antitesteket termelő limfocitákból az antitesteket kinyerik, és affinitás-kromatográfiásan, például agarózzal töltött oszlopon tisztítják. Az antitestek a magasabb rendű állatok egyik természetes védelmi rendszere. A védőfunkció azon alapul, hogy természetes fertőzés vagy mesterséges fertőzés alapján fajlagos antitestek képződnek. Az antitestek képződésének egyik előfeltétele egy bizonyos móltömeg. Amennyiben igen kicsi molekulára, például egy növényvédőszer molekuláira fajlagos antitest képződését akarjuk kiváltani, a molekulákat (hapténeket) immunizálás előtt nagy molekulájú hordozó molekulához, például proteinhez (hémocianin, szarvasmarha szérumalbumin, ovalbumin, tiroglobulin, polilizin, stb.) kell kapcsolnunk.

Vegyi anyag kimutatására az antigén-antitest-kötés használható, amely akkor alakul ki, ha a vegyi anyagot antigénként tartalmazó minta az antitesttel kerül érintkezésbe. A klasszikus immuno-assay tesztben a meghatározandó antigének konkurrálnak azonos fajlagosságú, radioaktív jelzéssel ellátott antigénekkel az antitest kötőhelyeiért. Az

-2199191 utóbbi időben az enzim-immuno-assay módszer (EIA) teret hódított a radioimmuno-assay (RIA) rovására. Az előbbi esetén a radioaktív antigén helyébe egy enzim-antigén-konjugátum lép, amely a mintában lévő antigénnél versenyez majd az antitest szabad kötési helyeiért. Az említett kompetitív (vetélkedő) EIA teszt során az enzimmel jelzett antigén meghatározott mennyisége versenyez a mintában lévő antigénnel az antitest kötési helyeiért, amelyek adszorpció .révén vagy kovalensen hordozó felületen, például polisztirol-felületen rögzítve vannak. Ha a mintában kevés az antigén, a hordozó sok enzim-tracert köt meg (nagy szubsztrátum-fogyasztás), ha viszont a mintában sok az antigén, csak kevés enzim-tracer rögzül a hordozón (kis szubsztrátum-fogyasztás). Az enzim-tracer kötésének a gátlása tehát a minta antigén-koncentrációjának függvénye. A meg nem kötött enzim-tracer lemosása után a szubsztrátum-fogyasztás alapján a kötött, enzimmel jelzett antigén részaránya és ezzel a minta antigén-koncentrációja meghatározható. Az enzim-tracer kötött mennyiségét a reakcióba lépett (fogyasztott) szubsztrátum (optikai) abszorpciója alapján határozzuk meg.

A fenti technikával számos peszticid anyagra fajlagos antitestek képződését váltották ki, majd immuno-assay módszereket fejlesztettek ki a mérgező anyagok gyors, olcsó és nagyon fajlagos kimutatása céljából. Gyakran azonban előfordul, hogy az immuno-assay keresztreakciók következtében nem teszi lehetővé az anyag egyértelmű azonosítását és mennyiségi meghatározását. Keresztreakción azt a jelenséget értjük, hogy az antitestek különböző szerkezetű molekulákban azonos funkciókat ismernek fel és ezért ezeket a különböző molekulákat egy hatástani osztályba sorolják, azaz nem tudnak különbséget tenni közöttük. Ez az effektus igen jellemző a kis antigén-molekulákra, mert ezeket hordozó mátrixhoz (proteinhez) kell kapcsolni, így csak a hordozó molekula által el nem fedett rész, nem az egész antigén-molekula működik felismerési területként. Ha két különböző szerkezetű molekulának ezen szabad, hozzáférhető része hasonló felépítésű, az immuno-assay nem tudja megkülönböztetni őket. Másrészt sok esetben a keresztreakció éppenséggel kívánatos, mert így nemcsak az az antigén mérhető, amellyel az antitestet előállították, hanem a hasonló kémiai szerkezetű, illetve biológiai hatású anyagok is meghatározhatóvá válnak. A keresztreakciók tudatos kihasználása révén különböző, de egy hatástani osztályba tartozó anyagok egyetlenegy teszttel határozhatók meg, ami igen értékes az eddig fel nem derített vegyűletek toxikológiai megítélése szempontjából. Az állatkísérletek és bioassay kísérletek mennyisége a legszükségesebbre redukálható, mert az ökotoxikológiai szempontból eddig nem vizsgált ve4 gyületek esetleges veszélyessége már a fent említett hatástani besorolás révén válik felismerhetővé.

