具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究,构建了一类免疫调节剂,它们可通过免疫抑制作用治疗自身免疫疾病或应用于器官移植等临床病症。具体地,该免疫调节剂包括(a)抗人CD11a单克隆抗体;(b)FLA3Ig融合蛋白;和(c)CTLA4Ig融合蛋白。在此基础上为此了本发明。
如本文所用,术语“自身免疫疾病”是指临床上经常遇到的类风湿关节炎、银屑病、红斑狼疮、多发性硬化症等。
本发明的免疫调节剂是多肽类物质。除了提供免疫调节剂之外,本发明还提供了编码免疫调节剂的DNA分子。本发明的核苷酸编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌;真菌细胞如酵母;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
本发明中涉及的重组细胞培养技术中,可以应用的培养基有许多种。其中,Ham′s101,MEM,RPMI-1640,DMEM等商品化的动物细胞培养基均可使用。在这些培养基中,可以加入适当的激素、生长因子、核酸降解物、微量元素等辅助成分,以提高细胞的活性。如果需要的话,可以添加任何物质,如能量因子等等。培养过程中pH、溶氧等的控制按照一般程序操作。
基本培养基以外的任何添加成分的分量均可通过正交试验设计或最小二乘法来优化。细胞培养的设备,可以使用滚瓶、摇瓶、动物细胞生物反应器等进行。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在优选的重组蛋白纯化工艺中,由于本发明的重组蛋白的纯化有一些共同特点。由于它们都带有Fc片段,因此,在初级纯化时,可以采用protein A填料进行亲和层析进行捕捉。用protein A进行的亲和层析纯化具有得率高、纯化效果好等突出优点,但是偶联的protein A蛋白容易从载体上脱落,并且在使用过程中容易失活,填料污染后不能用NaOH等进行清洗,很难长期使用。
本发明还提供了一种治疗自身免疫疾病和抗免疫排斥的药物组合物,它含有上述的免疫调节剂以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于治疗自身免疫疾病和抗免疫排斥。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫调节剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫调节剂施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 重组人源(化)抗人CD11a单克隆抗体表达载体的构建
1.1 从抗体库中筛选CD11a的抗体基因可变区
人源抗体库的构建过程如下:
1).从1125名健康成年人抽取外周血,每人5毫升,柠檬酸抗凝后混合。
2).用Trizol从上述混合外周血抽取总RNA,用Oligo-dT16进行反转录,获得cDNA。
3).按文献Marks et al.By-passing immunization:human antibodiesfrom V-gene libraries displayed on phage.J.Mol.Biol.,222,581-597和Hoogenboom and Winter,By-passing immunisation:human antibodies fromsynthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro.J.Mol.Biol.,227,381-388所述的方法,用各引物之组合进行PCR,分别获得长度约为330bp的重链可变区和310bp左右的轻链可变区扩增产物。PCR引物组合物为每条引物的终浓度为20pmol/L。扩增条件:预变性94C1min,主循环94C 30sec,54C 30sec,72C 30sec,25循环,后延伸72C 3min。PCR产物1.2%琼脂糖电泳纯化后克隆到pCantab 5E载体(Pharmacia产品)。
4).转化:将上述克隆到噬菌体展示载体pCantabe 5E的质粒DNA,对大肠杆菌菌株TG1(Promega公司)进行电击转化。电击细胞制备:TG1细胞冻存液100ul接种于10毫升含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中,37度培养过夜。取1ml上述过夜培养物,接种到2L上述同样培养基中,37度培养8小时至OD600达0.4。5000RPM离心收集菌体后用冰冷的10%甘油溶液洗涤细胞2次后将细胞重悬于10ml10%甘油中。电击:上述细胞100ul加入到预冷至—20度的100ul电击杯中,加入上述pCantab 5E载体2微生,充分混匀后电击。电击条件:电阻2500欧姆,电压10千伏。上述电击连续进行多次,直至将所有载体DNA用完。
上述电击完成后,立即在电击杯中加入LB液体培养基(不含氨苄青霉素)1毫升,37度培养10小时后加入氨苄青霉素至100ug/L,37度培养6小时后5000rpm收集菌体。将收集的菌体重悬于含7%甘油的LB培养基中,-70℃保存备用。
对制备的抗体库,按以下步骤筛选抗体:
1).复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升,于50毫升三角瓶中37度培养16小时。
2).12000rpm高速离心10分钟,转移上清至一个无菌的50毫升离心管中,保存备用。其滴度应在2×1011以上。
3).以纯化的CD11a蛋白(购自深圳晶美公司)为抗原,常规方法包被25毫升细胞培养瓶。
4).包被后的细胞瓶中加入不少于3 X 1010噬菌体颗粒,37度温育1小时。
5).倒掉瓶中的液体,用10毫升加入了1%Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。
6).在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞,37度温育震荡培养16小时。
7).重复2~6步,共进行4个重复循环。
8).将上述获得的细胞稀释至100000细胞/ml后在加入0.1%氨苄青霉素的1.5%琼脂平板上进行培养以获得单克隆。
9).取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养,每孔一个克隆,共作960个克隆(10块96孔板)。
10).将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后,将上清转移到新的无菌深孔板,封口后保藏于4度备用。
11).取96孔板10块,每孔中加入CD11a(10ug/ml)10微升常规包被后,分别加入上述保存的上清10微升,37度温育1小时后用含有1%Tween-20的PBS洗涤20次。
12).加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗,37度温育30分钟后用1%Tween-20的PBS洗涤10次。
13).加入含有0.025%DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1%的H202,37度温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。
14).根据光吸收读数确定显色反应强的孔,这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
15).通过上述过程,筛选出了抗人CD11a的阳性克隆387个阳性,根据读数确定其中5个亲和力最强的克隆,选其中两个最高的用于后续的研究。这两个克隆分别命名为pCD11-1,pCD11-2.
