CN103361401A - 海产品中简单异尖线虫的TaqManPCR检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，具体地讲是TaqMan实时荧光定量PCR检测法，其中扩增反应体系中使用的上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttc att-3’，下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc acagtc-3’，荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tt cgg tga a(TAMRA)-3’。而反应体系所用引物、探针及其他试剂可另行以试剂盒包装成品。与现有技术相比，定量准确；检测速度快，仅需1～1.5小时；方法简单，操作简便；重复性好；特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种海产品中致病寄生虫的检测方法，具体地说是涉及海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法。
背景技术
异尖线虫幼虫是重要的人兽共患寄生虫病病原体，其寄主十分广泛，在世界各地的各种海鱼中大量寄生。人误食寄生在海鱼体内的异尖线虫III期幼虫可引起异尖线虫病，典型的异尖线虫病在全球已呈扩散趋势，临床症状为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，此外还可以引起人的过敏性症状。至今已报道可引起人类异尖线虫病的异尖线虫主要有6种，即简单异尖线虫(Anisakis simplex)、典型异尖线虫(A.typica)、抹香鲸异尖线虫(A.physeteris)、拟地新线虫(Psetwloterranova decipiens)、对盲囊线虫(Contracaccum spp.)和宫脂线虫(Hysterothylacium spp.)。简单异尖线虫是我国海鱼异尖线虫寄生的优势种，目前对异尖线虫幼虫的鉴定主要依靠灯检法、酶消化法和酶联免疫法。由于异尖线虫种类多，寄生于人体和鱼类的幼虫虫体细小，很多种间形态差异不明显，灯检法很难鉴别虫种。酶消化法存在检测时间长，操作繁琐等问题，酶联免疫法由于抗原的提纯很难且易变性失活，相近种间的交叉反应很难消除造成特异性和敏感性较差，因此免疫学方法还需要进一步的研究。近年来国内外学者应用PCR方法对多种异尖线虫幼虫进行检测和鉴定，取得良好效果，但由PCR产物污染引起的假阳性以及溴化乙锭(EB)的强致癌性对人体健康有很大的危害。TaqMan PCR检测法已成为动物病原检测的重要方法，它具有定性定量、操作简便、不易污染、快速实时、敏感性高、特异性强、重复性好、结果直观等优点，目前已广泛用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测，但至今未见用TaqMan PCR检测法检测简单异尖线虫的报道。因此，应用TaqMan PCR检测法对我国沿海海鱼中常见的简单异尖线虫幼虫进行快速检测与鉴定具有比灯检法、酶消化法和酶联免疫法更为可靠、更加简便快速、更高的特异性和更好的定量性。
发明内容
本发明的目的是提供了一种海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法。该方法适用于目前存在于市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，能够快速地对海产品中简单异尖线虫进行鉴定和定性定量检测。TaqMan实时荧光定量PCR检测法定量准确，重复性好。而且，此方法对样品的检测仅需要1～1.5小时，应用起来简单快速。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
(一)、确定简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中的特异性片段，并制备简单异尖线虫阳性对照与定量标准品：根据GenBank公布的简单异尖线虫细胞核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)全基因序列(JN005757.1)中523～629位共107个bp的特异性DNA片段为：5’-gcacattg cgctatcggg ttcattcccg atggcacgtc tggctgaggg tcgaattacg gtgaactgtcttcacggttt ttctggactg tgaagcattc ggcaagcaa-3’，以此特异性片段为阳性基因片段构建阳性质粒，鉴定阳性质粒的序列与GenBank公布的简单异尖线虫细胞核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)全基因序列(JN005757.1)中该片段的顺序一致、PCR产物长度、以及基因位置完全一致。构建的阳性质粒可在E.coli Competent Cell JM109中增殖并提取，所构建的阳性质粒DNA浓度为220ng/μl，换算成拷贝数浓度为3.6×1011/μl，该浓度下的阳性质粒DNA即为PCR检测的定量标准品，在进行PCR检测前将该定量标准品按拷贝数浓度系列化要求稀释成多个标准样本。