A találmány feladata olyan immunológiai kimutatási eljárás kidolgozása volt, amellyel triazin-herbicidek és kémiailag hasonló szerkezetű, illetve hasonló biológiai hatású vegyületek mint egy hatástani osztályba tartozó anyagokként natározhatók meg, de másrészt az egyes vegyűletek egyértelmű azonosítását még bonyolult elegyek esetén is lehetővé teszi.

A fenti feladatot immunológiai eljárással oldottuk meg, amellyel (I) általános képletű vegyűletek határozhatók meg. Az (I) általános képletben

R¹ jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocso, P°^rtR jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocsoport, azidocsoport vagy alkilcsoportként

1—4 szénatomot tartalmazó alkoxialkilaminocsoport és

R³ jelentése halogénatom vagyl—4 szénatomos alkoxi- vagy alkiltiocsoport.

A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy (I) általános képletű vegyületet az R¹ vagy R² vagy R³ szubsztituensével mátrixhoz kapcsolva az (I) általános képletű antigén-vegyület molekulájának csak egy részét tesszük hozzáférhetővé, majd laboratóriumi állatok immunizálása révén a molekula hozzáférhető részére különösen fajlagos, A, B vagy C jelű antitestet hozunk létre, és az (I) általános képletű vegyület kimutatására a vegyületet vélhetően tartalmazó mintát az említett A, B és C antitestek közül egyszerre vagy különböző sorrendben egymásután legalább kettővel reagáltatjuk, és az antigén-antitest-kötés alapján az (I) általános képletű vegyületet mennyiségileg és minőségileg meghatározzuk.

Az eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint az immunológiai vizsgálathoz az A, B és C antitesteket vizsgálati sorozatokban alkalmazzuk az alábbi sorrendben:

1. sorozat: ABC

2. sorozat: B C A

3. sorozat: C A B.

A meghatározandó anyagot tartalmazó mintát előnyösen külön-külön reagáltatjuk az antitestekkel. Ez úgy lehetséges, hogy a vizsgálandó oldatot pipettával az antitesttel kibélelt reakcióedénybe, illetve mikrotiterlemez lyukaiba juttatjuk.

Előnyös az is, ha a vizsgálandó mintát először a sorozat első antitestével reagáltatjuk, utána a reakcióba nem lépett maradékot elválasztjuk és azt a sorozat következő antitestével érintkeztetjük.

Speciális esetekben a találmány szerinti eljárás alkalmazása során előnyös lehet, ha a laboratóriumi állatokból nyert szérum, illetve antitesteket termelő limfociták feldolgozása során a hibridoma-technika segítségével monoklónális antitesteket nyerünk, és ezeket alkalmazzuk antitestként az eljárásban.

-3199191

A találmány szerinti immunológiai teszt lehetővé teszi, hogy az adott (I) képletű vegyület mellett a keresztreakciók révén hasonló szerkezetű vegyületeket, valamint ezektől szerkezetben különböző, de biológiailag azonos irányú hatással és hasonló kötődési vonzalmakkal rendelkező vegyületeket is meghatározhassunk.

Az antigén-antitest reakció immunológiai kimutatását előnyösen olyan antigénnel végezzük, amely radioaktív jelzéssel ellátott, vagy enzimhez, fluoreszkáló anyaghoz vagy elektromos jeleket kibocsátó anyaghoz (bioszenzorhoz) kapcsolt. A mintában lévő antigént és a jelzett, illetve kötött antigént versenyeztetjük az antitest kötési helyeiért, utána az antitesthez hozzá nem kötött, szabad reagenst elmossuk, és a radioaktív sugárzás, az optikai abszorpció, a fluoreszcencia sugárzás vagy az elektromos jel megmérésével meghatározzuk az oldat antigén-koncentrációját.

A találmány szerinti immunológiai eljárás lehetővé teszi, hogy egy bizonyos hatástani osztályba tartozó anyagokat kimutassunk, ugyanakkor a hatástani osztályba tartozó különböző anyagokat külön-külön is azonosítjuk. A találmány szerinti teszt gyors, igen fajlagos és nem költséges, és a környezet-elemzés során szükségessé váló nagyszámú minta elemzésével megbirkózik; az utóbbi a hagyományos elemzési módszerekkel — automatizálásuk ellenére — nem volt lehetséges. Az eljárás kidolgozása során arra törekedtünk, hogy toxicitás szempontjából eddig nem vizsgált vegyületek hatástani csoportokba való sorolás révén ökológiai szempontból felmérhetők legyenek.