16).测序分析,结果如下:
表1
氨基酸序列 | 长度 | SEQ ID NO: |
pCD11-1重链 | 121Aa | 1 |
pCD11-1轻链 | 108Aa | 2 |
pCD11-2重链 | 120Aa | 3 |
pCD11-2轻链 | 109Aa | 4 |
1.2 抗体可变区编码序列的表达载体的克隆
1).将上述2个克隆的菌株在100ml LB培养基中扩增,用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。
2).用XbaI和NheI酶切上述质粒DNA后在1.5%琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段,取350bp左右的带进行胶回收,所得片段即为重链可变区。
3).用HindIII和Bsi WI酶切上述质粒DNA后在1.5%琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段,取320bp左右的带进行胶回收,所得片段即为轻链可变区。然后首先将重链可变区插入到表达载体pMG18(图3)的XbaI/NheI位点,再用HindIII和Bsi WI将抗体轻链可变区插入到插入了重链可变区的pMG 18的HindIII/Bsi WI位点,从而构成了人源化抗CD11a抗体基因的表达载体。
1.3 CHO细胞的转染与重组克隆的筛选
1).上述构建的带有抗体基因的表达载体在大肠杆菌DH5a菌株接种于100毫升LB培养基中进行扩增,用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞,操作参照厂家的说明书进行。
2).转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择,最后在96孔板上进行极度稀释培养,连续进行3次,进行单克隆化。
3).挑出的单克隆细胞系在RPM1641培养基上进行培养,对上清进行Western Blotting实验,根据染色反应判断表达强度,挑选出表达强的克隆作为候选细胞株。
4).单克隆抗体的纯化:上述单抗的纯化采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化,并用SDA-PAGE电泳证明,所得产物纯度大于90%。
5).以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析,获得了纯度>98%的样品。这些样品可以用于以下的进一步分析与研究。
结果:通过以上的操作,筛选出上述两种抗人CD11a抗体基因表达强度较高的候选克隆13个和9个(见表2)。
1.4 抗CD11a抗体基因在CHO细胞中表达强度的研究
将上述筛选得到的高表达候选克隆(见表2)培养于10cm的组织培养皿,采用ELISA法测量抗体的表达量:羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板,4℃过夜,经2%BSA于37℃封闭2小时,加入待测的培养上清和标准品(人IgG1),37℃孵育2小时,加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应,37℃孵育1小时,加入TMB于37℃作用10分钟,最后用H2SO4终止反应,测A450值。测得的上述候选克隆的表达量(ug/ml)如下表2所示:
表2
从上表中可以看出,8C9和4D8的表达水平具有很高的表达水平。与国外已经发表的资料(Kunkel,PNAS,82:488,1995)(18.2ug/ml)相比,表达水平提高了17倍和20.7倍。
选取8C9和4D8作为进一步研究对象,细胞株记作CD11-1和CD11-2,分别对应pCD11-1和pCD11-2两种载体分子结构。
实施例2
重组人CTLA4-Ig的细胞株构建和表达
2.1.CTLA-4R编码序列的基本资料
根据已经发表的文献[GenBank Accession Number L15006],CTLA-4R的氨基酸序列(223氨基酸)如SEQ ID NO:5所示,其中第37-171位为胞外区结构域,该片段具有完全的与B7结合的能力,可以作为CD28拮抗剂。本发明中记作CTLAs。
CTLA-4R基因的cDNA序列(5′→3′,672b)如SEQ ID NO:6所示,其中第119-483位为胞外结构域CTLAs的编码序列。
为了在CHO细胞中获得高表达,根据上述CTLAs片段的氨基酸序列,利用DNA/蛋白质分析软件DNAstar和GCG对适合CHO细胞表达的编码序列进行了设计。
2.2.人工设计的CTLAs基因的合成
人工设计的CTLAs基因DNA序列如SEQ ID NO:7所示,其中前9个碱基为添加的3个保护碱基、一个Nhe I酶切位点和一个加入的起始密码。
接着,通过以下程序合成人工设计的全长CTLAs基因:
运用GCG软件将上述序列及其互补序列分解成长约85b的片段,共计25个多核苷酸片段,其中正链的的第一个片段为:
5′-CAGgctagcATGgccatgcacgtggccca gcccgccgtggtgctggcctcctcccgcg-3′(SEQ ID NO:8)
其前三位碱基是保护碱基,第4~9个碱基是插入表达载体时的酶切位点(Nhe I),第一个ATG是加入的起始密码子。该片段也是合成全长融合基因时的上游引物,本研究中记作CTLAs-M。设计原则是互补的相邻品片段之间有18~20个碱基的互补区。参照文献Chrisostomos Prodromou and Laurenee H,Pearl(1992)的方法进行基因的合成。设计的多核苷酸片段委托上海生工生物工程有限公司代为合成并进行PAGE纯化。
合成好的片段按照2微克/微升的浓度溶于灭菌的三蒸水中,按照以下方法进行PCR:
反应体系的组成是:
反应条件如下:
预变性:94度2分钟
主循环:94度1分钟,55度1分钟,72度3分钟。
循环数:20
后延伸:72度5分钟
PCR过程在PROGENE Genium热循环仪上进行。
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有唯一一条分子量350~400bp右的带,用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约2.5微克。
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取18个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了15个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,即CTLAs-M。
2.3.天然CTLAs基因的PCR扩增、克隆和测序
(1).引物的设计
根据前述CTLAs基因的DNA序列,用DNAstar软件进行引物设计,结果如下:
上游引物CTLAs-N:5′-CAGgctagcATGgcaatgcacgtggcccagcc-3′(SEQ IDNO:9),其中,CAG为保护碱基,下划线部分为表达载体pMSG(Pharmacia公司)克隆时的切点(Nhe I)。该片段也是构建天然CTLAs/Fc全长基因时的上游引物,记作CTLAs-N.