(二)、根据上述的简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中的特异性DNA片段，设计引物与TaqMan探针，并人工合成：根据GenBank上登录的简单异尖线虫细胞核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)全基因序列(JN005757.1)中523～629位的基因片段，预期扩增产物长度107bp；上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttc att-3’，在ITS基因序列上位于523～546；下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc aca gtc-3’，在ITS基因序列上位于629～605；荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’，在ITS基因序列上位于561～586。
(三)、在可能含有简单异尖线虫的海产品、线虫样品或用75％酒精保存的线虫样品中提取总DNA：取0.5～5克可能含简单异尖线虫的海产品样品(肝、肠等内脏)，在-20℃预冷的研钵中研成匀浆。可以将线虫样品直接用-20℃预 冷的研钵中研成匀浆；或将由75％酒精保存的线虫样品经蒸馏水反复冲洗后用-20℃预冷的研钵中研成匀浆。上述样品匀浆经1000rpm离心2分钟取上清用TaKaRa生物工程有限公司生产的寄生虫基因组DNA提取试剂盒(DV811A)提取，DNA提取过程按DNA抽提试剂盒说明操作。按操作要求所提取DNA即为简单异尖线虫细胞核糖体DNA待测样本。
(四)、荧光定量PCR反应和扩增及荧光定量测定：(a)PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq 10μl、无菌双蒸水6.8μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、5μM TaqMan探针0.4μl、模板2.0μl，反应总体积20μl，其中Premix Ex Taq由TaKaRa生物工程有限公司生产，模板为阳性模板(标准样本)或目标模板(待测样本)。(b)PCR扩增温度循环条件：预变性95℃30s、变性95℃5s、退火延伸60℃30s为一个循环，共进行40个循环；温度变化速率选择20℃/s；(c)荧光定量测定：荧光定量PCR仪选用瑞士罗氏公司的Light Cycler II，在60℃收集荧光信号，收集方式设为单点收集(SINGLE)；仪器检测通道选择“F1”。也可选用其他型号的荧光定量PCR仪，在60℃时测定收集荧光信号。测定结束后如Ct值＞40为阴性，即目标模板中不含简单异尖线虫细胞核糖体DNA，如Ct值＜35为阳性，即目标模板中含有简单异尖线虫细胞核糖体DNA，如40≥Ct值≥35则不能确认目标模板中是否含有简单异尖线虫细胞核糖体DNA，需重新测定。
(五)、建立荧光定量PCR标准曲线：把包含简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中特异性片段的阳性质粒DNA以10倍系列稀释至工作浓度，即浓度系列为：3.6×1011copies/μl，3.6×1010copies/μl，3.6×109copies/μl，3.6×108copies/μl，3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl，3.6×10copies/μl，3.6copies/μl；取其中7个工作浓度：3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl，3.6×10copies/μl，用荧光定量PCR测定各个工作浓度样本，仪器自动绘制log[标准样本拷贝数浓度]——循环阈值(即Ct值)的曲线如图1。经测定本方法的标准曲线的斜率(slope)约为-3.330；引物与反应条件的扩增效率(E值)计算：E＝10[-1/slope]-1＝0.99，理想值0.8＜E＜1.2，提示本方法引物设计良好、反应体系运行正常。标准曲线相关系数(r)＝-1，提示标准 曲线线性良好，定量准确可靠。
(六)、测定样品中简单异尖线虫的含量：按规程从可能含有简单异尖线虫的样品中提取总DNA制作成待测样本，用荧光定量PCR测定该待测样本，读取循环阈值(即Ct值)，对照标准曲线，求取log[待测样本拷贝数浓度]的具体数值，求该数值的反对数，即可得到样品中简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因的拷贝数，从而得样品中简单异尖线虫含量的多少。
