CN111732659A

CN111732659A - 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111732659A
Application number: CN202010702449.8A
Authority: CN
Inventors: 王文义; 徐畅; 姜长安
Original assignee: Zhuhai Institute Of Advanced Technology Chinese Academy Of Sciences Co ltd
Current assignee: Zhuhai Institute Of Advanced Technology Chinese Academy Of Sciences Co ltd
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111732659B

Abstract

本发明公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican‑3，GPC3)的纳米抗体及其制备方法，所述纳米抗体具有3个互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明的纳米抗体能够通过结合细胞膜表达的GPC3，特异性地识别GPC3高表达的肝癌细胞。该抗体在血清中具有高稳定性，可用于GPC3的功能研究，也可用于肝细胞癌的诊断试剂和治疗药物的开发。

Description

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法及应用。

背景技术

肝癌素有“癌症之王”之名，是死亡率高居第三的癌症。中国的肝癌新发病例数及死亡病例数占全球总数的一半以上。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌的最主要形式，约占75％。由于肝癌早期症状隐匿以及诊断手段的限制，多数肝癌患者被确诊时已处于肝癌晚期，而晚期肝癌预后差，治疗十分困难。因此，肝癌的早期诊断对于提高肝癌患者的生存期意义重大。而靶向药物由于其靶向性强、副作用小，成为肝癌诊断和治疗最具前景的药物之一。肝癌肿瘤细胞的标志蛋白是靶向药物常用的分子靶标。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是肝细胞癌的标志蛋白，在肝细胞癌肿瘤细胞中特异性高表达。GPC3是一种通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定在细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。正常情况下，GPC3仅在胎儿肝脏中表达，健康成人肝脏中一般无GPC3表达或表达量较低。然而，在多数肝细胞癌患者的肝脏组织中，GPC3呈过量表达现象。研究显示，GPC3作为肝细胞癌标志蛋白的灵敏度为70-94％，特异性为86-100％。因此，GPC3是肝细胞癌靶向药物的良好靶标分子。靶标分子的特异性抗体在靶向药物中发挥靶向作用，将药物特异性的结合至分子靶标，发挥诊断和(或)治疗功能。目前，已有特异性识别GPC3的单克隆抗体的报道，然而鉴于传统抗体稳定性低、制备工艺复杂及成本昂贵等局限性，目前迫切需要开发针对GPC3的新型抗体。

纳米抗体(Nanobody，Nb)作为一种优质新型抗体，是骆驼科及软骨鱼类血清中存在的一种天然缺失轻链的重链抗体(Heavy-chain-only antibodies，HcAbs)的重链可变区(Variable domain of the heavy chain of HcAbs，VHH)部分。纳米抗体具有完整的抗原结合能力，为最小的抗原结合片段，分子量为13-15kDa，大小(晶体结构直径为2.5纳米，长度为4纳米)位于纳米尺寸。纳米抗体结构主要分为保守的骨架区(Framework regions，FRs)和序列多变的互补决定区(Complementarity determining regions，CDRs)，分别负责维持纳米抗体的基本结构和决定与抗原的特异性结合。CDR根据其在整个抗体中的位置不同，分为三个独立区域，即互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。与传统抗体相比，纳米抗体体积更小，可以更深入的穿透癌变组织，识别隐藏抗原位点。除此之外，纳米抗体具有特异性强，分子量小，溶解性高，结构稳定性高，与抗原结合力强，组织穿透能力强，人体免疫原性低，易筛选，易制备等诸多优点，可应用于疾病的研究、诊断和治疗中。分子成像技术由于其非侵入性和高分辨率的特点颇受关注，纳米抗体是分子成像中优质的靶向分子，它可以迅速定位于靶标位点，并且游离的纳米抗体能通过肾脏迅速排出体外，从而保证了特异性信号较高的信噪比，有利于获得高分辨率的肿瘤解剖学影像及靶标蛋白分子定位信息，有效提高癌症的早期诊断效率。在肿瘤治疗中，纳米抗体与肿瘤药物进行偶联，可用于靶向输送药物；在嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)中，纳米抗体作为靶向分子可将T细胞精准靶向肿瘤细胞，从而高效、精准的杀灭肿瘤细胞。特别地，相比于传统抗体，纳米抗体由于其具有强组织穿透能力，在HCC等实体瘤相关疾病中更具应用前景。除此之外，本发明的纳米抗体也可对GPC3蛋白进行靶向示踪及功能操纵等，用于GPC3相关的生物医学研究。