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.

1. példa

Az alábbiakban az (I) általános képletű vegyületek egyik jellegzetes képviselője, az atrazin molekula egy-egy oldalára fajlagos A, B és C jelű antitestek előállítását, és az ezekkel végzett immunológiai teszt végrehajtását írjuk le.

Az A jelű antitest az atrazin-molekula (II) részképletű oldala ellen irányul főleg. Előállításához először az ametryn triazin-származék metiltioéter-csoportját szulfoxidáljuk, majd az így módosított ametrynt közvetlenül a szarvasmarha szérumalbuminhoz kapcsoljuk. A B jelű antitest főleg az atrazin (III) részképletű oldalára fajlagos; előállításához a simazin nevű triazin-származék etilaminocsoportjainak egyikét kapcsoljuk a proteinhez. a karbodiimid módszer segítségével. Végül az atrazin (IV) részképletű oldalát előnyben részesítő C jelű antitestet úgy állítjuk elő, hogy a propazin nevű herbicid hatóanyagot az egyik izopropilamin-csoportján keresztül hordozó mátrixhoz kapcsoljuk.

A fentiek szerint előállított konjugátumokat az A, B és C antitestek előállítása céljából laboratóriumi házinyulakra juttatjuk injekcióval, majd az antitesteket az immunizált állatok szérumából ismert módon kinyerjük, illetve affinitás-kromatográfiásan tisztítjuk, a szubsztituensek alapján.

A kapott antitesteket polisztirol felületű mikrotiterlemezek lyukfalain adszorbeáltatjuk, az alábbiak szerint: az antitestet karbonát-pufferben (Na₂CO₂/NaHCO₃; 50 mmól/ /1, pH 9,6) feloldjuk és az oldatból 0,25— 0,25 ml-t a mikroliterlemez lyukaiba pipettálunk. A lemezeket szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáljuk, majd TBS-pufferrel mossuk. A nedvesség eltávolítására a lemezeket jól kirázzuk, majd száraz helyen —20°C-on tároljuk. Elemzés céljából a megvizsgálandó vizes minta 180 μΐ-jét (a mintában a meghatározandó anyag koncentrációja 1 pg/l és 200 mg/1 közötti) a lyukakba töltjük, majd 50 μΙ enzimtracert (az antitestnek megfelelő triazin-származék és alkálikus foszfatáz konjugátumát) adjuk hozzá. Amennyiben az A antitestet alkalmazzuk, az enzimet ametryn-nel kapcsoljuk össze, míg B, illetve C antitest esetén simazint, illetve propazint alkalmazunk.

A mikrotiterlemez vízszintes irányú rövid rázásával az oldatokat összekeverjük. A lemezt 20°C-on I órán át inkubáljuk, majd a lemezt TBS-pufferrel lemosva (50 mmól/i trisz(hidroximetil)-aminometán, 1 mmól/1 MgCl₂, 50 mmól/1 NaCl, pH 7,8, sósavval, 0,05% polioxietilén-szorbitán-monooleát) az antitestek kötéshelyeihez hozzá nem kötött összes molekulát eltávolítjuk. A kötött enzimtracer mennyiségi meghatározására mindegyik lyukba 125 μΐ foszfatáz-szubsztrátum-oldatot töltünk (1 mg p-nitrofenil-foszfát/1 ml karbonátpuffer). Az enzimes reakció 20°C-on is lezajlik, de melegítéssel meggyorsíthatjuk. Az egyes lyukakban lévő oldat optikai abszorpcióját merőlegesen sugárzó fotométerrel mérjük 405 nm hullámhosszon.

Amennyiben az érzékenységet fokozni kívánjuk, a lemezt 4°C-on egy éjszakán át inkubáljuk. Tudnunk kell azonban, hogy különleges tiszta vegyszerek, eszközök, helyiségek nélkül a ppt-tartományban reprodukálható eredmények nem érhetők el.

