CN101210049A

CN101210049A - 一种免疫抑制剂-抗cd25嵌合单克隆抗体

Info

Publication number: CN101210049A
Application number: CNA2006101487354A
Authority: CN
Inventors: 黄阳滨; 张翊; 孙九如; 任军; 游磊; 顾小伟; 徐晓燕
Original assignee: Shanghai New Life Origin Medical Co Ltd; Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Current assignee: Shanghai New Life Origin Medical Co Ltd; Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Priority date: 2006-12-30
Filing date: 2006-12-30
Publication date: 2008-07-02

Abstract

本发明公开了一种抗CD25单克隆抗体，所述的抗体含有独特轻链可变区和重链可变区结构，针对独特的CD25抗原(IL－2受体)表位。本发明还公开了所述抗体的编码序列，包含该序列的表达载体和宿主细胞，以及生产所述抗体的方法。本发明的抗CD25单克隆抗体具有极其优异的免疫抑制作用，免疫原性很低且特异性很高。

Description

一种免疫抑制剂-抗CD25嵌合单克隆抗体

技术领域

本发明涉及基因工程和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种抗CD25嵌合单克隆抗体及其编码序列，包含所述抗体的编码序列的表达载体和宿主细胞，以及生产所述抗体的方法。

背景技术

器官移植是治疗终末期器官疾病的最有效的治疗手段。以肾移植为例，同种异体肾移植是目前治疗末期肾病的最有效的方法。肾移植是中国临床开展最早、例数最多、技术最成熟的大器官移植，已成为治疗终末期肾病的常规手术。近年来，器官移植病例数不断增长。以肾移植手术为例：至2001年底，中国肾移植的累积总数达40393例，中国肾移植水平已进入国际先进行列。

供体肾脏移植到患者体内，担任体内卫兵的T细胞等免疫系统将会对异己的肾脏展开进攻，也就是产生移植排斥反应。在这个过程中，T_H细胞受IL-1作用后增生，并且释放IL-2。IL-2可进而促进T_H细胞增生并为CTL细胞(CD8+细胞毒性T细胞)的分化提供辅助信号。CTL细胞与HLA-I抗原结合后可引起分化，成为成熟的CTL，排斥移植组织。由此可见，阻断IL-2因子与其受体的结合对于器官移植的排斥反应相当重要。

器官移植后的急性排斥反应较常见，这种反应可能会引起移植肾脏的坏死或者移植肾功能衰退。因此，能够降低和减弱这类反应的药物对于器官移植的成功与否至关重要。临床上一般采用免疫抑制剂对器官移植病人进行治疗，抑制移植排斥反应的发生或减轻反应程度。因此，接受肾移植者不得不终身服用免疫抑制药物以达到以下目的：1.合理应用以预防和治疗排斥反应(保护异己的肾脏)；2.保持患者适度的免疫抵抗力(保护患者本身)。

新的免疫抑制剂的研制，使临床肾移植得到更为广泛的开展，肾移植数量急剧增长，效果明显提高，肾移植一年存活率在先进的移植中心已超过85％，术后大多数患者恢复正常生活和工作。其中免疫抑制剂在预防和治疗肾移植排斥反应中起了关键作用。然而，迄今应用于临床的免疫抑制剂并没有达到非常满意的效果。虽然移植的肾一年存活率达80-90％，但急性排斥反应发生率仍高达50％。

目前，临床上使用较多的免疫抑制剂有化学药物他克罗姆(Neoral)，他可莫司(FK506)或普乐可复、骁悉(MMF)、雷帕霉素(RAPA)及一些单克隆抗体药物。临床试验表明单克隆抗体类药物的疗效较化学类药物好，但由于单克隆抗体药物生产成本高，造成治疗费用相当昂贵。

并且，现有单克隆抗体产品存在一些主要的问题：鼠源性单克隆抗体为异种蛋白，进入人体会引起机体的排异反应，针对需要多次重复治疗的鼠源性单克隆抗体的抗体可将其快速从体内清除，这是限制鼠源性单克隆抗体治疗性临床应用的最大障碍。同时，鼠源性单克隆抗体激活人体其他免疫系统如补体系统的能力差，从而影响其临床治疗效果。为解决上述问题，嵌合性和人源化单克隆抗体应运而生。比如，人源化单克隆抗体的结构中有90％或以上与人的抗体结构相同，从而降低了产品的异源性。但是，人源化单克隆抗体在进行抗体工程的处理过程中通常会失去对靶抗原的亲和力和稳定性，同时也存在生产细胞建株困难等难点，且一直缺乏有效的解决方法。