发明内容

本发明的目的在于提供是：提供一种GPC3的纳米抗体，该纳米抗体是针对GPC3，为肝细胞癌的诊断和治疗提供有效的靶向分子，同时提供该纳米抗体的表达载体。

为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

在一实施方案中，本发明的一种GPC3的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

上述本发明的GPC3的纳米抗体，所述互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别具有编码核苷酸序列，其特征在于，CDR1的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述本发明的GPC3的纳米抗体，包含FR1、FR2、FR3和FR4骨架区，其特征在于，骨架区FR1具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，骨架区FR2具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，骨架区FR3具有如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列,骨架区FR4具有如SEQ IDNO.16所示的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明提供了一种载体，含有可表达本发明的GPC3的纳米抗体。

另一方面，本发明的一种载体，含有可表达GPC3的纳米抗体，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明的纳米抗体在选自下列组的用途：

1)在GPC3的分析鉴定的运用，

2)在制造用于肿瘤诊断试剂盒的应用，优选用于肝细胞癌诊断的试剂盒，

3)在制造治疗肝细胞癌药物或其他靶向药物中的应用。

上述本发明的用途，所述在GPC3的分析鉴定的运用是GPC3纳米抗体在GPC3蛋白亚细胞定位分析或GPC3蛋白定量中的应用。所述在制造用于诊断试剂盒的应用是指将本发明的纳米抗体制成诊断试剂或试剂盒用于诊断肝细胞癌，是基于本发明的纳米抗体能特异性地识别肝细胞癌细胞。在制造治疗肝细胞癌药物或其他靶向药物中的应用是指将本发明的纳米抗体直接用于治疗肝细胞癌，或者与其它抗癌药物如化疗药物结合作为靶向肝细胞癌的药物。

在一具体实施方案中，本发明的一种针对GPC3的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明的一种针对GPC3纳米抗体的互补决定区的编码序列：其互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的一种针对GPC3纳米抗体的互补决定区1-3的编码序列(DNA序列)的表达载体，所述编码序列：其互补决定区1-3分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的一种针对GPC3的纳米抗体的互补决定区1-3的编码序列(DNA序列)的表达载体的宿主细胞，所述编码序列：其互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

在具体实施方案中，本发明的一种针对GPC3的纳米抗体，在其互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，本发明的一种能够编码所述针对GPC3的纳米抗体互补决定区1-3区域的核苷酸序列，所述互补决定区1-3的核苷酸序列为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示。

在具体实施方案中，本发明的一种表达载体，它所含GPC3纳米抗体互补决定区1-3区域的编码序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的一种大肠杆菌宿主细胞，它含有上述本发明的表达载体。

本发明的有益效果是：

本发明通过噬菌体展示技术筛选出GPC3的纳米抗体，该纳米抗体特异性结合定位于细胞膜上的GPC3，且抗体稳定性高。本发明利用原核表达纳米抗体，操作简单、成本低廉。作为肝细胞癌的靶向分子，该纳米抗体可用于肝细胞癌分子成像诊断、药物靶向输送以及嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，该纳米抗体亦可用于GPC3的功能研究。

附图说明

图1为表达载体pLenti6/V5-GPC3ΔGPI-FLAG的构建流程图；

图2为利用FLAG M2磁珠对稳定细胞株培养液中的分泌蛋白GPC3ΔGPI-FLAG进行纯化，并利用FLAG抗体进行免疫印迹检测确认目的蛋白的结果；

图3为纳米抗体表达载体pET22b-Nb-His的构建流程图；

图4为运用GPC3免疫共沉淀纳米抗体方法检测抗原-抗体结合的结果；

图5为运用纳米抗体免疫共沉淀GPC3方法检测抗原-抗体结合的结果；

图6为免疫荧光染色实验检测纳米抗体与GPC3共定位的结果；

图7为免疫荧光染色实验检测纳米抗体与肝癌细胞特异性结合的结果；

图8为酶联免疫吸附实验检测所筛选的纳米抗体与已知GPC3纳米抗体HN3的稳定性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实施例仅用于解释和帮助理解本发明的精神实质，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 GPC3重组蛋白的制备