下游引物:5′-gtcagaatctgggcacggttc-3′(SEQ ID NO:10)。
上述引物委托上海生工公司进行合成并进行PAGE纯化后用于PCR。
(2).模板DNA的制备
用GIBCO公司的Trizol试剂从人MT细胞中抽提总RNA,操作过程按照厂家的说明进行。抽提的总RNA在1%琼脂糖电泳上确认完整性后用INVITROGENE公司的反转录试剂盒按照厂家说明进行反转录,获得cDNA。反应完毕,经Promega公司的反应体系DNA抽提纯化试剂盒纯化后作为PCR的模板。
(3).PCR扩增
利用上述引物和模板DNA进行PCR,其反应体系如下:
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行,循环条件如下:
预变性:94度2分钟。
主循环:94度1分钟,59度1分钟,72度2分钟,共20循环。
后延伸:72度5分钟。
(4)PCR产物的鉴定和胶回收
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有一条分子量在375bp左右的单一带,与预期的375bp大小一致。用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3.2微克。
(5).天然CTLAs基因的克隆、鉴定与测序
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取5个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了5个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,即CTLAs-N。
2.4.接头序列的设计与合成
当将两个基因或基因片段重组成一个编码区构成融合蛋白的编码序列时,两个目标片段之间往往需要加入一个连接序列,该连接序列的选择有很强的技术性。我们根据多年的经验,设计该片段时遵循的原则是:1)。要使用其编码的多肽不能具有形成二级结构的能力;2)。其编码的多肽不能由糖基化信号;3)。不能有过多的疏水氨基酸。据此,设计的氨基酸序列是(Ala3Ser2)5。其编码的DNA序列是:
5′-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO:11)
根据以上序列,考虑到通过PCR将CTLAs编码区与Fc片段拼接时的需要,该片段的首尾各加上一个分别与CTLAs编码区3’-端和Fc编码区5’-端互补的序列,各约20个碱基长度。因此,人工合成CTLAs的Linker-M全序列为:
5’-taaccatttccatccataattaaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO:12)
天然CTLAs的Linker-N全序列为:
5’-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO:13)
上述两种Linker均由上海生工公司带为合成并进行纯化。
2.5.人IgG1 Fc片段编码序列的获得
天然全长IgG1编码区(1416bp,471氨基酸+终止密码子,Genbank accessionnumber:BC024289)的序列如SEQ ID NO:14所示,其中,第1-426位为VDJ区;第427-1416位为人IgG1恒区,包括CH1+绞链区+CH2+CH3;第718-1416位为人IgG1恒定区中绞链区+CH2+CH3区的编码区。
通过以下程序反转录获得人IgG1编码序列,并克隆到载体pGEM-T上,所得载体记做pIGG-1。具体操作过程:100毫升人外周血,用淋巴细胞分离液(Sigma产品)分离获得白细胞,用Qiagen的mRNA抽提纯化试剂盒抽提mRNA,在1.2%琼脂糖凝胶电泳上鉴定其完整性后用GIBCO公司的RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR,引物为:
正向引物:(加酶切点)atggaactggggctccgctg(SEQ ID NO:15)
反向引物:(加酶切点)tcatttacccggagacag(SEQ ID NO:16)
(因为利用了A/T克隆,此两引物不需要加入酶切点)
PCR条件:预变性94C 2分钟;主循环:94C 1分钟,56C 45秒,72C 90秒,30循环;后延伸:72C 4分钟。
扩增完毕,在1%琼脂糖凝胶电泳上鉴定分离扩增的DNA,用Qiagen公司的DNA胶回收试剂盒回收14Kb的片段后克隆到pGEM-T载体(Promega公司)上,测序验证序列后,获得一个完全正确的克隆,记作pIGG-1。
用于可溶性片段融合的人IgG1Fc(绞链区+CH2+CH3)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示,共232个氨基酸。
人工设计的适合CHO细胞表达的人IgG1 Fc编码序列如SEQ ID NO:18所示。
人IgG1Fc天然编码序列如SEQ ID NO:19所示,共699bp。为了获得IgG1 Fc片段的编码序列,设计和合成如下引物:
3′-端引物Fc-3:5′-gcactcgagttttacccggagacagggagag-3′(SEQ ID NO:20),其中,gca为保护碱基,下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Xho I)。该引物也是获得全长CTLAs/Fc融合基因的下游引物。
5′-端引物Fc-5:5′-gagcccaaatcttgtgacaaaac-3′(SEQ ID NO:21)
以上述引物和含有人IgG1全序列的质粒pIGG-1为模板进行PCR,获得了长度为708碱基的产物。电泳鉴定、克隆和测序方法同上。结果获得pIGG1Fc。
2.6.全长CTLAs-Fc融合基因的获得
(1)全长CTLAs-N/Linker/Fc融合基因的获得
本实施例中设计的接头序列(linker)其氨基酸序列为:
(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO:35);
其DNA序列之一为:
5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO:36)
该序列委托上海生工公司合成后,用PCR方法与前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接后,形成Linker-N/Fc片段。
