CN113150140B - 一种sox6二价纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种sox6二价纳米抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113150140B
CN113150140B CN202110095118.7A CN202110095118A CN113150140B CN 113150140 B CN113150140 B CN 113150140B CN 202110095118 A CN202110095118 A CN 202110095118A CN 113150140 B CN113150140 B CN 113150140B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sox6
ser
gly
bivalent
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110095118.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113150140A (zh
Inventor
张俊珍
刘学贤
范瑞文
于雷涛
郭湘
董常生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Agricultural University
Original Assignee
Shanxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Agricultural University filed Critical Shanxi Agricultural University
Priority to CN202110095118.7A priority Critical patent/CN113150140B/zh
Publication of CN113150140A publication Critical patent/CN113150140A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113150140B publication Critical patent/CN113150140B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明提供了一种SOX6二价纳米抗体及其应用，属于生物工程技术领域，所述SOX6二价纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。采用本发明提供的SOX6二价纳米抗体能够特异性结合SOX6蛋白，对SOX6蛋白的灵敏度为0.664μg/ml，SOX6二价纳米抗体能够防治黑色素瘤。

Description

一种SOX6二价纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种SOX6二价纳米抗体及其应用。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。纳米抗体是一类具有体积小(纳米级)特点的新一代抗体，在各种组织中渗透能力强，在困难环境中稳定性好，在微生物系统中易于生产。纳米抗体实际上是具有结合能力的抗体的最小片段。纳米体的独特特性和特性使其成为开发新的基于抗体的治疗方法的合适候选对象。在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。在这方面，纳米抗体是许多研究人员和生物制药公司感兴趣的诊断和治疗应用。
黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性癌症。性别决定区域Y-box(SOX)家族由20个基因组成。这些基因编码转录因子和一个高流动性组(HMG)盒DNA结合域，这与性别决定区域(Sry)蛋白质非常相似。SOX6是在小鼠黑色素瘤细胞(B16)中表达，SOX6的下调并不影响B16细胞中的MITF水平。SOX6抑制细胞周期蛋白D1基因胰腺b细胞表达及e-球蛋白表达。SOX6可以促进黑色素瘤细胞的生长和增殖，制备SOX6二价纳米抗体，一方面可以成为利用分子成像技术研究SOX6作用机制的示踪工具，另一方面可以作为抑制黑素瘤生长的小分子工具。
目前，还没有特异性结合SOX6蛋白的二价纳米抗体的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SOX6二价纳米抗体及其应用，采用本发明提供的SOX6二价纳米抗体能够特异性结合SOX6蛋白。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种SOX6二价纳米抗体，所述SOX6二价纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种编码上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备结合SOX6蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备防治黑色素瘤的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞迁移的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞侵袭的药物中的应用。
本发明提供了一种SOX6二价纳米抗体及其应用，所述SOX6二价纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。采用本发明提供的SOX6二价纳米抗体能够特异性结合SOX6蛋白，所述SOX6二价纳米抗体能够防治黑色素瘤。
附图说明
图1为SOX6二价纳米抗体的蛋白电泳图；
图2为SOX6二价纳米抗体对B16细胞增殖的影响；
图3为SOX6二价纳米抗体对B16细胞划痕的影响；
图4为SOX6二价纳米抗体对B16细胞侵袭的影响；
图5为SOX6二价纳米抗体在B16细胞中的定位。
具体实施方式
本发明提供了一种SOX6二价纳米抗体，所述SOX6二价纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSGGGGSESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSRPLWP。