此外，一种单克隆抗体通常针对的是一个特异性的抗原表位，很多情况下一种单克隆抗体往往无法完全地抑制相应的抗原的活性。因此为了更好地抑制某一抗原，往往需要开发出多种特异性针对该抗原不同表位的抗体。在实践中，如果一种针对抗原某一表位的单克隆抗体效果不好，则需要采用针对该抗原其它表位的抗体，或者需要多种抗体联合使用。

综上，本领域迫切需要开发新的、免疫抑制效果好、安全有效且产量高的新型抗器官移植排斥的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型免疫抑制剂---抗CD25嵌合单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供生产所述的嵌合单克隆抗体的生产方法。

本发明的另一目的在于提供包含所述抗体的编码序列的表达载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，所述抗体的V_H链的互补决定区CDR具有以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：9所示的CDR1，SEQ ID NO：10所示的CDR2，和SEQ ID NO：11所示的CDR3；

并且，所述抗体的V_L链的互补决定区CDR具有以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：12所示的CDR1，SEQ ID NO：13所示的CDR2，和SEQ ID NO：14所示的CDR3。

在本发明的另一优选例中，所述单克隆抗体的V_H链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述单克隆抗体的V_L链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述单克隆抗体的V_H链和V_L链分别具有SEQID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述单克隆抗体的重链具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或者

所述单克隆抗体的轻链具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种DNA分子，它编码所述的单克隆抗体。

在本发明的另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的编码抗体V_H链的核苷酸序列和SEQ ID NO：3所示的编码抗体V_L链的核苷酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：5所示的编码抗体重链的核苷酸序列，和SEQ ID NO：7所示的编码抗体轻链的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有：

编码所述的单克隆抗体的V_H链的DNA；和/或

编码所述的单克隆抗体的V_L链的DNA。

在本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。

在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞中同时含有：

表达载体1：编码权利要求1所述的单克隆抗体的V_H链的DNA；和

表达载体2：编码权利要求1所述的单克隆抗体的V_L链的DNA。

在本发明的第五方面，提供一种药物组合物，它含有有效量的所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

在本发明的第六方面，提供一种预防或治疗器官移植排斥反应的方法，所述的方法包括给予患者有效量的所述的单克隆抗体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了表达载体pSV2neo/HCMV+VH+hCy1和pSV2neo/HCMV+VL+hCk的构建流程图。

图2显示了表达载体pSV2neo/HCMV+VH+hCy1(A)和pSV2neo/HCMV+VL+hCk(B)的质粒图谱。

图3显示了采用本发明的抗体进行混合淋巴细胞反应(MLR)抑制试验的结果。

图4显示了本发明的抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列，其中，灰色阴影且带下划线部分为CDR区，每条链中各有3个CDR区，依次为CDR1、CDR2和CDR3。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地获得一种含有独特的CDR区的抗CD25单克隆抗体，该抗体具有极其优异的免疫抑制作用，并且其既良好地保留了特异性和亲和力，又具有很低的免疫原性以及良好的安全性。在此基础上完成了本发明。

单克隆抗体

本发明提供了一种嵌合的抗CD25单克隆抗体，它包括人源的恒定区(如人源恒定区IgG1序列和Kappa序列)。所述的抗CD25单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构。

因此，本发明包括：具有所述的抗CD25单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述的抗CD25单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的抗CD25单克隆抗体的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性的任何抗体。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

对于本发明的抗CD25单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。

经验证，本发明的抗CD25单克隆抗体的CDR区是全新的，可见其针对的是一个独特的CD25抗原表位，技术构思不同于现有的抗CD25抗体。

作为本发明的优选例，提供了一种嵌合抗体，所述的抗体中约70％的成份与人单抗完全相同，其恒定区(C区)用人单抗的恒定区替代，其具有特别优异的免疫抑制作用，且特异性高，免疫原性低、安全性高。