根据本发明提供的一种海产品中简单异尖线虫的TaqMan实时荧光定量PCR检测原理，可以进一步制作成一种简单异尖线虫的TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，将其用于海产品中简单异尖线虫的检测与鉴定。试剂盒由下列组分组成：上游引物、下游引物和荧光标记的TaqMan探针；还可增加2×荧光PCR反应预混液(2×Premix Ex Taq)、定量标准品或配制成拷贝数浓度系列的阳性模板、无菌双蒸水。其中上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttcatt-3’；下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc aca gtc-3’；荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’，也即其中荧光标记的TaqMan探针5’端标记FAM(荧光报告基团)，3’端标记TAMRA(荧光淬灭基团)。
本发明提供的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，具体测定步骤如下：
(a)用定量标准品制备标准样本，即将定量标准品以一定拷贝数浓度梯度规律制作为成系列工作浓度的标准样本；
(b)用DNA提取试剂盒从待测标本中提取总DNA作为待测样本；
(c)取(a)步所得各工作浓度标准样本为阳性模板和待测样本为目标模板分别加入到各自包含PCR反应体系的试管中，同步进行荧光定量PCR检测；
(d)对各工作浓度标准样本测定出的Ct值(循环阈值)与浓度对数值，即log[阳性模板拷贝数浓度]作出标准曲线，将待测样品测出的Ct值从标准曲线中找出log[目标模板拷贝数浓度]值，求出其反对数，即为简单异尖线虫细胞核糖体DNA拷贝浓度；
其中PCR反应体系为2×Premix Ex Taq(荧光PCR反应预混液)10μl、无菌双蒸水6.8μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、5μM TaqMan探针0.4μl、模板2.0μl，反应总体积20μl，其中模板即为(c)步中加入的阳 性模板或目标模板；且上游引物、下游引物和定量标准品分别根据简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因序列上的不同片段设计合成；
所说PCR检测时，其荧光定量PCR反应的扩增条件是预变性95℃30s、变性95℃5s、退火延伸60℃30s为一个循环，共进行40个循环；温度变化速率选择20℃/s；荧光信号收集在60℃收集；收集方式设为单点收集；仪器检测通道选择“F1”。
所说上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttc att-3’，下游引物为5’-ttg cttgcc gaa tgc ttc aca gtc-3’，TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cggtga a(TAMRA)-3’。
荧光定量PCR的灵敏度：把包含简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中特异性片段的阳性质粒DNA以10倍系列稀释至工作浓度，取7个工作浓度，分别为3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl，3.6×10copies/μl，用荧光定量PCR测定各个工作浓度样本从3.6×107copies/μl～3.6×101copies/μl的7个浓度均能见到标准S形扩增曲线，提示本方法的检测灵敏度不低于3.6×10copies/μl，见图2。
荧光定量PCR检测重复性：组内重复性测试，以5个不同浓度的标准样本为模板，分别为：3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl。每个浓度测试3个平行样本，取测试结果的Ct值，测试结果如图3。
荧光定量PCR检测重复性：经统计学计算得到标准偏差(SD)和变异系数(CV)，荧光定量PCR法检测简单异尖线虫的重复性很好，标准差(SD)分布在0.046～0.193，实验变异系数(CV)分布在0.212％～0.593％。
荧光定量PCR检测特异性：在NCBI(National Center of Biotechnology Information)上用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)比较各种异尖线虫PCR引物与TaqMan探针的特异性，先用形态学作初步鉴定再用各种特异性PCR作进一步鉴定来验证荧光定量PCR的鉴定结果准确性，得到结论是，本发明中使用的引物与TaqMan探针具有高度特异性。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点：定量准确；检测速度快，仅需1～1.5小时；方法简单，操作简便；重复性好；特异性强。
附图说明
图1、荧光定量PCR标准曲线，以纵座标为循环次数，横座标为log[样本浓度]，结果：实时荧光定量PCR的相关系数：r＝-1，斜率：slope＝-3.330。