以前述的Linker-N/Fc和CTLAs-N的DNA为模板,以CTLAs-N和IgG1Fc-3′(SEQ ID NO:20)为引物进行PCR,反应条件为:
反应体系如下:
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行,循环条件如下:
预变性:94度2分钟。
主循环:94度1分钟,60度1分钟,72度3分钟,共20循环。
后延伸:72度5分钟。
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有一条分子量在1500bp左右的单一带,与预期的1540bp大小一致。用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约3微克。
上述DNA片段按照常规方法克隆到商品化的pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取7个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了3个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,记作CTLAs-N/Linker-N/Fc。
(2)全长CTLAs-M/Linker/Fc融合基因的获得
本实施例中设计的接头序列(linker)其氨基酸序列为:
(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO:35);
其DNA序列之一为:
5’-
cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO:37)
该序列委托上海生工公司合成后,用PCR方法与前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接后,形成Linker-M/Fc片段。
以前述的Linker-M/Fc和CTLAs-M(SEQ ID NO:7)的DNA为模板,CTLAs-M和IgG1Fc-3′SEQ ID NO:20)为引物进行PCR,反应体系为:
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行,循环条件如下:
预变性:94度2分钟。
主循环:94度1分钟,60度1分钟,72度4分钟,共25循环。
后延伸:72度5分钟。
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中有一条分子量在1500bp左右的单一带,与预期的1540bp大小一致。用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段,操作按照厂家的说明书进行。共得DNA约2.7微克。
上述DNA片段按照常规方法克隆到pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5a细胞后在IPTG/X-gal平板上进行筛选,取9个白色菌斑接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行扩增,用质粒抽提纯化试剂盒(Promega)抽提质粒DNA并进行酶切鉴定后选出了6个大小正确的克隆并进行DNA序列测定。根据测序结果,确认了1个序列完全正确的克隆,记作CTLAs-M/Linker-N/Fc。
(3)结果
通过以上操作,获得了天然CTLAs基因与Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-N/Linker/Fc和人工设计的CTLAs基因与Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-M/Linker/Fc。这两种融合蛋白的区别在于前者的CTLAs编码区是天然的,而后者的相应区域是人工设计的。图4显示了全长融合蛋白表达产物的分子结构。
2.7.全长CTLAs-Fc融合基因的获得
(1)制备全长CTLAs-Fc融合基因
为了检测接头片段对提高该融合蛋白亲和力的作用,在以下操作中获得了Fc片段与CTLAs-N和CTLAs-M的直接融合片段,此种结构中没有Linker片段。如果对这两种融合基因在CHO细胞中的表达产物和前述CTLAs-N/Linker/Fc和CTLAs-M/Linker/Fc的表达产物的亲和力进行比较,就可以确认Linker片段对亲和力的影响。这两种结构的构建过程如下:
根据Fc和CTLA-M、CTLAs-N的编码DNA序列,设计如下两种引物:
Primer M:5′-taaccatttccatccataattaatctgaggttgtctggaacccag-3′(SEQ ID NO:22)
Primer N:5′-cttattttattcccatcaattgaacatgcccaccgtgcccagcac-3′(SEQ ID NO:23)
以前述的CTLAs-N和带有全长IgG1基因的质粒DNA为模板,CTLAs-N、IgG1Fc-3′和Primer N为引物进行PCR,在琼脂糖凝胶电泳上获得分子量约为1049bp的单一条带后进行胶回收。获得的DNA按照常规方法克隆到pUC18载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选,通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆,记作CTLAs-N/Fc。
重复上述程序,不同点在于用Primer M替换Primer N,用CTLAs-M替换CTLAs-N。结果获得了CTLAs-M与Fc的融合基因,记作CTLAs-M/Fc。
(2)基因的克隆与序列测定
首先通过下列操作对上述扩增的天然CTLA、人工设计的CTLA片段和pUC18进行酶切,
反应体系为:
上述体系在37度反应过夜,在0.8%琼脂糖电泳上进行分离鉴定,用Promega公司的胶回收试剂盒回收大小正确的片段,天然CTLA得到约3微克DNA,人工设计的CTLA约4微克,pUC18得到约3.3微克DNA。
取上述pUC18 DNA和CTLA DNA按照下述程序进行连接:
反应体系:
上述体系在16度反应过夜后,按照常规方法将上述连接好的重组DNA转化大肠杆菌DH5a菌株,并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。取人工设计的CTLAs-M的白斑28个、天然CTLAs-N的白色克隆6个接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基,37度培养过夜后利用Promega公司的质粒抽提纯化试剂盒抽取质粒进行酶切鉴定,发现其中人工CTLAs-M的克隆中有16个克隆具有正确大小,天然CTLAs的克隆中有4个大小与预期相符。这些克隆作为测序的候选克隆。
从上述人工设计CTLAs-M的16个克隆中选10个,从天然CTLAs-N克隆中选取2个进行DNA测序,测序工作委托上海基康公司进行。测序结果表明,获得了序列正确的CTLAs-M/Fc和CTLAs-N/Fc克隆。
2.8.CTLA基因的表达载体克隆
(1).融合基因DNA和载体DNA的准备
前述工作已经构建了CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc四种融合蛋白基因。将上述确认的正确克隆接种于含有氨苄青霉素的20毫升液体LB培养基,37度培养过夜,用Promega公司的Midi质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提质粒DNA,各得质粒DNA约30微克。
按照下述条件进行酶切并进行胶回收,获得各融合基因的DNA片段和准备好的pMSG载体(Pharmacia公司)(图5)。
反应体系:
上述体系在37度反应过夜,在0.8%琼脂糖电泳上进行分离鉴定,用Promega公司的胶回收试剂盒回收大小约为1500b的片段,CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc各得到约1.2微克、2.7微克、1.6微克、1.8微克DNA,pMSG得到约3.4微克。
(2).将融合基因片段重组到pMSG表达载体:
通过下述反应将CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc基因连接到pMSG载体上并进行转化和蓝白斑筛选:
反应体系:
上述反应体系在16度反应过夜(10小时以上)。
(3).细菌的转化、克隆的鉴定与测序:
上述体系在16度反应过夜后,按照常规方法将上述连接好的重组DNA转化大肠杆菌DH5a菌株,并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑12个接种于LB液体培养基37度培养后抽取质粒进行酶切鉴定,每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆,作为候选克隆。
将上述候选克隆中的两个进行DNA测序,测序工作委托上海基康公司进行。根据测序结果,分别确认CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc分别有3个、2个、1个和1个克隆的序列与设计的完全一致。
上述研究中获得的正确克隆分别称之为:pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]。(N代表天然的,M代表突变的)。
实施例3 重组人CD2结合蛋白的细胞株构建
3.1.FLA3胞外区编码基因的分析与设计
FLA3(也称为CD58)的天然DNA序列(GenBank Accession NumberNM_001779)如SEQ ID NO:24所示,其中第10-762位为全长蛋白质编码区,第10-369位为CD2结合区域的编码区。对应的氨基酸序列SEQ ID NO:25所示,全长为250个氨基酸,第1-120位为CD2结合区域。
据此,可以设计引物,利用PCR方法将该区扩增出来,并与人IgG1 Fc片段构成融合蛋白FLA3Ig。其氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示,其中第1-120位为CD2结合区域,第121-347为IgG1 Fc片段。
将天然的CD2结合区和IgG1的Fc编码区重组,所形成的融合基因的DNA编码序列如SEQ ID NO:27所示,其中第1-360位CD2结合区的编码序列。
如同前述,为了获得在CHO细胞中的高表达,按照哺乳动物细胞对密码子的偏爱性,设计了适合CHO细胞表达的FLA3-Ig融合蛋白基因,如SEQ IDNO:28所示,其中第1-360位CD2结合区的编码序列。
上述构建的融合基因的表达产物为FLA3-Ig,其成熟蛋白的结构如图6所示。
3.2 FLA3胞外区基因的获得
根据前述的FLA3胞外区的cDNA序列和人工设计的序列,分别用PCR方法进行相应区段DNA的扩增和全长合成,分别得到该区的天然编码片段和人工设计的编码片段。操作如下:
天然编码片段重组表达载体的构建
FLA3天然编码片段的获得
根据其cDNA的序列,合成如下引物:
正向引物:5′—ATGGTTGCTGGGAGCGACGC—3′(SEQ ID NO:29)
反向引物:5′—tttacccggagacagggagag—3′(SEQ ID NO:30)
合成的引物按照1.0 OD溶于100微升无菌水的比例进行溶解,稀释10倍后使用。PCR条件为:
模板DNA(100ng/ul)1ul,10mM dNTPs 1.5ul,2ul 10X PCR,1.5ul 25mM MgCl2,引物各1ul,加水至20ul的终体积。循环条件:预变性94C 2分钟,主循环为94C30秒,56C30秒,72C 1分钟,30循环后进行3分钟后延伸。
PCR完毕,在1.2%琼脂糖凝胶电泳上分析PCR产物,发现在350~400bp靠近350bp处有一条惟一的带。此带大小与理论大小相符,为目标带。用胶回收试剂盒对该带进行DNA回收,常规方法克隆到T-载体(购自Promega公司)上,挑选阳性克隆后进行测序验证。在5个测序的克隆中有两个序列与预期的完全一致,取其中pFLA3-N保存备用。
3.3 全长FLA3Ig融合蛋白基因的合成
上游正向引物:5′—gctagcATGGTTGCTGGGAGCGACGC—3′(SEQ IDNO:31)(含酶切位点Nhe I)
拼接正向引物:
5′-GAAGTTCTTTCTTTATGTCGACAAAACTCACACATGCCCA-3′(SEQ IDNO:32)
拼接反向引物:
5′-TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGACATAAAGAAAGAACTTC-3′(SEQ IDNO:33)