本发明还提供了一种编码上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGCCGGGCGGTAGCCTGCGTCTGAGTTGTGCAGCACCGGGTTTTAGTCTGAGTAGTTATCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGAGTCCGGGTAAAGGTCCGGAATGGGTTAGTACCATTGCCGCCAGTAGCGGCAATACCTGGTATGCCGATAGCGTGAAAGGTCGCTTTACCATTAGCAAAGATAATGCAAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAATACCCTGAAACCGGAAGATACCGCACTGTATTATTGTGCAAAACGTAATCGTGCAGGTCTGAGTGCCTATGATTATTGGGGTCAGGGCATTCAGGTTACCGTTAGTGGCGGTGGCGGCAGTGAAAGCGGTGGCGGTCTGGTGCAACCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGAGTTGTGCGGCAAGCGGCTTTACCCTGGGCGGCTGGAATATTGGTTGGTTTCGTCAGGCCCCGGGTAAAGAACGTGAAGGCGTTCTGTGTATTAGCGATAGCGGCGAAAGCGTTTATTATCTGGATAGCGTGAAGGGCCGTTTTACCATTTCAAGTGATTATGCCGAAAATACCGTTTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCGGAGGATACCGCCATCTATTTTTGTGCCGCAACCTATTATCGCTGCAGTGATTATGCGCCGGAATTTTCAAGCTGGGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTGAGTAGTGCCCATCATAGTGAAGATCCGAGCAGTCGTCCGCTGTGGCCG。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备结合SOX6蛋白的药物中的应用。在本发明中，所述药物中以SOX6二价纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型和制备方法没有特殊限定，采用SOX6二价纳米抗体在医学上可接受的剂型和常规剂型的制备方法制备即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备防治黑色素瘤的药物中的应用。在本发明中，所述药物中以SOX6二价纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型和制备方法没有特殊限定，采用SOX6二价纳米抗体在医学上可接受的剂型和常规剂型的制备方法制备即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞增殖的药物中的应用。在本发明中，所述药物中以SOX6二价纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型和制备方法没有特殊限定，采用SOX6二价纳米抗体在医学上可接受的剂型和常规剂型的制备方法制备即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞迁移的药物中的应用。在本发明中，所述药物中以SOX6二价纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型和制备方法没有特殊限定，采用SOX6二价纳米抗体在医学上可接受的剂型和常规剂型的制备方法制备即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞侵袭的药物中的应用。在本发明中，所述药物中以SOX6二价纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型和制备方法没有特殊限定，采用SOX6二价纳米抗体在医学上可接受的剂型和常规剂型的制备方法制备即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将黑素瘤纳米抗体库(依据申请号为201910058785.0、发明名称为《一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法》的中国专利中公开的黑素瘤纳米库的构建方法构建得到即可)进行第一轮淘洗，得到B16-SOX6-VHH1，分装冻存于-70℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以SOX6多肽蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
(1)将500μl黑素瘤纳米抗体库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；
3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90分钟；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；
6)使用2.6ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为ZJ-B16-SOX6-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的SOX6-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
(3)在免疫管中加入2ml上述步骤(7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
(5)将洗脱的噬菌体(命名为XT-B16-SOX6-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)
(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-SOX6-VHH1，分装冻存于-70℃。
测定拯救噬菌体滴度：ZJ-B16-SOX6-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算ZJ-B16-SOX6-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算XT-B16-SOX6-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：SOX6多肽蛋白包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-SOX6的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取130个单克隆菌株共接种2块96孔深孔培养板，每孔中均含200μl 2×YTAG培养基，培养板分别标记为E-1、E-2，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180μl2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板振荡培养1h后，在每孔中加入20μl KM13(60μl KM13+12ml 2×YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020g离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，具体方法如下：使用SOX6蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5-15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性孔号。