图2：快速荧光PCR灵敏度，以纵坐标表示荧光强度，横坐标表示循环次数，A、B、C、D、E、F、G-不同稀释浓度的扩增曲线，其中：A-3.6×107，B-3.6×106，C-3.6×105，D-3.6×104，E-3.6×103，F-3.6×102，G-3.6×10；结果：检测灵敏度不低于3.6×101copies/μl。
图3：快速荧光PCR的重复性，以纵坐标表示荧光强度，横坐标表示循环次数，图中：A、B、C、D、E-不同稀释浓度的扩增曲线，其中：A-3.6×107，B-3.6×106，C-3.6×105，D-3.6×104，E-3.6×103；结果：荧光定量PCR法检测简单异尖线虫的重复性很好，标准差(SD)分布在0.046～0.193，实验变异系数(CV)分布在0.212％～0.593％。
具体实施方式
一、简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中的特异性片段的选取和简单异尖线虫阳性对照模板质粒定量标准品的制备：根据GenBank公布的简单异尖线虫细胞核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)全基因序列(JN005757.1)中TaqMan荧光定量PCR的扩增产物序列中523～629位共107个bp的特异性DNA片段为：5’-gcacattg cgctatcggg ttcattcccgatggcacgtc tggctgaggg tcgaattacg gtgaactgtc ttcacggttt ttctggactg tgaagcattcggcaagcaa-3’，以此特异性片段为阳性基因片段构建阳性质粒，鉴定阳性质粒的序列与GenBank公布的简单异尖线虫(JN005757.1)内转录间隔区(ITS)基因序列中该片段的顺序一致、PCR产物长度、以及基因位置完全一致。构建的阳性质粒可在E.Coli Competent Cell JM109中增殖并提取。所构建的阳性质粒DNA浓度为220ng/μl，换算成拷贝数为3.6×1011/μl，是为定量标准品。以定量标准品或将定量标准品稀释至系列化工作浓度的标准样本备用。
二、引物与TaqMan探针的设计与人工合成：根据GenBank上登录的简单异尖线虫细胞核糖体DNA的内转录间隔区(ITS)全基因序列(JN005757.1)中523～629位的基因片段，预期扩增产物长度107bp，上游引物为5’-gca cat tgcgct atc ggg ttc att-3’，在ITS基因上位于523～546；下游引物为5’-ttg ctt gcc gaatgc ttc aca gtc-3’，在ITS基因上位于629～605；荧光标记的TaqMan探针为5’- (FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’，在；ITS基因上位于561～586。
三、提取样品总DNA：取0.5克-5克可能含简单异尖线虫的海产品样品或未经鉴定的线虫一条，在-20℃预冷的研钵中研成匀浆，用TaKaRa生物工程有限公司生产的寄生虫基因组DNA提取试剂盒(DV811A)，DNA提取按DNA抽提试剂盒说明操作。
四、荧光定量PCR反应和扩增及荧光定量测定：(a)PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq 10μl、无菌双蒸水6.8μl，10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、5μM TaqMan探针0.4μl、模板2.0μl，反应总体积20μl。Premix ExTaq由TaKaRa生物有限公司出品，模板即为阳性模板或目标模板。(b)PCR扩增温度循环条件：预变性95℃30s、变性95℃5s、退火延伸60℃30s为一个循环，共进行40个循环；温度变化速率选择20℃/s；(c)荧光定量测定：荧光定量PCR仪选用瑞士罗氏公司的Light Cycler II，在60℃收集荧光信号，收集方式设为单点收集(SINGLE)；仪器检测通道选择“F1”。也可选用其他公司其他型号的荧光定量PCR仪，在60℃时测定收集荧光信号。
五、荧光定量PCR标准曲线的建立：把包含简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中特异性片段的阳性质粒DNA以10倍系列稀释至工作浓度，取其中7个工作浓度，分别为3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl，3.6×10copies/μl，用荧光定量PCR测定各个工作浓度标准样本的Ct值，仪器自动绘制log[标准样本拷贝数浓度]vs循环阈值(即Ct值)的曲线如图1。经测定本方法的标准曲线的斜率(slope)约为-3.330；引物与反应条件的扩增效率(E值)计算：E＝10[-1/slope]-1＝0.99，理想值0.8＜E＜1.2，提示本方法引物设计良好、反应体系运行正常。标准曲线相关系数(r)＝-1，提示标准曲线线性良好，定量准确可靠。