本发明还提供了编码所述的抗CD25单克隆抗体的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，利用杂交瘤技术获得。

单克隆抗体的表达、纯化

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的抗体序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗CD25单克隆抗体重链可变区(VH)与恒定区的IgG1(hCy1)融合序列和轻链可变区VL与人体Kappa(hCk)融合序列。一种特别优选的表达载体是载体pSV2neo。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的单克隆抗体。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的抗体优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。同时，如果所述的细胞使用的是GS表达系统，则需要使用不含谷氨酰胺的培养基，才可以表达抗CD25嵌合单克隆抗体。

此外，通过控制培养基的各营养成分，控制培养时候的溶氧(DO)、pH、温度、搅拌速度等因素，可以进一步提高表达量。

作为本发明的优选实例，采用含有BD CHO培养基、Excell 620培养基和蛋白水解物Pramatone的混合培养基作为重组细胞的扩增培养基。

作为本发明的优选实例，采用含有BD培养基、Excel 620和Primitone培养基作为重组细胞扩增的无血清培养基。

可以通过各种方法来增加编码抗体的DNA或RNA的表达。作为一种优选方式，可在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之前设置一段Kozak序列，该序列有助于mRNA的表达。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为一种优选方式，当表达出来的抗CD25嵌合单克隆抗体存在于培养上清时，培养上清液可以通过盐析、超滤等方法进行初步纯化，然后再进行层析纯化；或者，也可直接进行层析纯化。例如，适用于本发明的层析技术包括但不限于：

(a)亲和层析：选择Protein A-Sepharose亲和凝胶介质，低pH缓冲液洗脱；

(b)离子交换层析：阳离子交换层析、阴离子交换层析；或

(c)凝胶过滤层析。

经过2-3步纯化，可得到抗CD25嵌合单克隆抗体纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上。

在本发明中，通过培养条件的优化，抗CD25嵌合单克隆抗体表达量可超过100mg/升。

在本发明的一个较佳实施方式中，本发明人首先从生产抗CD25单克隆抗体的杂交瘤中获得了抗CD25单克隆抗体的重链可变区VH(SEQ ID NO：1)和轻链可变区VL(SEQ ID NO：3)的cDNA片段，然后采用分子生物学常规手段构建分别含有重链可变区VH和轻链可变区VL的表达载体，构成的表达载体中重链可变区VH与人恒定区的IgG1融合(SEQ ID NO：5)，轻链可变区(VL)与人体Kappa融合(SEQID NO：7)，并处于病毒启动子HCMV的调控下。将这两个表达载体共转染哺乳动物细胞，转染的哺乳动物细胞经培养，表达出抗CD25嵌合单克隆抗体。所述的单克隆抗体为人-鼠嵌合性单抗，其中有70％成分与人单抗完全相同，其恒定区(C片段)用人体单抗的恒定区替代，也即：鼠源单抗-抗CD25单克隆抗体重链恒定区由人恒定区的IgG1替换；鼠源单抗-抗CD25单克隆抗体轻链恒定区由人恒定区的Kappa序列替换。

在本发明的较佳实施方式中，经高密度无血清悬浮培养，抗CD25嵌合单克隆抗体以可溶形式存在于培养液上清，表达水平高，占菌体总蛋白50％左右，抗CD25嵌合单克隆抗体表达量达100～125mg/L上清液。由于表达水平较高，抗CD25嵌合单克隆抗体又具有天然活性，避免了复杂的复性过程，通过简便、快速的二步纯化方法，即获得高质量的抗CD25嵌合单克隆抗体纯品，每升培养液可得抗CD25嵌合单克隆抗体纯品45mg以上，产品纯度95％以上。

上述抗体生产方法工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得抗CD25嵌合单克隆抗体纯品约45mg或更多，因此特别适合产业化生产。