A mintában lévő antigén koncentrációjának kiszámítása az alábbi elgondolásokon alapul. Az enzim-tracer azokon a szabad kötéshelyeken kötődik, amelyeket a mintában lévő antigén meghagyott. így, ha a mintában sok az antigén, kevés hely marad az enzimmel jelzett antigénnek, míg kis koncentrációjú minta esetén sok enzimes antigén tud kötődni. A megkötött enzim-tracer mennyisége tehát a minta antigén-koncentrációjának függvénye. Ez a mennyiség mérhetően kifejlődik az átalakult szubsztrátum optikai abszorpciójában (színreakció színtelentől sárgára).

-4199191

Számítás

Az ismeretlen koncentrációjú minta (B= =Ab—A„b) ésanullminta (üresminta) (BO= =Abo-A„b) közötti abszorpciós arány:

B __ (Ab—A„b)

BO Abo—A„b) (B/BO):az antigén (B) jelenlétében történt tracer-megkötés és az antigén (B) távollétében történt tracer-megkötés közötti arány.

Abo: a 405 nm-en mérhető abszorpció minta az enzim-tracer megkötésének mértéke antigén (herbicid) távollétében.

Ab: a 405 nm-en mért abszorpció mint az enzim-tracer megkötésének mértéke ismeretlen koncentrációjú antigén (herbicid) jelenlétében (minta).

AuB: a 405 nm-en mért abszorpció mint az enzim-tracer megkötésének mértéke fal melletti antitestek távollétében.

Ha a B/BO arányt az y-tengelyen, a herbicid koncentrációjának logaritmusát az x-tengelyen jelöljük, szigmoid görbe-lefútást kapunk. Felmerült, hogy a jobb kezelhetőség érdekében szükséges linearizálást úgy lehetne végezni, hogy az y-tengelyt szintén logaritmizáljuk (logit/log transzformálás). A kiértékelhetőség szempontjából azonban praktikusabbnak bizonyult, ha a gátlást (ínhibíciót, 1-B/BO) a normál-eloszlás integrálján keresztül transzformáljuk. A gyakorlatban tehát úgy járunk el, hogy a százalékos gátlást ((1-B/BO) X100) vezetjük fel valószínűség-papírra a gyakoriság helyett. Ezzel a szigmoid görbe linearizálódik.

A mintában lévő antigén kimutatását úgy végezhetjük, hogy az egyes sorozatokban a minta antigén-tartalmát mindegyik alkalmazott antitesttel reagáltatjuk, külön-külön vagy egymás után. Az „egymásután módszer esetén egy meghatározáson belül mindegyik so15 rozatban .zonos gátlást kapunk, ha azok a hozzáférhető molekularészek, amelyekre az egyes antitestek fajlagosan reagálnak, különböző molekulákon vannak jelen. Amennyiben azonban legalább két ilyen exponált, hoz20 záférhető molekularész egy molekulán belül van, eltérések lépnek fel. Ez azzal magyarázható meg, hogy a két exponált résszel rendelkező molekula (amely két oldalon antitest-kötést alakít ki) kiválik az oldatból, és miután az oldatot a következő lyukba átvittük, ott kötés kialakulás szempontjából ez a molekula már hiányzik. Ha ezt a mechanizmust végiggondoljuk az összes kötési lehetőségre, az alábbi gátlási mátrixot állíthatjuk fel (2. táb30 lázat), amelyből a multi-eljárásban követendő alapstruktúrákat vezethetjük le.

2. táblázat (gátlási mátrix)

1. sorozat 7. sorozat 3. sorozat értelmezés

ABC + + +

B C A C A B + + + + + ₊ a (II), (III), (IV) részképletű hozzáférhető molekularészek egymástól függetlenül vannak jelen (3 komponens) + - - + - - a (II), (III), (IV) részképletű hozzáférhető molekularészek egy molekulán helyezkednek el (1 komponens) + + - + + - a (II) és a (III) részképletű molekularész egy és ugyanazon molekulán van (2 komponens)

-5199191

Táblázat	/folytatás/
1. sorozat	2. sorozat	3. sorozat

+- + - + a (II) és.a (IV) részképletú molekularész egy és ugyanazon molekulán van (2 komponens)

- + + + - a (III) és a (IV) részképletű molekularész egy és ugyanazon molekulán van (2 komponens) + - az enzim-tracer megkötése gátolt - = az enzim-tracer megkötése nem gátolt

Ha A, B és C mellett további antitesteket készítünk, a fenti mátrix bővíthető, így bonyolultabb molekulákat illetve még több komponenses elegyeket is tudunk elemezni.