制备羧基端带有FLAG标签的GPC3重组蛋白。

(1)根据GPC3在NCBI中的编码基因序列(NCBI Reference Sequence：NM_004484.4)，并以UniProt中GPC3的氨基酸序列(UniProt Reference Sequence：P51654-1)为准进行F359S突变，去掉其GPI区域(1690-1740bp)，将缺失GPI位点的GPC3ΔGPI与FLAG标签融合的序列进行人工合成(深圳华大基因科技有限公司)，5’端和3’端分别带有EcoRI和NotI酶切位点。GPC3ΔGPI编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。(2)利用限制性内切酶EcoRI和NotI(New England Biolabs公司)对GPC3ΔGPI-FLAG DNA片段和经改造多克隆位点两端含有SfiI酶切位点的pcDNA3.1载体(中间载体)进行双酶切，对所获得的片段利用T4连接酶(Thermo Fisher Scientific公司)进行连接反应，测序验证。经SfiI酶切将GPC3ΔGPI-FLAG连接至慢病毒包装载体pLenti6/V5中，最终获得正确的pLenti6/V5-GPC3ΔGPI-FLAG载体(见图1)。(3)将pLenti6/V5-GPC3ΔGPI-FLAG以及慢病毒包装载体pLP1、pLP2和pVSVG共转染至HEK293FT细胞中，从上清中获得相应慢病毒。将慢病毒转导至HEK293T细胞，经抗生素筛选获得稳定表达GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白的细胞株。将细胞株于37℃、5％CO₂条件下培养2天，收集培养上清液，按照FLAG M2磁珠(Sigma-Aldrich公司)说明书对GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白进行纯化。

实施例2针对GPC3的纳米抗体噬菌体文库筛选

(1)包被抗原：按FLAG M2磁珠说明书，对分泌至培养上清液中的GPC3ΔGPI-FLAG蛋白进行纯化，制备GPC3ΔGPI-FLAG蛋白包被的磁珠，并通过考马斯亮蓝染色及免疫印迹检测进行验证。如图2(A)所示，纯化得到的蛋白大小位于72-85kD之间，条带单一，表明纯度较高。图2(B)为利用GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白的FLAG标签抗体进行免疫印迹检测结果，结果显示蛋白大小与考马斯亮蓝染色结果一致，表明纯化得到的蛋白为GPC3ΔGPI-FLAG目的蛋白。GPC3蛋白具有数个糖基化位点，拖尾弥散条带应为GPC3糖基化所致。箭头处指示为GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白目的条带位置。(2)纳米抗体库的预处理：取1ml含5％(g/ml)BSA及0.1％Tween-20的TBS缓冲溶液(pH 7.4)，加入本实验室构建的纳米抗体噬菌体展示文库，使溶液中噬菌体达到约1×10¹¹pfu.。混匀后加入20μl FLAG M2磁珠，室温旋转孵育60min。(3)含有纳米抗体的噬菌体与GPC3的结合：将上述预处理后的纳米抗体噬菌体溶液转移至新的离心管中，加入20μl包被有GPC3ΔGPI-FLAG的磁珠(GPC3ΔGPI-FLAG蛋白量约2μg)，室温旋转孵育60min。(4)洗涤：弃去上述纳米抗体噬菌体溶液，用含有TBST(0.1％Tween-20)溶液洗涤磁珠3次。(5)洗脱：向含有磁珠的离心管中加入100μl 0.1M三乙胺溶液，常温温和振荡10min，然后加入100μl 1M Tris-HCl(pH 6.8)，振荡混匀，室温静置5min。(6)侵染：将洗脱液加入1ml大肠杆菌SS320培养液(OD600值为0.6)，37℃孵育40min。(7)计数：将SS320培养液离心5000rpm，4min，弃上清，加入200μl LB混匀，按一定稀释度取部分菌液涂于计数平板，过夜培养。(8)计数完毕后用1ml ddH₂O将平板上的菌进行收集，并取一定量菌液于2×YT(含2％Glucose)中，37℃，220rpm培养15min。(9)加入辅助噬菌体M13KO7(New England Biolabs公司)，侵染SS320，37℃孵育60min，制备并纯化噬菌体用于下一轮筛选。(10)将收集的噬菌体纳米抗体文库按照实施例2的步骤再进行下一轮的筛选，共筛选三次。