六、荧光定量PCR的灵敏度检验：把包含简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列中特异性片段的阳性质粒DNA，调节其拷贝浓度为3.6×106copies/μl作为定量标准品，再以10倍系列稀释至工作浓度为阳性模板，阳性模板有7个工作浓度，分别为：3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl， 3.6×10copies/μl，用荧光定量PCR测定各个工作浓度样本从3.6×107copies/μl～3.6×10copies/μl的7个浓度均能见到标准S形扩增曲线，提示本方法的检测灵敏度不低于3.6×10copies/μl，见图2。
七、荧光定量PCR检测重复性检验：组内重复性测试，以5个不同浓度的标准品为模板，分别为：3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl。每个浓度测试3个平行样本，取测试结果的Ct值，测试结果如图3。经统计学计算得到标准偏差(SD)和变异系数(CV)，荧光定量PCR法检测简单异尖线虫的重复性很好，标准差(SD)分布在0.046～0.193，实验变异系数(CV)分布在0.212％～0.593％。
八、荧光定量PCR检测特异性检验：从本地菜场购买的带鱼、马鲛鱼、青占鱼、海鳗内脏捕捉海鱼异尖线虫100条，用线虫通用引物PCR检测结果均为海鱼异尖线虫，用简单异尖线虫荧光定量PCR检测结果有97条为简单异尖线虫，与简单异尖线虫的特异性普通PCR检测结果一致，随机抽取50份经简单异尖线虫荧光定量PCR鉴定为简单异尖线虫阳性的样本与典型异尖线虫、拟地新线虫、针蛔线虫、对盲囊线虫和宫脂线虫的特异性PCR鉴定均为阴性，提示用简单异尖线虫荧光定量PCR鉴定的简单异尖线虫与其他6种线虫的特异性PCR无交叉反应，具有较好的特异性。
九、荧光定量PCR检测海鱼肌肉中的简单异尖线虫：取海鱼肌肉0.5g、1g、2.5g、5g共4份，选中等大小简单异尖线虫4条(平均4.13ng±0.50mg)，每份海鱼肌肉加一条简单异尖线虫，在-20℃预冷的研钵中研成匀浆，每份取匀浆及上清液各一份提取DNA供荧光定量PCR检测，结果在4份海鱼肌肉样本中均能检出简单异尖线虫DNA，最低检出限为5克海鱼肌肉中含一条中等大小的简单异尖线虫。
十、海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测试剂盒，按本发明的检测原理制成，可在本发明方法中用于海产品中简单异尖线虫的检测。试剂盒由下列组分组成：2×荧光PCR反应预混液(2×Premix Ex Taq，Premix Ex Taq由TaKaRa生物有限公司出品)、无菌双蒸水、定量标准品、上游引物，下游引物和荧光标记的TaqMan探针。其中上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttcatt-3’；下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc aca gtc-3’；荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’。是试剂盒的必 备试剂，其余试剂可另外配备也可配置在试剂盒中，而定量标准品也可以稀释好的一系列拷贝数深度标准样本替换，所说一系列拷贝数深度通常按数量级逐级稀释，即以10倍系列稀释。
十一、海产品海产品中简单异尖线虫的荧光定量PCR定量检测，具体测定步骤如下：
(a)用定量标准品制备标准样本，即将定量标准品配制成浓度分别为3.6×107copies/μl，3.6×106copies/μl，3.6×105copies/μl，3.6×104copies/μl，3.6×103copies/μl，3.6×102copies/μl，3.6×10copies/μl共七个阳性模板，使用时至少取用前4个浓度。
(b)用DNA提取试剂盒从待测标本中提取总DNA制备待测样本，并配制成目标模板。
(c)取上述的各阳性模板2μl和目标模板2μl分别加入到各自的包含PCR反应体系的试管中，同步进行荧光定量PCR检测。
(d)用各阳性模板测定出的Ct值(循环阈值，横坐标)与对应的拷贝浓度对数值——log[阳性模板拷贝数浓度](纵坐标)作出标准曲线(如图1)，以待测样本测出的Ct值(循环阈值)从标准曲线中找出log[目标模板拷贝数浓度]值，求出其反对数，即为简单异尖线虫DNA拷贝数浓度。
从图1可知，Ct值(循环阈值)vs log[样本拷贝数浓度]的直线斜率为-3.330，截距为44.90，若循环阈值为Ct，样本中简单异尖线虫细胞核糖体DNA拷贝数浓度为X，那么根据标准曲线有下列关系：
Ct＝-3.330LogX+44.90
LogX＝(44.9-Ct)/3.33
X＝anti-Log[(44.9-Ct)/3.33]
若含有简单异尖线虫的样本测出的Ct值为25，则
LogX＝(44.90-25)/3.33＝6.0
X＝anti-Log6.0＝1×106copies/μl
即说明2μl目标模板中含2×106copies简单异尖线虫细胞内转录间隔区DNA。
Claims (9)
1.海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，具体测定步骤如下：