下游反向引物:5′-TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCctcgag-3′(SEQ IDNO:34)(含酶切位点XhoI)
以上述引物和pFLA3-N和pIGG-1为模板,用上述4种引物进行重迭PCR,扩增合成全长FLA3-N/Ig基因。获得全长基因后克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)上,测序验证后取一个序列完全正确的克隆,保存备用。该克隆记作pFLA3Ig-N。
3.4.FLA3Ig人工基因的全合成
根据设计的人工基因序列,设计12个片段,每个长度约85bp。设计引物时在全序列的两侧加上酶切位点。委托上海生工公司合成后用PCR方法获得该基因片段的1041bp的全长扩增产物。然后,用对其进行鉴定、克隆和测序,最终找到1个克隆具有完全正确的序列,保存备用。该克隆记作pFLA3Ig-M。
3.5.重组人CD2结合蛋白的细胞株构建
与实施例2中构建CTLA4Ig表达载体的一样,将上述FLA3Ig-N和FLA3Ig-M的结构基因插入到pMSG表达载体(图5)上,经筛选获得阳性克隆后进行DNA测序以验证所得重组子的正确性。
实施例4 重组CHO细胞的获得
1).质粒DNA的提取与纯化
取实施例1-3中制备的带有重组质粒的大肠杆菌菌株,分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基,37度260rpm震荡培养16小时后用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid Purification Kit抽提质粒DNA,抽提过程按照厂家提供的说明书进行。
2).CHO细胞的转染与筛选
采用脂质体法对CHO细胞进行转染,转染试剂盒购自Invitrogene公司,转染时分别取上述纯化的质粒DNA 100微克作为样品对CHO细胞进行转染,转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选,其浓度从0.05uM到10uM,每两周增加一次浓度,每次MTX的用量约为前一次的2倍,具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行,培养基为:15%胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5%CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。然后,用ELISA方法分别检测各克隆目标重组蛋白的表达量,并据此每种融合基因挑选若干个表达量最高的克隆,确认其中一个表达量高而稳定的克隆用于进一步的研究。
结果
1.CTLA4Ig融合蛋白:总共得到pMSG[CTLAs-N/Linker-N/Fc]克隆110个、pMSG[CTLAs-M/Linker-N/Fc]克隆87个、pMSG[CTLAs-M/Fc]克隆93个、pMSG[CTLAs-N/Fc]克隆112个。分别得到高表达克隆5个,1个,2个,2个。
2.抗CD11a单抗:得到1850个克隆,其中CD11-1 960个,CD11-2 890个。前者得到2个高表达克隆,后者得到5个高表达克隆。
3.FLA3Ig:
总共得到428个高表达克隆,其中FLA3Ig—N4个,FLA3Ig—M2个。
3)融合基因表达水平的研究
用ELISA方法对上述部分克隆的CTLAs-Fc融合基因在CHO细胞中的表达强度进行了研究,具体数据如下:
表3
基因类型 | PMSG[CTLAs-N/Linker/Fc] | PMSG[CTLAs-M/Linker/Fc] | pMSG[CTLAs-N/Fc] | PMSG[CTLAs-M/Fc] |
被测克隆数量 | 47 | 44 | 38 | 48 |
平均表达水平(毫克/升上清) | 0.37±0.21 | 2.68±0.28 | 0.39±0.34 | 2.89±0.52 |
以上数据说明,CTLAs-M的表达强度在有Linker和没有Linker的融合结构中均有明显增强的表达。这说明,基因的人工设计明显提高了其表达水平,提高的幅度高达14.6倍。这说明人工设计的CTLAs-M基因在CHO细胞中有明显提高了的表达,对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。
实施例5 重组蛋白的纯化
5.1 抗人CD11a单抗的纯化
一种抗人CD11a单抗的纯化工艺流程可以是:蛋白A柱→反相柱→分子筛。在该工艺中,由于重组单抗是分泌型表达的,因此培养上清经过简单离心,除去细胞残片后即可直接进行亲和层析。用protein A亲和层析时,可以使用如下方法中的一种:
将protein A填料按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后,在4度慢速搅拌24小时。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4缓冲液中漂洗4次后,用含250mM氯化钠的同样缓冲液洗脱后进行硫酸铵分步沉淀,起始浓度为35%饱和度,终止浓度63%饱和度。4度处理12小时后高速离心,取沉淀,重新溶于上述不含氯化钠的缓冲液中,并于同样缓冲液透析过夜后浓缩10倍,待用。
上述样品可经SDS-PAGE或HPLC检定纯度,ACD法或Follin酚法定量蛋白质含量。经上述纯化的重组蛋白,其纯度可达90%以上,并具有显著生物活性。
第二种方法是把protein A装成柱子,用手动的或自动的上样设备上样后,经过100mM Tris-HCl pH8.5的缓冲液洗涤四体积后,用含100~400mM氯化钠的洗脱液洗脱,即可获得经protein A捕捉的单克隆抗体。洗脱峰在233~260mMNaCl处被洗脱,所得样品可再经反向层析和分子筛进一步纯化,可得到纯度达93%以上的重组蛋白。这种方法操作可自动化,并连接在线监测设备,可随时了解操作状况。
单克隆抗体也可以不经过protein A亲和层析,直接使用硫酸铵分步沉淀法进行纯化。其得率可达到12%,纯度可达90%以上。
5.2 重组人CTLA4Ig融合蛋白的纯化
一种重组人CTLA4Ig融合蛋白的纯化工艺流程可以是:蛋白A柱→分子筛→离子交换柱→疏水层析。
与CD11a单克隆抗体一样,CTLA4Ig也具有同样的Fc片段,因此也可用protein A进行亲和层析。亲和层析的条件与CD11a基本一致,只是在洗脱时需降低NaCl的用量,梯度洗脱时的用量降到190~210mM,批量洗脱时可用210mM。