实施例3纳米抗体的制备

实施例2中，完成第三轮筛选噬菌体侵染后，将大肠杆菌SS320涂布平板，挑取含噬菌体质粒的单克隆进行测序。利用Vector NTI软件分析各个抗体克隆的基因序列并进行比对，将互补区CDR1、CDR2、CDR3序列相同的克隆视为同一克隆株。根据测序结果，选取其中一个高重复率的克隆株，标记为G64克隆，所示DNA序列如SEQ ID NO:8所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。其三个互补区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3所示，CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6所示，纳米抗体的4个骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。

通过PCR扩增、限制性内切酶酶切和T4连接酶连接将G64纳米抗体的核苷酸片段连接至表达载体pET22b中，具体过程如下：(1)依据上述测序结果设计用于扩增纳米抗体的核苷酸片段的PCR引物：上游引物CATGACTAGTCAAGTTCAATTAGTC(SEQ ID NO:11)，下游引物CGCGGATCCAAGCTTGAATTC(SEQ ID NO:12)。(2)以G64噬菌体质粒为模板，PCR扩增纳米抗体的DNA片段，然后通过SpeI和EcoRI限制性内切酶(New England Biolabs公司)酶切，用T4连接酶(Thermo Fisher Scientific公司)连接至表达载体pET22b中，经过DNA序列测定，获得含有编码G64核苷酸序列的重组质粒pET22b-G64-His(见图3)。(3)随机挑取一个未经任何筛选的纳米抗体噬菌体基因库侵染大肠杆菌SS320后的单克隆菌株，将其所表达的纳米抗体作为阴性对照抗体(Negative control，NC)，并依据实施例3(1)和实施例3(2)构建对照纳米抗体表达载体pET22b-NC-His(见图3)。(4)将重组质粒pET22b-G64-His和pET22b-NC-His分别转化至蛋白表达大肠杆菌BL21，获得表达融合His标签的纳米抗体的工程菌，并分别接种至LB培养基中，37℃，220rpm培养至培养液OD600值为0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，然后在18℃，220rpm诱导表达12h。培养结束后，收集大肠杆菌并进行周质蛋白提取，按照His标签蛋白纯化磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司)使用说明书，纯化得到携带了His标签的纳米抗体。

实施例4 GPC3免疫共沉淀纳米抗体实验

(1)依据实施例1获得结合GPC3ΔGPI-FLAG的磁珠。(2)依据实施例3中获得含Nb-His的细胞裂解液，利用10×Buffer W(1M Tris/HCl,pH 8.0,1.5M NaCl,10mM EDTA)将细胞裂解液稀释成1×Buffer W溶液体系，取500μl加入5μl结合GPC3ΔGPI-FLAG的磁珠，4℃旋转孵育2h。(3)Buffer W洗涤磁珠3次，弃去洗涤溶液，每管加入10μl 1×SDS凝胶加样缓冲液，振荡混匀，煮沸10min。(4)利用蛋白免疫印迹检测免疫共沉淀后样品中GPC3和纳米抗体。

检测结果如图4所示，其中NC为阴性对照纳米抗体，左侧Input为施加的纳米抗体蛋白；右侧为免疫沉淀的纳米抗体，用未结合抗原的空白FLAG M2磁珠(Blank Beads)作为对照组，以排除纳米抗体与磁珠的直接结合。可以看出：阴性对照纳米抗体NC与磁珠不结合；虽然有微量G64与空白FLAG M2磁珠结合，但G64与包被GPC3ΔGPI-FLAG磁珠的结合力大幅度增强，表明G64纳米抗体能高特异性结合GPC3。

实施例5 G64纳米抗体免疫共沉淀GPC3实验

(1)依据实施例3获得成功结合了Nb-His的磁珠。(2)加入5ml实施例1中所得的含GPC3ΔGPI-FLAG分泌蛋白的培养液，4℃旋转孵育2h。(3)弃去培养液，TBST洗涤磁珠3次。弃去洗涤溶液，每管加入10μl SDS凝胶加样缓冲液，振荡混匀，煮沸10min。(4)利用蛋白免疫印迹检测免疫共沉淀后样品中的GPC3和纳米抗体。

检测结果如图5所示，其中NC为阴性对照纳米抗体，图5A为Input，表示该实验各组中加入的GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白；图5B表示用于实验检测的各组磁珠上结合的纳米抗体量；图5C为免疫沉淀的GPC3ΔGPI-FLAG重组蛋白。结果显示：阴性对照纳米抗体NC不与GPC3ΔGPI-FLAG结合；而G64组能高效沉淀GPC3ΔGPI-FLAG，表明G64高特异性地结合GPC3。