药物组合物

本发明还提供了一种治疗移植排斥反应的药物组合物，它含有有效量的上述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于排斥反应的治疗。此外，还可同时使用其它相关的治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的单克隆抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)提供了一种具有全新的重链可变区和轻链可变区的抗CD25单克隆抗体，其可通过特异性结合与封闭白细胞介素2(IL-2)受体，特异性阻断IL-2与其受体的结合，从而减少急性排异反应的发生。本发明的抗体在浓度43.30ng/ml时，就有50％细胞的生长受到抑制，因此具有极其优异的免疫抑制作用。

(2)本发明的嵌合CD25单克隆抗体与鼠源性抗CD25单克隆抗体相比，免疫原性大大减少，同时保留了鼠源性单克隆抗体的可变区。通过鼠-人嵌合抗体构建，在免疫原性大大减少的同时，保留了亲本抗体的特异性。不仅治疗效果好，而且副作用低。

(3)采用新型的NSO表达体系与无血清悬浮培养技术，具有表达量高、操作简单、易于后续纯化的优点。

(4)表达工艺简单，表达量高。通过控制关键的细胞培养工艺条件，使表达水平达到100mg/L以上。

(5)纯化工艺简便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表达于上清，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产抗CD25嵌合单克隆抗体成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

表达载体构建与转化

1.抗CD25单克隆抗体重链可变区VH与轻链可变区VL的获得

获得抗CD25单克隆抗体重链可变区VH与轻链可变区VL的步骤如图1所示。

以植物血凝素(PHA)激活的人体淋巴细胞免疫LOU/C大鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)，继而用其脾细胞与非分泌型骨髓细胞系IR983F(参见Bazin H(1982)Production of rat monoclonal antibodies with the LOU ratnon-secreting IR983F myeloma cell line.Protein Biol Fluids 29：615-618)融合获得抗CD25单克隆抗体的杂交瘤细胞。

根据Chomezybski和Sacchi(Anal.Biochem.162.156.187)的方法或常规方法，用Trizol试剂从生产抗CD25单克隆抗体的杂交瘤中，分离出总RNA(Gibco BRL.Gaithersburg.USA)。

使用Oligo(dT)随机引物，按照反转录试剂盒(Gibco)说明书用超级反转录酶H将RNA反转录为cDNA。并以该cDNA为模板，使用小鼠不同重链恒定区(CH)或轻链恒定区(CL)的特异性引物及小鼠不同高变区(VH或VL)的特异性引物，PCR扩增出抗CD25单克隆抗体的重链可变区VH(SEQ ID NO：1)或轻链可变区VL(SEQ ID NO：3)DNA片段。此方法为常规的方法，或可参考Clothia等描述的方法(J.Mol.biol.186.651.1985)。

采用的特异性引物如下：

VH区的PCR引物：

CAG AAA GCT TGC CGC CAC CAT GGA CTC CAG GCT CAC(SEQ ID NO：15)；和

CGA GGA TCC ACT CAC CTG AAG AGA CAG TGA CC(SEQ ID NO：16)。

VL区的PCR引物：

CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTC AGT TCC AGC TTG GTC CCA G(SEQ ID NO：17)；和

AA CGC GTG CCG CCACCA TGA GGT GCC TAA CTC AGT TCC TGG GGT(SEQ ID NO：18)。

PCR条件：

变性：94℃ 1分钟；

退火：52℃ 1分钟；

延伸：72℃ 1分钟；

循环数35。

所用的酶：Taq(Perkin Elmer USA)。

PCR产物的测序(双脱氧核苷酸法)是用ABI Prism Bigdye Terminator(Perkin Elmer USA)试剂盒，根据产品说明书来完成的。测序反应的产物用毛细管电泳法分析。

所获得的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示，其相应的编码序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。其中，各CDR区如表1或图4所示。

表1

2.表达质粒pSV2neo/HCMV+VH+hCy1和pSV2neo/HCMV+VL+hCk的构建与转化宿主细胞

在引物的5’端添加上一段Kozak序列，该序列有助于mRNA(参见Kozak等，J.cell.Biol.108.229.1989)的表达。

同时添加了限制性内切酶位点序列(HindIII、BamHI序列对应于VL；MluI、BamHI序列对应于VH)，使其能在表达载体中克隆。

VH区的PCR引物(其中，下划线表示酶切位点，方框表示KOZAK序列)：

CAG AAA GCT TGC C

A CTC CAG GCT CAC(SEQ ID NO：15)；和

CGA GGA TCC ACT CAC CTG AAG AGA CAG TGA CC(SEQ ID NO：16)；

VL区的PCR引物：

CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTC AGT TCC AGC TTG GTC CCA G(SEQ ID NO：17)；和

