CN103333248A

CN103333248A - 一种cd25纳米抗体、其编码序列及应用

Info

Publication number: CN103333248A
Application number: CN2013102277090A
Authority: CN
Inventors: 万亚坤; 王平艳; 孙燕燕; 谢维
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: CN103333248B

Abstract

本发明公开了针对于CD25多肽分子抗原表位的纳米抗体，同时还公布了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD25分子检测试剂的研发。

Description

一种CD25纳米抗体、其编码序列及应用

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对于CD25分子的纳米抗体、其编码序列及应用。

背景技术

CD25（IL-2α-链受体或IL2RA），是I型跨膜糖蛋白，具有一个的信号肽、一个胞外区、一个跨膜区和一个胞质域。IL2RA在活化的T细胞和调节性T细胞中表达，能够自身低亲和结合IL2。然而，当相关的IL2RA与白细胞介素2受体的β和γ链非共价结合时产生一种配体诱导的高亲和力异源三聚受体复合物，并随后启动胞内信号通路，如MAPK或JAK/STAT信号通路。白细胞介素2受体复合物通过调节T细胞的增殖，活化和的其他淋巴功能介导白细胞介素2的效应，已被证实IL2Rα将IL2运输至信号复合体并充当信号转导的调节子。另外，IL-2通过IL2反应增强子诱导IL2R转录，IL2R通过负反馈回路激活CTLA-4或FOXP3表达从而抑制IL2基因的表达。CD25已被作为树突状细胞（DC）激活的标记，因小鼠和人的DC可以表达CD25而不表达IL-2受体的β-链，这是IL-2信号执行必不可少的。IL2RA（CD25）基因是活化的T淋巴细胞高表达的高亲和受体分子的主要成分。癌的生长和发展与先天免疫系统的刺激有关联，包括免疫细胞中增强白细胞介素2受体（IL-2R）的表达及其形成可溶性白细胞介素-2受体（sIL-2Rα）的循环中。在大多数血液恶性肿瘤，包括不同类型的白血病和淋巴瘤，已经发现sIL-2Rα在肿瘤细胞的表面直接被释放，因此反映了肿瘤的大小和活性。几项研究证明，不仅淋巴癌细胞，也有一些非淋巴癌细胞，表面都可表达IL-2R。在大多数增殖干扰的造血系统和许多实体瘤中sIL-2Rα升高。

纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers，R在骆驼血液中发现。普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。以该“重链抗体”为基础的纳米抗体不仅分子量只是普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，并容易偶联其他分子。因此应用纳米抗体技术研发CD25检测试剂具有广阔的前景。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对CD25表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种CD25的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

优选地，所述的CD25的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，一种CD25纳米抗体，它针对CD25表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的CD25的纳米抗体的VHH链，或本发明所述的CD25纳米抗体。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有所述的表达载体。

本发明的第六方面，提供了本发明所述的CD25纳米抗体检测CD25分子的用途。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明首先合成CD25多肽，并使其具有免疫原性，然后将CD25分子偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了CD25特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是纳米抗体的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的分子标记，其余孔道为PCR产物，PCR产物带约为500bp；

图2是CD25纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图，结果显示，CD25纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上；

具体实施方式

本发明应用针对CD25偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对于CD25的纳米抗体文库的构建：

（1）首先合成CD25多肽，将1mg CD25多肽与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂提供)，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；（2）7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；（3）合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；（4）利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH并连接两个片段；（5）将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建CD25纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.85×10⁸。

实施例2：针对CD25的纳米抗体筛选过程：

（1）将溶解在100mM NaHCO₃、pH8.2中的20μg CD25偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；（2）第二天加入100uL0.1%酪蛋白，室温封闭2h；（3）2h后，加入100uL噬菌体（5×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），室温作用1h；（4）用0.05%PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；（5）用100mM TEA（triethylamine）将与CD25特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮，逐步得到富集。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：

（1）从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基（1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，其抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LA+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；（3）接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6～1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）如图2所示，经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250毫摩尔，500毫摩尔）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图2所示从左到右的条带分别是：第一泳道为标准蛋白分子标记，第二泳道为破菌后蛋白总的粗提液样品，第三泳道为总的蛋白粗提液过镍柱后的样品，第四泳道为含有50毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第五、第六泳道为含有100毫摩咪唑的洗脱液洗脱的样品，第七，第八泳道为含有250毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品，第九、十、十一、十二泳道为含有500毫摩咪唑的洗脱液洗脱样品；结果显示，CD25纳米抗体经过该纯化后，经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90%以上的蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种针对CD25纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR选自下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的CD25纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。

3.一种CD25纳米抗体，其特征在于，它针对CD25表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的CD25纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的CD25纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

6.一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达CD25的纳米抗体。

8.权利要求3所述的CD25纳米抗体用于检测CD25分子的用途。