实施例6纳米抗体识别细胞膜表面GPC3的免疫荧光染色实验

(1)为进一步确认纳米抗体结合定位于细胞膜的GPC3，将mCherry融合于GPC3的N端，根据实施例1的方法构建相关载体，通过慢病毒包装、转导，获得稳定表达mCherry-GPC3的HEK293T细胞株。(2)将传代培养的该细胞株经胰酶充分消化后获得单细胞悬液，接种至细胞爬片。(3)将细胞爬片用37℃的PBS(pH7.4，下同)漂洗，用4％PFA(多聚甲醛)于37℃固定10min，PBS漂洗。(4)在2％BSA/TBS中室温下封闭30min。(5)利用2％BSA/TBS稀释纳米抗体至10μg/mL，4℃孵育过夜。(6)TBST漂洗，加入2％BSA/TBS稀释的anti-HA(Cellsignaling公司)，37℃孵育2h。(7)TBST漂洗，加入2％BSA/TBS稀释的偶联Alexa Fluor 488荧光基团的二抗(Thermo Fisher Scientific公司)，37℃孵育1h。(8)TBST漂洗，用5μg/mLDAPI孵育2min染色细胞核。制片后在荧光共聚焦显微镜下观察、拍照。

检测结果如图6A所示，mCherry荧光信号分布表明mCherry-GPC3定位于细胞膜及细胞质中，而指示纳米抗体G64定位的Alexa Fluor 488荧光信号仅出现于细胞膜上。由于本实施例中未施加表面活性剂处理，细胞膜结构未被破坏，因此G64仅结合细胞膜定位的GPC3蛋白。对白色线条区域分析发现，mCherry和Alexa Fluor 488两种荧光信号的强度随位置变动同步变化(图6B)，而且红色矩形区域的计算结果显示，两种荧光的皮尔森相关系数为0.803(图6C)。以上结果表明，纳米抗体G64和细胞膜定位的mCherry-GPC3具有良好的共定位，说明该抗体能特异性地识别并结合细胞膜上的GPC3蛋白。

实施例7纳米抗体识别肝癌细胞的免疫荧光染色实验

为进一步验证纳米抗体G64是否能特异性识别GPC3阳性的肝癌细胞，根据实施例6的方法，利用该纳米抗体对高表达GPC3的人肝细胞癌细胞系HepG2进行免疫荧光染色。不表达GPC3的人表皮鳞癌细胞系A431作为阴性对照细胞系。

检测结果如图7所示，阴性细胞A431细胞膜上没有检测到纳米抗体G64的绿色荧光信号，但HepG2细胞膜上可检测到较强的荧光信号，表明G64能特异性地识别、结合肝细胞癌细胞。

实施例8纳米抗体的稳定性测试实验

通过酶联免疫吸附实验检测纳米抗体G64与已知GPC3纳米抗体HN3在血清中的稳定性。

(1)按实施例1表达并纯化抗原蛋白GPC3ΔGPI-FLAG。(2)依据实施例3表达、纯化纳米抗体G64。HN3纳米抗体从Creative Biolabs购置，是HN3-hFc融合抗体[Feng M,Gao W,Wang R,et al.2013.Therapeutically targeting glypican-3via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.PNAS 110(12):E1083-E1091]。(3)分别测定G64和HN3-hFc抗体浓度，各取2μg置于胎牛血清FBS环境中，37℃条件下分别处理0h、12h、24h、48h、72h、96h。(4)将等量的GPC3ΔGPI-FLAG蛋白稀释于包被液中，加入微孔板，4℃包被过夜。(5)用Blocking buffer(PBS,0.05％Tween-20,1％BSA)封闭后，将上述经37℃处理不同时间的G64和HN3-hFc抗体加入微孔板，37℃孵育1小时。(6)清洗后，分别向G64微孔和HN3-hFc微孔加入小鼠His标签抗体和小鼠hFc抗体，37℃孵育1小时。(7)清洗后，加入新鲜稀释的HRP偶联酶标二抗(Thermo Fisher Scientific公司,1:10000稀释)，37℃孵育30min。(8)加入TMB显色液(北京索莱宝科技有限公司)，37℃孵育20min显色。(9)显色后向各反应孔中加入显色终止液(北京索莱宝科技有限公司)，利用酶标仪检测各反应孔450nm的光吸收值。