(a)用定量标准品制备标准样本，即将定量标准品以一定拷贝数浓度梯度规律制作为成系列工作浓度的标准样本；
(b)用DNA提取试剂盒从待测标本中提取总DNA作为待测样本；
(c)取(a)步所得各工作浓度标准样本为阳性模板和待测样本为目标模板分别加入到各自包含PCR反应体系的试管中，同步进行荧光定量PCR检测；
(d)对各工作浓度标准样本测定出的Ct值与浓度对数值，即log[阳性模板拷贝数浓度]作出标准曲线，将待测样品测出的Ct值从标准曲线中找出log[目标模板拷贝数浓度]值，求出其反对数，即为简单异尖线虫细胞核糖体DNA拷贝浓度；
其特征是：其中荧光定量PCR反应体系为2×Premix Ex Taq 10μl、无菌双蒸水6.8μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、5μM TaqMan探针0.4μl、模板2.0μl，反应总体积20μl，其中模板即为(c)步中加入的阳性模板或目标模板；所说上游引物、下游引物和定量标准品分别根据简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因不同片段设计合成；
所说PCR检测时，其荧光定量PCR反应的扩增条件是以预变性95℃30s；变性95℃5s、退火延伸60℃30s为一个循环，共进行40个循环；温度变化速率选择20℃/s；荧光信号收集在60℃收集；收集方式设为单点收集；仪器检测通道选择“F1”。
2.如权利要求1所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，其特征是：其中PCR反应体系中的上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttcatt-3’，在简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因序列上位于523～546。
3.如权利要求1所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，其特征是：其中PCR反应体系中的下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc acagtc-3’，在简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因序列上位于629～605。
4.如权利要求1所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，其特征是：其中PCR反应体系中的荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tggctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’，在简单异尖线虫细胞核糖体DNA内转录间隔区基因序列上位于561～586。
5.如权利要求1所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法，其特征是：所说定量标准品的来源阳性质粒是据GenBank公布的简单异尖线虫细胞内转录间隔区基因序列中TaqMan荧光定量PCR的扩增产物序列中523～629位共107个bp的特异性DNA片段人工合成并构建为阳性模板质粒，其核苷酸序列为：5’-gcacattg cgctatcggg ttcattcccg atggcacgtc tggctgagggtcgaattacg gtgaactgtc ttcacggttt ttctggactg tgaagcattc ggcaagcaa-3’，定量标准品的拷贝数浓度为3.6×1011/μl。
6.权利要求1所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法的试剂盒，其特征是：试剂盒由下列组分组成：上游引物、下游引物和荧光标记的TaqMan探针；其中上游引物为5’-gca cat tgc gct atc ggg ttc att-3’；下游引物为5’-ttg ctt gcc gaa tgc ttc aca gtc-3’；荧光标记的TaqMan探针为5’-(FAM)tgg ctg agg gtc gaa tta cgg tga a(TAMRA)-3’。
7.权利要求6所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法的试剂盒，其特征是：试剂盒还包括2×Premix Ex Taq，Premix Ex Taq由TaKaRa生物工程有限公司出品。
8.权利要求6所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法的试剂盒，其特征是：试剂盒还包括定量标准品或配制成拷贝数浓度系列的阳性模板。
9.权利要求6所述的海产品中简单异尖线虫的TaqMan PCR检测法的试剂盒，其特征是：试剂盒还包括无菌双蒸水。
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