AA CGC GTG CC

A GGT GCC TAA CTC AGT TCC TGGGGT(SEQ ID NO：18)。

通过常规PCR扩增获得VH和VL的DNA序列。

PCR条件是：

变性：94℃ 1分钟；

退火：52℃ 1分钟；

延伸：72℃ 1分钟；

循环数25。

所用的酶：Taq(Perkin Elmer USA)。

获得启动子HCMV和恒定区的人IgG1(基因序列如SEQ ID NO：5的第412-1467位所示)，人抗体轻链Kappa序列(基因序列如SEQ ID NO：7的第397-720位所示)。采用常规的方法，将HCMV和恒定区的IgG1插入到质粒pSV2neo(购自Biolab公司)的多克隆位点中，获得重组质粒pSV2neo/HCMV+hCy1。将HCMV和人抗体轻链Kappa序列插入到质粒pSV2neo(购自Biolab公司)中，获得重组质粒pSV2neo/HCMV+hCk。

VH经过MluI、BamHI双酶切后克隆到表达载体pSV2neo/HCMV+hCy1中，VL经过HindIII、BamHI双酶切克隆到表达载体pSV2neo/HCMV+hCk中，进而，获得重组的表达载体pSV2neo/HCMV+VH+hCy1和pSV2neo/HCMV+VL+hCk。抗体的VL链或VH链基因被克隆到载体中后，VH与VL分别与恒定区的IgG1和人抗体轻链Kappa融合，并处于病毒启动子HCMV的调控下，获得的表达载体的示意图谱见图2。

重组表达载体pSV2neo/HCMV+VH+hCy1和pSV2neo/HCMV+VL+hCk鉴定，用常规方法进行正、逆向序列测序，证实克隆序列与设计序列完全一致。

用FuGENE6(Boehringer Manheim)试剂，根据说明书方法，将获得的重组表达载体pSV2neo/HCMV+VH+hCy1和pSV2neo/HCMV+VL+hCk共转染COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)(5000细胞/ml)进行瞬时表达，经过三天培养，上清液中分泌的抗体用ELISA检测。获得高表达的细胞株。

采用同样方法，将上述质粒转染NSO细胞(ECACC)，通过ELISA检测，获得高表达的工程细胞。

所获得的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6和SEQID NO：8所示，其相应的编码序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。

实施例2

最佳培养基的选择

由种子细胞库复苏无血清细胞株一支，接种到T25方瓶中进行培养，48小时后，按照1∶3的比例将细胞接种入3个T25方瓶中，后可以按照1∶3的比例进行扩增培养。

将细胞以相同的密度接种入不同的培养基中，考察48小时后细胞的数目和表达量。测试的培养基如表2所示。

表2

表2中，BD CHO培养基购自美国BD公司，Excell 620培养基购自JRH公司，Pramatone和DOMA购自Life Technologies公司。

实验数据表明，细胞在B+E+P培养基中的细胞生长速度和产物的表达量均达到最高，抗体的表达水平超过100mg/L。所以优选采用B+E+P培养基作为该细胞的扩增培养基。

实施例3

工程细胞高密度无血清悬浮培养研究

本发明人考察了生产抗CD25嵌合单克隆抗体的工程细胞在BD CHO、BD CHO+excel 620+Pramatone、Excell 620+DOMA+Pramatone以及Excell 620培养基中的适应过程，结果如表3所示。