检测结果如图8所示，血清中的HN3在37℃处理72h后，抗原结合能力明显下降，与0h相比降低55.5％；而同样的处理对G64的抗原结合能力影响微小，在处理72h时间后仅下降0.6％，说明G64在血清中的稳定性显著高于HN3。纳米抗体骨架区维持纳米抗体的基本结构，影响其蛋白稳定性，本发明筛选得到的纳米抗体G64的骨架区FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13-16所示。

上述实施例为本发明的优选实施方式，并不对本发明构成任何限制，其他任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、简化、组合等改变或修饰，均包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海中科先进技术研究院有限公司

<120> 一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体及其制备方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Gly Ala Asp Thr Leu Ser

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Trp Leu Met Thr Thr Tyr Ser

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ser Arg Pro Arg Phe Leu Glu Glu Gln Leu Gln Val Ser Ser Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtcgtggtg ctgatacgtt gtcg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctggttga tgacgacgta tagt 24

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgtctcggc cgcgttttct ggaggagcag cttcaggtga gtagttac 48

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gly Ala Asp Thr Leu

20 25 30

Ser Leu Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Cys Gly Ile Ser Trp Leu Met Thr Thr Tyr Ser Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Arg Pro Arg Phe Leu Glu Glu Gln Leu Gln Val Ser Ser Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagttcaat tagtcgagtc cggcggagct ctggtccagc ctggaggtag tctgcgttta 60

tcctgcgcag ccagcggtcg tggtgctgat acgttgtcgc tccgctggta tcgccaggca 120

ccgggtaagg agcgcgaatg ggtatgcggt attagctggt tgatgacgac gtatagttac 180

gaagacagcg ttaaagggcg ttttacttgt tcccgcgacg acgctcgtaa cacagtctat 240

ttacaattaa actcattaaa gcctgaagac acagcggtat attactgcgc gtctcggccg 300

cgttttctgg aggagcagct tcaggtgagt agttactggg ggcagggcac gcaggtaacc 360

gttagctca 369

<210> 9

<211> 563

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly

35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val

50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys

65 70 75 80

Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala

85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln

100 105 110

Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala

115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe

130 135 140

Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro

165 170 175

Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe

195 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln

210 215 220

Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile

225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu

245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys

260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly

275 280 285

Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu

290 295 300

Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu

305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys

325 330 335

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser

340 345 350

Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile

355 360 365

Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu

370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser

385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala

405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr

420 425 430

Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His

435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp

450 455 460

Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys

465 470 475 480

Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly

485 490 495

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly

500 505 510

Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr

515 520 525

Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro

530 535 540

Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser

545 550 555 560

Pro Leu Lys

<210> 10

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60

ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120

ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180

gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240

taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300

aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360

catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420

gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480

atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540

cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600

gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660

aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc 720

aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 780

tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840

gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt 900

ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg 960

cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020

ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatccgct 1080

tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat 1140

gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc 1200

ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc 1260

ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320

atgaaaaacc agttcaatct ccatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt 1380

caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa 1440

ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat 1500

gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc 1560

cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag 1620

caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc 1680

ccgctgaag 1689

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgactagt caagttcaat tagtc 25

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgcggatcca agcttgaatt c 21

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Leu Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Cys

1 5 10 15

Gly Ile

<210> 15

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asp Ala

1 5 10 15

Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区：CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，所述互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别具有编码核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，CDR1的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，CDR2的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

4.根据权利要求1所述的纳米抗体，包含FR1、FR2、FR3和FR4骨架区。

5.根据权利要求4所述的纳米抗体，其特征在于，骨架区FR1具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，骨架区FR2具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，骨架区FR3具有如SEQID NO.15所示的氨基酸序列,骨架区FR4具有如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。

6.一种表达载体，含有可表达权利要求1-5的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体。

7.一种表达载体，含有可表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

8.权利要求1-5的纳米抗体在选自下列组的用途：

1)在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的分析鉴定的运用，

2)在制造用于肿瘤诊断的试剂盒的应用，

3)在制造治疗肝细胞癌药物或者靶向传递药物中的应用。

9.一种针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的纳米抗体的互补决定区的编码核苷酸序列：所述互补决定区为CDR1、CDR2和CDR3，其编码核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示。

10.一种大肠杆菌宿主细胞，含有权利要求6或7的表达载体。