在CTLA4Ig纯化工艺中,亲和层析获得的重组蛋白需要经过G75分子筛去除部分大分子和小分子杂质,更换缓冲液至pH7.5的100mM磷酸缓冲液,然后上到Q-Sepharose柱上,4体积洗涤后用含250mM NH4SO4的50mM Tris-HCl溶液洗脱。洗脱液可直接上Octyle-O柱进行疏水层析,50mM Tris pH7.5洗脱后即可保存备用。
该方法获得的样品纯度可达95%以上,总得率在75%以上,是一种比较理想的纯化方法。该方法容易放大,适宜工业规模生产。
5.3 重组人FLA3Ig融合蛋白的纯化
一种重组人FLA3Ig融合蛋白的纯化工艺流程可以是:蛋白A柱→离子交换柱→疏水层析→分子筛。
FLA3Ig融合蛋白的纯化与上述CTLA4Ig的纯化过程一样都包含了protein A亲和层析,且上样和洗脱条件一致。洗脱物经过QA-柱进行再次纯化,洗脱剂为含250mM NH2SO4的Tris-HCl缓冲液,洗脱液直接上疏水层析柱,洗脱液为50mM Tris-HCl缓冲液。洗脱液经过Sephadex G200 SF进一步分离后,其纯度可达98%,总得率为11.7%左右。
该方法具有操作简便,容易放大的特点,容易进行工业规模的生产。
实施例6 免疫功能下调的实验验证
6.1.抗人CD11a单克隆抗体生理活性和亲和力研究
(1)生理活性:混合淋巴细胞培养试验
对实施例1获得的细胞株所产生的单克隆抗体,进行了生物学活性检测。具体方法和结果如下:
常规分离人外周血淋巴细胞,调整细胞密度为2×106 cells/ml,将两人PBMC(同种异体双向MLR(mixed lymphocyte responses))等体积混合后以2×105cells/孔接种“U”型96孔培养板,加入不同体积的纯化融合蛋白,设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照,每组3复孔,37℃,5%CO2培养5d,终止培养前16h加入3H-TdR(终浓度5μCi/ml),收集细胞于0.45μm微孔滤膜上,烘干,液体闪烁计数仪测DPM值。统计学处理结果以x±s表示,MicrosoftExcel统计程序进行均数差异显著性分析。
在MLR反应体系中,分别加入1ul、5ul和10ul Protein A纯化抗CD11a单克隆抗体表达载体或空载体转染CHO细胞上清,结果表明,即使加入1ul ProteinA纯化表达得单克隆抗体能显著抑制人外周血MLR,抑制率为66%~75%;而加入同样体积的空载体转染的CHO细胞上清,则无此作用。经单因素方差分析,其差异达到极显著水平,结果见下表4。同样,我们也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验,未能观察到显著的抑制作用,这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量单抗蛋白的抑制作用相互抵消有关。
表4 纯化CD11a单克隆抗体对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM,n=3)
MLR实验表明该纯化融合蛋白具有抑制免疫应答反应的活性。以上结果表明,实施例1成功克隆并在CHO细胞中表达了有生物学活性的抗CD11a单克隆抗体。
上述结果还表明,CD11-2具有比CD11-1更强的抑制作用。
(2)亲和力鉴定
亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson et al,1980,Anal.BioChem.,107:220)进行。
结果表明,CD11-1和CD11-2两种单抗的亲和力分别达到3.2 X 10-9和8 X 10-6。上述结果表明,CD11-1和CD11-2两株单克隆抗体的亲和力已经分别达到1nM和0.1nM的水平,CD11-1已经达到国外已经发表的水平,而CD11-2则比国外已经发表的最好结果提高了一个数量级。
6.2 重组人CTLA4Ig融合蛋白的生物活性研究
(1)CTLAs抑制淋巴细胞增殖能力的研究
将上述pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]的表达细胞株培养后用Protein A-Sepharose进行亲和层析,获得纯度达90%以上的融合蛋白。
常规分离人外周血淋巴细胞,调整细胞密度为2×106 cells/ml,将两人PBMC(同种异体双向MLR)等体积混合后以2×105 cells/孔接种“U”型96孔培养板,加入不同量的纯化融合蛋白,设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照,每组3复孔,37℃,5%CO2培养5d,终止培养前16h加入3H-TdR(终浓度5μCi/ml),收集细胞于0.45μm微孔滤膜上,烘干,液体闪烁计数仪测DPM值。结果以x±s表示,Microsoft Excel统计程序进行均数差异显著性分析。
在MLR反应体系中,分别加入1微克、5微克和10微克Protein A纯化纯化的CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc或空载体转染CHO细胞上清,结果表明,即使加入1微克Protein A纯化的融合蛋白,也能显著抑制人外周血MLR,抑制率为60%~70%;而加入同样体积的空载体转染CHO细胞上清,则无此作用,经单因素方差分析,结果有统计学意义(见表5)。同样,也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验,未能观察到显著的抑制作用,这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有关。
表5 纯化CTLA-4/Ig对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM,n=3)
*:P<0.01vs control;△:P<0.01 vs 0
从以上数据可以看出,加入Linker的融合蛋白比没有Linker的融合蛋白对人外周血MLR的抑制作用提高了大约1.5倍。这说明,Linker的加入可以明显提高融合蛋白对淋巴细胞的抑制能力。
6.3 重组人FLA3Ig融合蛋白的生物活性研究
(1)Jurkat细胞结合试验