通过间接ELISA方法检测130个单克隆对应的噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了20个单克隆，这些单克隆均同SOX6蛋白有较好的反应性且同BSA蛋白的反应值较弱。将20个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
SOX6纳米抗体活性和亲和性
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的VHH片段与专利号：CN202010338343.4中的SEQ OD No.1中的片段用linker相连，采用基于PAS(PCR-basedAccurate Synthesis)的方法，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因连入载体pCold I的NdeI和XbaI位点之间送到公司合成，获得的重组质粒接入pCold原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的SOX6特异性鉴定。
筛选步骤如下
将重组质粒和pBAD18空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，30℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.2mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
二价纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对二价纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗SOX6中和活性的二价纳米抗体的筛选：将筛选出的SOX6二价纳米抗体对应甘油菌株接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500mlAmp抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度0.2mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述二价纳米抗体进行纯化。
SOX6二价纳米抗体的亲和性：用5ug/ml得SOX6包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的SOX6二价纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5ug/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml，进行ELISA鉴定。
结果：
ELISA筛选结果
通过间接ELISA方法检测130个单克隆对应的噬菌体上清同SOX6蛋白的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了10个单克隆，这些单克隆均同SOX6蛋白有较好的反应性(表1)。将10个单克隆的培养菌液送测序公司测序。
表1 SOX6单克隆ELISA筛选结果
Figure BDA0002913834200000091
注：1阴性对照：包被底物是SOX6多肽，第二天孵育一抗是PBS；
2阳性对照：包被底物是SOX6多肽，第二天孵育一抗是商品化的SOX6抗体，SOX6多肽和SOX6抗体为市售产品，SOX6多肽的厂家是Biorbyt，产地是英国剑桥，货号是orb304843；SOX6成品化抗体厂家是博奥森，产地是中国北京，货号是：bs-21579R。
SOX6-VHH1(SEQ ID No.3)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVS；
SOX6-VHH2(SEQ ID No.4)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVS；
SOX6-VHH3(SEQ ID No.5)：
ESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGEEPEWVTFITNDGSGVRYADSVKGRFTVSRNNVENTVYLRMDNLQPNDTARYYCVRGRLTATSPLIPDDSWGQGTQVTVSS；
SOX6-VHH4(SEQ ID No.6)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCLASGFSFDSYAMSWYRQAPGKEREWVAHITSGGSTNYSDSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMDNLKPEDTAVYYCNEVSTSLDDYDYWGKGTQVTVSA；
SOX6-VHH5(SEQ ID No.7)：
GLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNISWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPENTAIYFCAATYYRCSHYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHH；
SOX6-VHH6(SEQ ID No.8)：
GGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSSAHHSE；
SOX6-VHH7(SEQ ID No.9)：
GGLVQPGGSLRLSCLASGFSFDSYAMSWYRQAPGKEREWVAHITSGGSTNYSDSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMDNLKPEDTAVYYCNEVSTSLDDYDYWGKGTQVTVSAAHHSEDP；
SOX6-VHH8(SEQ ID No.10)：
GLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNISWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPENTAIYFCAATYYRCSHYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHH；
SOX6-VHH9(SEQ ID No.11)：
ESGGGSVQPGGSLTLSCVVSGDSFSFYNMAWYRQAPGNQQRELVAMVSRYSDDNYANSVKGRFTISRDNSKSNVYLQMNKLKPEDTAVYYCMPQPFNYPWGQGTQVTVSS；
SOX6-VHH10(SEQ ID No.12)：
ESGGGWVQPGESLRLSCVAPGFELRLYAMAWFRQAPGKEPEQVATITLRGSIYYADSVKDRFTISKDNGMNTVYLQMNNLKPEDTGIYYCNAWDQGKKGNESEYWGQGTQVIVSS。
经ELISA筛选后，选择阳性最强的两个克隆进行测序，经测序并预测的氨基酸序列为：
N.4.(此序列为专利号：202010338343.4中的SEQ OD No.1)：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSRPLWP；