表3

培养基	适应过程描述	结论
培养基	适应过程描述	结论	BD CHO	经过适应，细胞可以正常传代培养，但培养过程中会出现较大的细胞团，影响部分细胞的传质。在T25方瓶中细胞密度可达8.8×10⁵cells/ml。	可以适应
BD CHO+Excell620+Pramatone	目前细胞可以正常的在该细胞中传代，细胞团组成在10个左右，已经不太会影响细胞的正常生长。在T25方瓶中细胞密度可达12.3×10⁵cells/ml。	可以适应	BD CHO		可以适应
BD CHO+Excell620+Pramatone		可以适应	Excell 620	细胞转入该培养基之后，细胞的个体形态开始增大，直至最后破裂。	无法适应
Excel 620+DOMA+Primitone	换入该培养基后，2-4代期间细胞生长仍比较正常，但随后细胞的活性开始下降，细胞开始不可逆转的死亡，说明该培养基无法满足本细胞生长的需求。	无法适应	Excell 620	细胞转入该培养基之后，细胞的个体形态开始增大，直至最后破裂。	无法适应

综上所述，优选采用BD CHO+Excel 620+Pramatone培养基作为该细胞扩增的无血清培养基，进行细胞在250ml spinner中扩增培养，得到一定量的培养上清，提供纯化进行纯化工艺研究，并得到一定量的纯品提供质控进行结构确证方面的工作。

实施例4

抗CD25嵌合单克隆抗体的纯化

细胞培养液4℃下8900rpm离心20min，得上清。

1.层析1(亲和层析)

层析介质：rProteinA

缓冲液：溶液A：PBS(20mM PB+0.1M NaCl，pH7.0)

溶液B：50mM Gly，pH2.8

上样：将细胞培养液离心上清上样。

清洗：上样后用5CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用直接用100％的溶液B洗脱。

收集：收集抗CD25嵌合单克隆抗体样品峰。

样品处理：用调节缓冲液(50mM Gly，pH7.2)调节样品pH至7.0。

2.层析2(阳离子层析)

层析介质：SP Sepharose FF

缓冲液：溶液A：PB(10mM PB，pH7.0)

溶液B：PBS(10mM PB+1M NaCl，pH7.0)

上样：将中和后的抗CD25嵌合单克隆抗体溶液上样。

清洗：上样后用5CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集抗CD25嵌合单克隆抗体样品峰。

样品经过上述二步纯化，即亲和层析、阳离子层析以后，纯度可达到95％以上。

实施例5

抗CD25嵌合单克隆抗体的生物活性检测

混合淋巴细胞反应(MLR)抑制试验

用常规方法分离人外周血淋巴细胞(HPBM)，调整细胞密度为1×10⁶/ml，然后混合；加入不同浓度的纯化后的单克隆抗体，浓度范围为0至1000ng/ml。细胞在37℃，5％CO₂的条件下培养6天，然后加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养4小时后，用酶标仪检测细胞的增殖情况。

结果见图3，样品在抗体浓度范围内具有明显的线性关系，显著抑制了混合淋巴细胞增殖反应，显示了体外免疫调节活性。并且，在抗体浓度3.9ng/ml时，即表现出抑制作用；而在样品浓度为43.30ng/ml时，有50％细胞的生长受到抑制，因此本发明的抗体具有极其优异的免疫抑制作用。

安全性试验

在临床试验中，给予受试者约0.2mg/kg体重的本发明前述制备的抗CD25嵌合单克隆抗体。

结果发现，本发明的抗体对人体没有可见的不良影响，在进入人体后不发生可见的排异反应，且不产生过敏现象。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源医药研究有限公司

<120>一种免疫抑制剂-抗CD25嵌合单克隆抗体

<130>065211

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>411

<212>DNA

<213>小鼠

<400>1

atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactgtcc 120

tgtgcagcct caggattcac tttccgtaac tttgacatgg cctgggtccg ccaggctcca 180

acgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agtcctagtg gtggtaccac ttactatcga 240

gactccgtgc agggccgatt cactgtctcc agagataatg caaaaagcac cctatacctg 300

caattggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtacacg acacccgtgg 360

tttggttact ggggccaagg cactctggtc actgtctctt caggtgagtg g 411

<210>2

<211>137

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Arg Asn Phe Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg His Pro Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Trp

130 135

<210>3

<211>396

<212>DNA

<213>小鼠

<400>3

atgaggtgcc taactcagtt cctggggttg cttgtgctct ggattcctgg agtcaatggg 60

gatattgtga tgacccaggg tgcactcccc aatcctgtcc cttctggaga gtcagcttcc 120

atcacctgcc agtctagtaa gagtctgctg cacagcaatg gcaagacata cttgaattgg 180

tatctgcaga ggccaggaca gtctcctcag ctcctgatct attggatgtc tacccgtgca 240

tcaggagtct cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actgaaaatc 300

agtagcgtgg aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc agcaatttct agagtttccg 360

tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa 396

<210>4

<211>132

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Met Arg Cys Leu Thr Gln Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Val Asn Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro

20 25 30

Val Pro Ser Gly Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Gln Gln Phe Leu Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Leu Lys

130

<210>5

<211>1467

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>5

atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gaaggtccct gaaactgtcc 120

tgtgcagcct caggattcac tttccgtaac tttgacatgg cctgggtccg ccaggctcca 180

acgaagggtc tggagtgggt cgcatccatt agtcctagtg gtggtaccac ttactatcga 240

gactccgtgc agggccgatt cactgtctcc agagataatg caaaaagcac cctatacctg 300

caattggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtacacg acacccgtgg 360

tttggttact ggggccaagg cactctggtc actgtctctt caggtgagtg gatcctctgc 420

gcctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc 480

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 540

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 600

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 660

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 720

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 780

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 840

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 900

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 960

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1020

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1080

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1140

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1200

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1260

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1320

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1380

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1440

agcctctccc tgtccccggg taaatga 1467

<210>6

<211>488

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>融合蛋白

<400>6

Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Arg Asn Phe Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg His Pro Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Trp Ile Leu Cys Ala Trp Ala Gln

130 135 140

Leu Cys Pro Thr Pro Arg Ser His Gly Thr Thr Ser Leu Ala Ala Ser

145 150 155 160

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

165 170 175

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

180 185 190

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

195 200 205

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

210 215 220

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

225 230 235 240

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

245 250 255

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

260 265 270

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

275 280 285

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValVal

290 295 300

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

305 310 315 320

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

325 330 335

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

340 345 350

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

355 360 365

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

370 375 380

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

385 390 395 400

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

405 410 415

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

420 425 430

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

435 440 445

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

450 455 460

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

465 470 475 480

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210>7

<211>720

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>7

atgaggtgcc taactcagtt cctggggttg cttgtgctct ggattcctgg agtcaatggg 60

gatattgtga tgacccaggg tgcactcccc aatcctgtcc cttctggaga gtcagcttcc 120

atcacctgcc agtctagtaa gagtctgctg cacagcaatg gcaagacata cttgaattgg 180

tatctgcaga ggccaggaca gtctcctcag ctcctgatct attggatgtc tacccgtgca 240

tcaggagtct cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actgaaaatc 300

agtagcgtgg aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc agcaatttct agagtttccg 360

tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720

<210>8

<211>239

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>融合蛋白

<400>8

Met Arg Cys Leu Thr Gln Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Val Asn Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro

20 25 30

Val Pro Ser Gly Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Gln Gln Phe Leu Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser ValThr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠

<400>9

Val Gln Pro Gly Arg

1 5

<210>10

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠

<400>10

Asn Phe Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu

1 5 10 15

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠

<400>11

Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Leu

1 5

<210>12

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠

<400>12

Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro

1 5 10

<210>13

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠

<400>13

Leu His Ser Asn Gly Lys Thr

1 5

<210>14

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠

<400>14

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

cagaaagctt gccgccacca tggactccag gctcac 36

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

cgaggatcca ctcacctgaa gagacagtga cc 32

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

ccgaggatcc actcacgttt cagttccagc ttggtcccag 40

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

aacgcgtgcc gccaccatga ggtgcctaac tcagttcctg gggt 44

Claims

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的V_H链的互补决定区CDR具有以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：9所示的CDR1，SEQ ID NO：10所示的CDR2，和SEQ ID NO：11所示的CDR3；

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的V_H链具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的V_L链具有SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其V_H链和V_L链分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或者

所述抗体的轻链具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

6.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有：

编码权利要求1所述的单克隆抗体的V_H链的DNA；和/或

编码权利要求1所述的单克隆抗体的V_L链的DNA。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求7所述的表达载体。

9.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

10.一种预防或治疗器官移植排斥反应的方法，其特征在于，所述的方法包括给予患者有效量的权利要求1所述的单克隆抗体。