Jurkat细胞表面有CD2,以培养的此种细胞,用含有10%胎牛血清的RPMI洗涤三次后制备成5 X 106细胞/ml的悬液,在一个6孔细胞板每个孔中加入1ml细胞悬液。在3个孔中分别加入10微克纯化的FLA3Ig,3个孔中分别介入TNFRIg(阴性对照)。0C温育4小时后,用RPMI培养基轻轻洗涤2次后,加入HRP标记的羊抗人IgG单克隆抗体,RPMI洗涤4次后加入DAB显色剂和H2O2,37度温育10分钟。在40X和100X相差显微镜下观察细胞颜色反应和细胞相互结合的情况。
结果发现,阴性对照无显色反应,而FLA3Ig孔中的细胞呈棕色显色反应。显微镜观察表明,Jurkat细胞有明显的凝集现象。这种现象是由于FLA3Ig是一个二价分子,部分分子的两个臂分别结合了一个细胞,从而导致了细胞的凝集。此种反应与凝集素凝集血红细胞的情况十分相似。
(2)FACS测定
在Eppendorf管中加入1 X 105 Jurkat细胞,1000RPM离心收集细胞,重悬浮于100ul浓度为10ug/ml的LFA3Ig溶液中,缓冲液成分为:含0.5%BSA的PBS,pH7.2.混合充分后冰浴30分钟,用上述缓冲液洗涤2次后与100ul 1:50稀释的FITC标记的羊抗人IgG单克隆抗体冰浴30分钟后用PBS洗涤两次,再重悬于300ul PBS中。上述试验以TNFRIg为阴性对照。上述重悬的细胞在FACS仪器上进行分析。
结果如图7所示。阴性对照TNFRIg进行FACS时未出现荧光。从图7中可以看出,FLA3Ig具有明显的与Jurkat细胞结合的能力。
(3)MLR反应
从两个无亲缘关系的供者各抽取20毫升新鲜血液,Ficoll梯度分离白细胞。其中之一种细胞用2000RADs进行r射线处理。上述两种细胞均调至3 X 106细胞/ml。
将两人PBMC(同种异体双向MLR)等体积混合后以2×105 cells/孔接种“U”型96孔培养板,加入不同量的纯化融合蛋白,设置等体积相应空载体转染上清或培养基作对照,每组3复孔,37℃,5%CO2培养5d,终止培养前16h加入3H-TdR(终浓度5uCi/ml),收集细胞于0.45um微孔滤膜上,烘干,液体闪烁计数仪测DPM值。结果以x±s表示,Microsoft Excel统计程序进行均数差异显著性分析。
在MLR反应体系中,分别加入1微克、5微克和10微克Protein A纯化的FLA3Ig-N,FLA3Ig-M或空载体转染CHO细胞上清(阴性对照),结果表明,即使加入1微克Protein A纯化的融合蛋白,也能显著抑制人外周血MLR,抑制率为60%~70%;而加入同样体积的空载体转染CHO细胞上清,则无此作用,经单因素方差分析,结果有统计学意义(见表6)。同样,也曾用未纯化的转染细胞的上清直接进行MLR实验,未能观察到显著的抑制作用,这可能与未纯化细胞转染上清中异源蛋白的刺激作用与微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有关。
表6 纯化FLA3Ig对人MLR中淋巴细胞增殖的影响(DPM,n=3)
*:P<0.01vs control;△:P<0.01 vs 0
从上述数据可以看出,FLA3Ig-M的相对活性明显比FLA3Ig-N高。考虑到二者蛋白质的氨基酸序列完全相同,显然这种差别是由于表达量不同引起的。这也说明,FLA3Ig-M的DNA编码序列比FLA3Ig-N的DNA序列更适合CHO细胞中表达。
实施例7 临床应用的动物模型验证
对上述三类6种【其中抗体2种(CD11-1和CD11-2),FLA3Ig 2种(FLA3Ig-N和FLA3Ig-M),CTLA4/Fc 2种(CTLAs-M/Fc和CTLAs-M/Fc)】物质的功能进行了动物模型试验,主要研究结果如下:
7.1.对类风湿关节炎模型的治疗作用
(1)单药的治疗功能
上述6种物质各自单独使用,进行了如下研究。
100.mu.gII型胶原(CII)加入完全弗氏佐剂,皮内注射B10.RIII小鼠,14天后再重复一次,这时小鼠体内出现胶原诱导的类风湿关节炎(CIA)症状,28天后92%小鼠显示严重的CIA症状。对小鼠腹膜注射本发明的抗CD11a单克隆抗体,观测其在小鼠体内对CIA的症状的影响作用。12周后进行检测。实验组小鼠每周3次,每次注射10.mu.g前述制备的6种物质,从第1天到35天;给对照组小鼠注射PBS作为阴性对照。
观察发现,对照组小鼠均发生关节红肿、关节僵硬等症状,在给药组则只有轻微的肿胀,但未发生关节僵硬等严重症状。这表明6种物质与对照组相比,均能够显著降低类风湿的严重程度。因此,本发明的单抗有可能开发成为治疗类风湿关节炎或其他自身免疫疾病的药物。
(2).组合用药的治疗功能
从前述3类6种药物中各选1种(CD11-1,FLA3Ig-N和CTLAs-N/Fc),两两组合,进行了上述同样的模型进行抑制类风湿关节炎的研究,结果如下表7所示。
表7
组合 | CD11-1+FLA3Ig-N | CD11-1+CTLAs-N/Fc | FLA3Ig-N+CTLAs-N/Fc | CD11-1 | FLA3Ig-N | CTLAs-N |
治疗效果 | +++++ | ++++ | ++++ | ++ | +++ | + |
从上述结果可以看出,当两种药物联合应用时,比单独应用治疗类风湿关节炎的效果要好。
7.2 抗免疫排斥试验—小鼠器官移植试验
(1).单药的抗排斥试验
上述抗体用于小鼠心脏抑制试验时,可以明显提高受试动物的存活率和平均存活天数。下表8显示了该试验的结果。供试药物为抗人CD11a单克隆抗体、FLA3Ig和CTLA4Ig。
正常昆明种小白鼠,雌雄各半,每组12只。其中6只为受体,6只为供体进行心脏移植。
表8
0=阴性对照空白上清;A=CD11-1,B=CTLAs-N/Fc,C=FLA3Ig,D=CD11-1+FLA3Ig-N,E=CD11-1+CTLAs-N/Fc,F=FLA3Ig-N+CTLAs-N/Fc.
从上述实验中可以看出,鼠源和人源化的抗人CD11a单克隆抗体、FLA3Ig和CTLA4Ig都能显著提高器官移植受体的30日存活率和平均存活天数。显示这些免疫功能下调的药物具有一定的克服免疫抑制效应的功能,有可能用于抗免疫排斥的药物开发。
(2)组合用药的抗排斥试验
上表中的组合药物试验中,也显示了三种药物具有明显的抗免疫排斥的作用,其中CD11的效果明显优于其他药物。组合药物的情况下,同样显示了含有CD11-1组份时效果明显提高,且常常表现药物间明显的加性效应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。