N.5.(SEQ OD No.3)氨基酸序列：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVS；
将N.4.和N.5.的氨基酸序列连接在一起，得到SOX6二价纳米抗体，即SEQ IDNo.1：
ESGGGLVQPGGSLRLSCAAPGFSLSSYQMSWVRQSPGKGPEWVSTIAASSGNTWYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNTLKPEDTALYYCAKRNRAGLSAYDYWGQGIQVTVSGGGGSESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLGGWNIGWFRQAPGKEREGVLCISDSGESVYYLDSVKGRFTISSDYAENTVYLQMNSLKPEDTAIYFCAATYYRCSDYAPEFSSWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSRPLWP。
SOX6二价纳米抗体(SEQ ID No.1)亲和性检测：
将上述单克隆进行表达后，亲和性检测结果为：SOX6二价纳米抗体对SOX6蛋白的灵敏度为0.664μg/ml；
由以上实施例可知，本发明提供的SOX6纳米抗体能够特异性结合SOX6蛋白，对该蛋白的灵敏度为0.664μg/ml。
实施例2
实施例1的SOX6二价纳米抗体(SEQ ID No.1)纯化
将诱导表达成功的1L SOX6二价纳米抗体菌液分装，11000×g，4℃离心15min，弃掉上清。使用100ml PBS重悬菌体沉淀后分装50ml离心管，每管分装25ml。将50ml离心管中的菌液分别在超声破碎仪中进行超声破碎处理。待超声结束，16500×g离心10min，收集超声上清并过滤0.02μm滤膜，以备上机纯化。
根据所纯化蛋白大小，设置0.5Mpa柱前压，2Mpa系统压。待SOX6纳米抗体超声样品全部上柱后，设置洗脱浓度为0-100mM，洗脱时间为33min,(咪唑浓度为500mM)进行线性洗脱。并回收洗脱液鉴定是否为目的蛋白。
结果：
SOX6纳米抗体在25％咪唑浓度成功洗脱下来，经SDS-PAGE鉴定条带单一，大小为27kDa。根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定，蛋白分子量为27kDa的蛋白为SOX6二价纳米抗体。实验结果见图1。
实施例3
细胞培养及SOX6二价纳米抗体(SEQ ID No.1)鉴定：研究发现SOX6在黑色素瘤细胞中高表达且与细胞增殖迁移有重要联系。通过细胞增殖实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和细胞免疫组织化学来鉴定SOX6纳米抗体。用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养B16细胞，待细胞长至6孔板80％时消化传代，将一部分细胞1:2传至新的6孔板中，另一部分传至有无毒的载玻片上，摇匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
细胞增殖实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长到80％后，添加SOX6二价纳米抗体，每孔添加量为100ng，4h后将细胞传到96孔板中，每孔中细胞数量为2000个，4h后将入10μl的CCK-8试剂，2h测第一次，后面每6h检测一次直至数值无明显变化后终止。
细胞划痕实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长满一层后，用消毒的直尺和中枪头在培养孔中划1条直线，划时枪头保持竖直。PBS冲洗3次，去除掉落的细胞，重新加入无血清的DMEM高糖培养基置于培养箱中培养。每6个小时在同一位置记录一次并拍照。
细胞侵袭实验鉴定：DMEM高糖培养基培养B16细胞在6孔板中长到80％后，添加SOX6二价纳米抗体，每孔添加量为100ng，提前在Transwell小室中加入基质胶(1:8与DMED无血清培养基混合稀释，体积为100μl)，在37℃细胞培养箱过夜；第二天将10000个细胞传到Transwell小室中，继续培养36h后，用PBS清洗3次，加入0.1％结晶紫溶液染色30min,用棉签将小室里的细胞擦掉，之后用33％的醋酸溶液洗脱结晶紫，将洗脱液在酶标仪上570nm测其OD值。
细胞免疫组化鉴定：待载玻片的B16细胞长满后用PBS冲洗3次，之后加入500μl4％的多聚甲醛于4℃环境中静置30min；之后使用PBS冲洗3次并加入3％的H2O2溶液，静置15min；PBS充分冲洗，加入牛血清封闭20min后加入SOX6二价纳米抗体置于4℃环境过夜孵育；第二天将孵育盒放于室温复温30min后，PBS冲洗3次；加入带有His标签的二抗在37℃孵育30min,PBS冲洗3次，滴加50μl DAB在暗盒孵育3-10min后于显微镜下观察。显色完成后滴加蒸馏水终止染色，弃掉蒸馏水后加入苏木精进行核染，30s后自来水冲洗返蓝。
结果：
1、添加SOX6二价纳米抗体对B16细胞增殖实验的影响
其中SOX6-VHH-Ab.(中国专利CN202010338343.4中的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列)是一价抗体；SOX6-VHH-bivalent-Ab.为本发明的二价抗体。
对照组添加的是等量的PBS，实验组分别添加SOX6纳米抗体(SOX6-VHH-Ab.)和SOX6二价纳米抗体(SOX6-VHH-bivalent-Ab.)的浓度为100ng/ml。根据结果发现：添加PBS的组在48小时内，B16细胞增殖较快。实验组在24小时内添加SOX6二价纳米抗体抑制效果最好，48h内实验组增殖效果低于对照组。结果说明SOX6二价纳米抗体添加B16细胞后，随着时间的增长起到了抑制B16细胞增殖的过程。实验结果见图2和表2。
表2抑制B16细胞增殖结果
Figure BDA0002913834200000131
2、添加SOX6二价纳米抗体对B16细胞划痕实验的影响
对照组添加的是等量的PBS，实验组分别添加SOX6纳米抗体和SOX6二价纳米抗体，浓度分别为100ng/ml。根据结果发现：添加PBS的组在36小时内，划痕基本长满细胞。实验组添加SOX6二价纳米抗体在24小时处最明显，36小时还有50％左右未长满，结果说明SOX6二价纳米抗体添加B16细胞后，随着时间的增长起到了抑制B16细胞迁移的过程且抑制效果优于单价的SOX6纳米抗体。实验结果见图3和表3。
表3抑制B16细胞迁移结果
Figure BDA0002913834200000132
Figure BDA0002913834200000141
3、添加SOX6二价纳米抗体对B16细胞侵袭实验的影响
对照组添加的是等量的PBS，实验组分别添加SOX6纳米抗体和SOX6二价纳米抗体，浓度分别为100ng/ml。根据结果发现：酶标仪检测570nm的OD值结果说明SOX6二价纳米抗体添加B16细胞后，抑制B16细胞的侵袭过程且抑制效果优于添加PBS组和单价的SOX6纳米抗体。实验结果见图4和表4。
表4对B16细胞侵袭结果
PBS SOX6-VHH-Ab. SOX6-VHH-bivalent-Ab.