2. példa

A vizsgálat tárgya a triazin alapvázú herbicidek és a 3. táblázatban összeállított anyagok keresztreakcióra való képessége volt annak érdekében, hogy a 3. táblázat szerinti anyagokat a hatástani hovatartozása szerint lehessen osztályozni. Az immunizálást úgy

3q végeztük, hogy az alkil-, izopropil- és etilcsoportokat tettük hozzáférhetővé, így nagy atrazin-fajlagosságot biztosítva. Az alábbi táblázatban az egyes anyagcsoportok fontos képviselőinek százalékos gátlási értékét adjuk meg. Az erős antigén-antitest-kötés az enzimes kimutatási rendszer ugyanilyen erős gátlását eredményezi. A gátlás mértékéből tehát az antitest és antigén közötti kölcsönhatás erősségére következtethetünk.

3. táblázat

Különböző herbicidek keresztreakcióra való képessége 2 ppbkoncentráció esetén

Hatóanyag osztály	vegyület	gátlás '
triazin típus	atrazin	6,0
	hidroxi-3-izopropil-5-etil- -triazin	5,3
	ametryn	21,4
	dezetil-ametryn	.16,0
	dezizopropil-ametryn	16,5
anilid típus	metazachlor	15,2
karbamid típus	metabenzthiazuron	8,3

-6199191

Hatóanyag vegyület osztály gátlás % trifluorbenzimida-

zol típus	fenazaflor	4,4
aminotriazin típus	metribuzin	6,7
uracil típus	bromaci1	n,i

A gátlási értékek azt mutatják, hogy a megadott koncentráció-tartományban (2ppb) az antitestek szelektivitása nem százszázalékosan érvényesül ugyan, de a felsorolt vegyületek, amelyek szintén a II. fotorendszerre vannak hatással (II. fotorendszer: a fotoszintézis a-klorofill, b-klorofill és P₆₈₀-pigment tartalmú strukturális-funkcionális egysége), szintén kimutathatók. A találmány szerinti immuno-assay koncepciója lehetővé teszi, hogy a keresztreakciók tudatos kihasználásával az elegyben lévő egyes anyagok szerkezetére következtethessünk (lásd 1. példa).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Immunológiai eljárás (I) általános képletű vegyületek kimutatására — az (I) általános képletben

R² jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocsoport,

R³ jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocsoport, azidocsoport vagy alkilcsoportonként

1—4 szénatomot tartalmazó alkoxialkilaminocsoport és

R¹ jelentése halogénatom vágy 1—4 szénatomos alkoxi- vagy alkiltiocsoport — azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletű vegyületet az R¹ vagy R² vagy R³ szubsztituensével mátrixhoz kapcsolva az (I) általános képletű antigén-vegyület molekulájának csak egy részét tesszük hozzáférhetővé, majd laboratóriumi állatoknak az említett antigénnel végzett immunizálása révén a molekula hozzáférhető részére különösen fajlagos, A, B vagy C jelű antitestet nyerünk ki és az (I) általános képletű vegyület kimutatására a vegyületet vélhetően tartalmazó mintát az említett A, B és C antitestek közül egyszerre vagy különböző sorrendben egymás után legalább kettővel reagáltatjuk, és az antigén-antitest-kötés alapján az (I) általános képletű vegyületet mennyiségileg és

20 minőségileg meghatározzuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunológiai kimutatás során három, A, B és C jelű antitestet alkalmazunk mérési sorozatokban az alábbi sor25 rendben:

1. sorozat: ABC,

2. sorozat: B C A,
3. sorozat: C A B.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, 30 azzal jellemezve, hogy a mintát az alkalmazott antitestek mindegyikével külön-kűlön reagáltatjuk.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, 35 azzal jellemezve, hogy a mintát a soron lévő sorozat első antitestével reagáltatjuk, az el nem reagált felülúszót elválasztjuk és a sorozat következő antitestével reagáltatjuk.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike sze40 rinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitest tekként monokolonális antitesteket alkalmazunk.

i 6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I)

45 általános képletű anyagok mellett keresztreakciók révén szerkezetileg hasonló vegyületeket, vagy szerkezetben különböző, de biológiai hatásban és kötődési preferenciában hasonló vegyületeket is kimutatunk.

50 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunológiai kimutatást radioaktív izotóp, enzim, fluoreszkáló anyag vagy elektromos jeleket kibocsátó anyag segítségével végezzük.