1 0.714 0.611
1 0.709 0.679
1 0.742 0.658
4、SOX6纳米抗体在B16细胞中的定位
对照组添加的是等量的PBS，实验组分别添加SOX6纳米抗体和SOX6二价纳米抗体，浓度都是100ng/ml。根据结果发现：实验组SOX6纳米抗体和SOX6二价纳米抗体主要表达部位在B16细胞的细胞质中，对照组无阳性反应。实验结果见图5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种SOX6二价纳米抗体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Asn Arg
85 90 95
Ala Gly Leu Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly
130 135 140
Gly Trp Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
145 150 155 160
Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr
180 185 190
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
195 200 205
Phe Cys Ala Ala Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe
210 215 220
Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
225 230 235 240
Ser Glu Asp Pro Ser Ser Arg Pro Leu Trp Pro
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaagtggtg gtggtctggt gcagccgggc ggtagcctgc gtctgagttg tgcagcaccg 60
ggttttagtc tgagtagtta tcagatgagc tgggtgcgcc agagtccggg taaaggtccg 120
gaatgggtta gtaccattgc cgccagtagc ggcaatacct ggtatgccga tagcgtgaaa 180
ggtcgcttta ccattagcaa agataatgca aaaaacaccc tgtatctgca gatgaatacc 240
ctgaaaccgg aagataccgc actgtattat tgtgcaaaac gtaatcgtgc aggtctgagt 300
gcctatgatt attggggtca gggcattcag gttaccgtta gtggcggtgg cggcagtgaa 360
agcggtggcg gtctggtgca accgggtggt agcctgcgcc tgagttgtgc ggcaagcggc 420
tttaccctgg gcggctggaa tattggttgg tttcgtcagg ccccgggtaa agaacgtgaa 480
ggcgttctgt gtattagcga tagcggcgaa agcgtttatt atctggatag cgtgaagggc 540
cgttttacca tttcaagtga ttatgccgaa aataccgttt atctgcagat gaacagcctg 600
aaaccggagg ataccgccat ctatttttgt gccgcaacct attatcgctg cagtgattat 660
gcgccggaat tttcaagctg gggtcagggt acccaggtta ccgtgagtag tgcccatcat 720
agtgaagatc cgagcagtcg tccgctgtgg ccg 753
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Asn Arg
85 90 95
Ala Gly Leu Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp
35 40 45
Ser Gly Glu Ser Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Ser Asp Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Arg Cys Ser Asp Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser
115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Tyr Met Ser Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Pro Glu Trp Val Thr Phe Ile Thr Asn
35 40 45
Asp Gly Ser Gly Val Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Val Ser Arg Asn Asn Val Glu Asn Thr Val Tyr Leu Arg Met Asp Asn
65 70 75 80
Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Arg Leu
85 90 95
Thr Ala Thr Ser Pro Leu Ile Pro Asp Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Ser Tyr Ala Met Ser Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala His Ile Thr Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Val Ser Thr Ser
85 90 95
Leu Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser
35 40 45
Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp
50 55 60
Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
65 70 75 80
Asn Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser His
85 90 95
Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala His His
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
1 5 10 15
Pro Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ser
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Ala Ser Ser Gly
35 40 45
Asn Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys
50 55 60
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Asn Arg Ala Gly Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala His His Ser Glu
115
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala
1 5 10 15
Ser Gly Phe Ser Phe Asp Ser Tyr Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala His Ile Thr Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Thr Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50 55 60
Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Val Ser Thr Ser Leu Asp Asp
85 90 95
Tyr Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala Ala His
100 105 110
His Ser Glu Asp Pro
115
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gly Phe Thr Leu Gly Gly Trp Asn Ile Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro
20 25 30
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Asp Ser Gly Glu Ser
35 40 45
Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp
50 55 60
Tyr Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
65 70 75 80
Asn Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Tyr Tyr Arg Cys Ser His
85 90 95
Tyr Ala Pro Glu Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala His His
115
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Val Ser Gly Asp Ser Phe Ser Phe Tyr Asn Met Ala Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gln Gln Arg Glu Leu Val Ala Met Val Ser
35 40 45
Arg Tyr Ser Asp Asp Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Asn Val Tyr Leu Gln Met Asn Lys
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Pro Gln Pro Phe
85 90 95
Asn Tyr Pro Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Pro Gly Phe Glu Leu Arg Leu Tyr Ala Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gln Val Ala Thr Ile Thr Leu
35 40 45
Arg Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Gly Met Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Asn Ala Trp Asp Gln Gly
85 90 95
Lys Lys Gly Asn Glu Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile
100 105 110
Val Ser Ser
115

Claims (6)

1.一种SOX6二价纳米抗体，其特征在于，所述SOX6二价纳米抗体的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的SOX6二价纳米抗体的核酸，其特征在于，所述核酸如SEQID No.2所示。
3.权利要求1所述的SOX6二价纳米抗体在制备防治表达SOX6抗原的黑色素瘤的药物中的应用。
4.权利要求1所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞增殖的药物中的应用。
5.权利要求1所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞迁移的药物中的应用。
6.权利要求1所述的SOX6二价纳米抗体在制备抑制B16细胞侵袭的药物中的应用。
CN202110095118.7A 2021-01-25 2021-01-25 一种sox6二价纳米抗体及其应用 Active CN113150140B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110095118.7A CN113150140B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 一种sox6二价纳米抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110095118.7A CN113150140B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 一种sox6二价纳米抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113150140A CN113150140A (zh) 2021-07-23
CN113150140B true CN113150140B (zh) 2022-11-04

Family

ID=76878717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110095118.7A Active CN113150140B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 一种sox6二价纳米抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113150140B (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1814917A2 (en) * 2004-10-13 2007-08-08 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
WO2013175276A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Argen-X B.V Il-6 binding molecules
IL255769B2 (en) * 2015-05-20 2023-09-01 Broad Inst Inc shared neoantigens
CN106279410B (zh) * 2016-09-29 2019-08-20 华南理工大学 一种二型登革热病毒ns1蛋白多价纳米抗体及制备方法
GB201800649D0 (en) * 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
CN109722716A (zh) * 2019-01-22 2019-05-07 山西农业大学 一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法
CN111454355B (zh) * 2020-04-26 2023-03-24 山西农业大学 一种sox6纳米抗体及其应用
CN112625133A (zh) * 2021-01-14 2021-04-09 山西农业大学 一种cdk2纳米抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113150140A (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111153991A (zh) 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111269318B (zh) 一种gapdh纳米抗体及其应用
CN111454355B (zh) 一种sox6纳米抗体及其应用
CN108610396B (zh) 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽
CN111909272B (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其应用
CN110330551B (zh) 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途
CN112625132B (zh) 纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用
CN113350366B (zh) 核酸适体的应用
CN113150140B (zh) 一种sox6二价纳米抗体及其应用
CN112625133A (zh) 一种cdk2纳米抗体及其应用
CN115724976B (zh) Car修饰的免疫细胞、制备方法及其应用
CN114213532B (zh) 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用
CN117362417A (zh) 广谱中和沙贝病毒的抗体及其应用
CN108486066B (zh) 一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗流产衣原体的单抗
CN104231076B (zh) 抗大肠杆菌感染的治疗性单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途
CN114106187A (zh) 一种靶向ogt的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用
CN113278073B (zh) 一种nkg2a纳米抗体及其应用
CN114671949B (zh) 一种igf1纳米抗体及其应用
CN113912694B (zh) 靶向cd133的结合蛋白和应用
CN117229401A (zh) 一种Qa-1b纳米抗体及其应用
CN117487009B (zh) 抗鸡pml单克隆抗体及其应用
CN112266408B (zh) 特异结合ncl-h460细胞的七肽、编码基因、制备方法及用途
CN114891098B (zh) 一种产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体及其应用
CN101362802B (zh) Dna依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用
CN117736322B (zh) 抗syce2单分子抗体t2d及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant