CN101003830A - 快速计数水体中的大肠杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，用IrO2/Pd修饰电极作为流动注射—安培分析的电化学检测器，在大肠杆菌溶液中，加入诱导剂异丙基β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)、渗透剂多粘菌素B九肽(PBN)和溶菌酶(Lysozyme)，在培养条件下和在异丙基β－D－硫代半乳糖的诱导作用下，大肠杆菌溶液中的大肠杆菌的体内的β－D－半乳糖苷酶会从大肠杆菌的细胞体内释放出来，催化水解大肠杆菌溶液中的底物4－氨基酚β－D－吡喃半乳糖(PAPG)，产生4－氨基酚。由于大肠杆菌溶液中的大肠杆菌浓度与4－氨基酚的量成线性关系，通过快速测得4－氨基酚的量，实现对大肠杆菌浓度的快速检测，具有检测所需时间短、操作简单和检测的灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速计数水体中的大肠杆菌的方法，即一种快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，确切说，涉及一种用流动注射-IrO2/Pd修饰电极安培分析法快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，属水体的微生物学检验的技术领域。
背景技术
水体的微生物学检验，特别是肠道细菌浓度的检测在确保饮水安全和控制传染病等方面有着重要的意义。水源中大肠杆菌浓度是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标，因此，饮用水、地表水及污水中的大肠杆菌浓度是水质分析中常见的必测项目之一。
目前，对水体中大肠杆菌浓度一般采用传统的常规检测方法，如显微直接计数法、平板稀释法、MPN法、血球板计数法、浊度法等，这些方法也是国内外大多数检测机构使用的方法。但是这些方法存在着检测周期长、程序复杂、所需试剂多等缺点，很难满足快速检测大肠杆菌浓度的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是推出一种快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，确切说，推出一种用流动注射-IrO2/Pd修饰电极安培分析法快速检测水体中大肠杆菌浓度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。用IrO2/Pd修饰电极作为流动注射-安培分析的电化学检测器，在大肠杆菌溶液中，加入诱导剂异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、渗透剂多粘菌素B九肽(PBN)和溶菌酶(Lysozyme)，在培养条件下和在异丙基β-D-硫代半乳糖的诱导作用下，大肠杆菌溶液中的大肠杆菌的体内的β-D-半乳糖苷酶会从大肠杆菌的细胞体内释放出来，催化水解大肠杆菌溶液中的底物4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖(PAPG)，产生4-氨基酚。由于大肠杆菌溶液中的大肠杆菌浓度与4-氨基酚的量成线性关系，通过快速测得4-氨基酚的量，实现对大肠杆菌浓度的快速检测，4-氨基酚在IrO2/Pd修饰电极上被氧化，反应如下：
所以，在流动注射分析中，IrO2-Pd修饰电极对于其上的4-氨基酚的响应电流与大肠杆菌浓度也成线性关系。检测结果表明，大肠杆菌浓度在2.0×102～1.0×106cfu/mL范围内，响应电流与大肠杆菌浓度成很好的线性关系。大肠杆菌浓度的检测限为150cfu/mL。整个检测所需时间为3小时。
现详细说明本发明的技术方案。
一种快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步：IrO2-Pd修饰电极的制备
将玻碳电极用平均粒径为0.05μm的氧化铝粉末抛光，用二次蒸馏水冲洗，依次在丙酮、硝酸溶液、NaOH溶液和二次蒸馏水中超声清洗，硝酸溶液中，硝酸与水的体积比为1∶1，NaOH溶液中，NaOH与水的重量比为1∶1，以玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极，即SCE电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，采用CHI832型电化学系统对玻碳电极进行修饰，修饰液为IrCl3、PdCl2、Na2SO4和水的混合液，容量为50mL，在该修饰液中，IrCl3、PdCl2和Na2SO4的含量分别为0.005～0.015mmol、0.0025～0.01mmol和0.005～0.015mmol，余量为水，以0.05～0.15V/s的扫速在-0.3V～+0.9V的电压范围内循环扫描15～45圈，取出经修饰处理的玻碳电极，用二次蒸馏水清洗，得IrO2-Pd修饰电极，待用；
第二步：大肠杆菌的培养
将LB培养液分别注入多个培养瓶，每瓶的注入量为10mL，LB培养液为蛋白胨、氯化钠、酵母粉和水的混合液，蛋白胨∶氯化钠∶酵母粉∶水的重量比为1∶0.5∶0.5∶98，向所述的培养瓶分别加入不同已知数量的大肠杆菌，得多份不同已知浓度的大肠杆菌溶液，向每个培养瓶加入1.0～3.0mg的异丙基β-D-硫代半乳糖苷，30～45℃下振荡培养1～3小时，向每个培养瓶加入0.1mg的多粘菌素B九肽和0.25mg溶菌酶，20～40℃下振荡20～40分钟，再向每个培养瓶加入6.0～10.0mg的4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖，40～50℃下水浴培养15～40分钟，离心分离，得多份含4-氨基酚的上层清液，待用；
第三步：确定大肠杆菌浓度与IrO2-Pd修饰电极响应电流的依从关系
流动注射分析快速检测大肠杆菌浓度，以IrO2-Pd修饰电极、饱和甘汞电极和Ag/AgCl电极分别为工作电极、参比电极和辅助电极，流动相为pH6.0～8.0的磷酸缓冲溶液，其中10～30％的体积为甲醇，流速为0.6～1.0mL/min，待基线电流稳定后，将第二步获得的多份含4-氨基酚的上层清液逐一进样，记下每个进样时IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，将全部进样的每一个及其对应响应电流的电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标中的一个为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的另一个为大肠杆菌浓度，逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应电流-大肠杆菌浓度曲线，该曲线为一直线，确定大肠杆菌浓度与IrO2-Pd修饰电极响应电流的依从关系为线性关系；
第四步：大肠杆菌浓度的快速检测
利用第三步确立的响应电流-大肠杆菌浓度的线性关系，快速检测水体中的大肠杆菌浓度，操作步骤：1)量取待测水体样品10mL，过滤除去其中的悬浮固体杂质，离心沉淀其中的细菌；2)将离心得到的细菌用10mL上述的LB培养液稀释；3)按上述的第二步进行操作，得到一份由待测水体样品形成的含4-氨基酚的上层清液；4)用流动注射分析快速检测大肠杆菌浓度，流动注射分析的分析条件：电极、流动相、流速与第三步中的流动注射分析的分析条件完全相同，待基线电流稳定后，将所述的由待测水体样品形成的含4-氨基酚的上层清液进样，记下IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值；5)利用第三步得到的响应电流-大肠杆菌浓度曲线和4)步得到的电流值读出该电流值对应的大肠杆菌浓度，该大肠杆菌浓度就是待测水体的大肠杆菌浓度。
本发明的技术方案的进一步特征在于，第三步中，直角坐标的两个坐标中的横坐标为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的纵坐标为大肠杆菌浓度。
本发明的技术方案的进一步特征在于，第三步中，直角坐标的两个坐标中的纵坐标为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的横坐标为大肠杆菌浓度。
本发明的技术方案的进一步特征在于，第三步中，响应电流-大肠杆菌浓度曲线为一直线用于拟合表达响应电流与大肠杆菌浓度之间依从关系的公式，拟合得到的公式为I＝kn，其中，I为响应电流，单位为A，即安培，k为常数，n为大肠杆菌浓度，单位为cfu/mL，即大肠杆菌数/毫升。
本发明的检测方法与背景技术相比所具有的优点：
1、检测所需时间短，仅为3小时。
2、操作简单。
3、检测的灵敏度高，检测限达150cfu/mL，能够满足现代社会快速检测的需求，对于食品工业，公共卫生事业，临床诊断和环境监测方面的大肠杆菌的快速检测有着重要的意义。
具体实施方式
现通过实施例详细说明本发明的技术方案。所有的实施例均完全按照“发明内容”所述的具体操作步骤进行操作。因此，为避免重复，每个实施例仅罗列每个步骤的关键技术数据。
实施例1
第一步中，修饰液为IrCl3、PdCl2、Na2SO4和水的混合液，容量为50mL，在该修饰液中，IrCl3、PdCl2和Na2SO4的含量分别为0.005mmol、0.0025mmol和0.005mmol，余量为水，扫速为以0.05V/s，循环扫描45圈。第二步中，向每个培养瓶加入1.0mg的异丙基β-D-硫代半乳糖苷，45℃下振荡培养3小时，向每个培养瓶加入0.1mg的多粘菌素B九肽和0.25mg溶菌酶，40℃下振荡40分钟，再向每个培养瓶加入6.0mg的4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖，50℃下水浴培养40分钟。第三步中，磷酸缓冲溶液的pH值为6.0，甲醇的含量为10％，流速为0.6mL/min，检测不同已知浓度的大肠杆菌溶液所得的结果示于表一，在拟合的公式中，k＝4×10-11。第四步中，快速检测到待测水体样品中的大肠杆菌浓度。
表一响应电流与大肠杆菌浓度之间的依从关系
| 大肠杆菌浓度n/(cfu-mL-1) | I/A | 线性关系 |
| 2.0×1021.5×1034.0×1031.5×1043.0×1046.0×1042.0×105 | 5.00×10-94.05×10-89.51×10-87.52×10-78.20×10-71.75×10-67.32×10-6 | I＝4×10-11n |
实施例2
第一步中，修饰液为IrCl3、PdCl2、Na2SO4和水的混合液，容量为50mL，在该修饰液中，IrCl3、PdCl2和Na2SO4的含量分别为0.01mmol、0.005mmol和0.01mmol，余量为水，扫速为以0.1V/s，循环扫描30圈；第二步中，向每个培养瓶加入2.0mg的异丙基β-D-硫代半乳糖苷，37℃下振荡培养2小时，向每个培养瓶加入0.1mg的多粘菌素B九肽和0.25mg溶菌酶，30℃下振荡30分钟，再向每个培养瓶加入8.0mg的4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖，44.5℃下水浴培养25分钟；第三步中，磷酸缓冲溶液的pH值为7.0，甲醇的含量为20％，流速为0.8mL/min，检测不同已知浓度的大肠杆菌溶液所得的结果示于表二，在拟合的公式中，k＝5×10-11。第四步中，快速检测到待测水体样品中的大肠杆菌浓度。
表二响应电流与大肠杆菌浓度之间的依从关系
| 大肠杆菌浓度n/(cfu·mL-1) | I/A | 线性关系 |
| 2.0×1021.5×1034.0×1031.5×1043.0×1046.0×1042.0×105 | 1.01×10-89.05×10-82.20×10-74.97×10-71.72×10-63.60×10-61.02×10-5 | I＝5×10-11n |
实施例3
第一步中，修饰液为IrCl3、PdCl2、Na2SO4和水的混合液，容量为50mL，在该修饰液中，IrCl3、PdCl2和Na2SO4的含量分别为0.015mmol、0.01mmol和0.015mmol，余量为水，扫速为以0.15V/s，循环扫描15圈；第二步中，向每个培养瓶加入3.0mg的异丙基β-D-硫代半乳糖苷，30℃下振荡培养1小时，向每个培养瓶加入0.1mg的多粘菌素B九肽和0.25mg溶菌酶，20℃下振荡20分钟，再向每个培养瓶加入10.0mg的4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖，40℃下水浴培养15分钟；第三步中，磷酸缓冲溶液的pH值为8.0，甲醇的含量为30％，流速为1.0mL/min，检测不同已知浓度的大肠杆菌溶液所得的结果示于表三，在拟合的公式中，k＝4×10-11。第四步中，快速检测到待测水体样品中的大肠杆菌浓度。
表三响应电流与大肠杆菌浓度之间的依从关系
| 大肠杆菌浓度n/(cfu·mL-1) | I/A | 线性关系 |
| 2.0×1021.5×1034.0×1031.5×1043.0×1046.0×1042.0×105 | 9.65×10-96.50×10-82.00×10-14.02×10-71.19×10-63.01×10-68.02×10-6 | I＝4×10-11n |
本发明的方法能满足现代社会快速检测的需求，特别适于食品工业，公共卫生事业，临床诊断和环境监测等领域用来快速检测水体中的大肠杆菌浓度。
Claims (5)
1、一种快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步：IrO2-Pd修饰电极的制备
将玻碳电极用平均粒径为0.05μm的氧化铝粉末抛光，用二次蒸馏水冲洗，依次在丙酮、硝酸溶液、NaOH溶液和二次蒸馏水中超声清洗，硝酸溶液中，硝酸与水的体积比为1∶1，NaOH溶液中，NaOH与水的重量比为1∶1，以玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极，即SCE电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，采用CHI832型电化学系统对玻碳电极进行修饰，修饰液为IrCl3、PdCl2、Na2SO4和水的混合液，容量为50mL，在该修饰液中，IrCl3、PdCl2和Na2SO4的含量分别为0.005～0.015mmol、0.0025～0.01mmol和0.005～0.015mmol，余量为水，以0.05～0.15V/s的扫速在-0.3V～+0.9V的电压范围内循环扫描15～45圈，取出经修饰处理的玻碳电极，用二次蒸馏水清洗，得IrO2-Pd修饰电极，待用；
第二步：大肠杆菌的培养
将LB培养液分别注入多个培养瓶，每瓶的注入量为10mL，LB培养液为蛋白胨、氯化钠、酵母粉和水的混合液，蛋白胨∶氯化钠∶酵母粉∶水的重量比为1∶0.5∶0.5∶98，向所述的培养瓶分别加入不同已知数量的大肠杆菌，得多份不同已知浓度的大肠杆菌溶液，向每个培养瓶加入1.0～3.0mg的异丙基β-D-硫代半乳糖苷，30～45℃下振荡培养1～3小时，向每个培养瓶加入0.1mg的多粘菌素B九肽和0.25mg溶菌酶，20～40℃下振荡20～40分钟，再向每个培养瓶加入6.0～10.0mg的4-氨基酚β-D-吡喃半乳糖，40～50℃下水浴培养15～40分钟，离心分离，得多份含4-氨基酚的上层清液，待用；
第三步：确定大肠杆菌浓度与IrO2-Pd修饰电极响应电流的依从关系
流动注射分析快速检测大肠杆菌浓度，以IrO2-Pd修饰电极、饱和甘汞电极和Ag/AgCl电极分别为工作电极、参比电极和辅助电极，流动相为pH6.0～8.0的磷酸缓冲溶液，其中10～30％的体积为甲醇，流速为0.6～1.0mL/min，待基线电流稳定后，将第二步获得的多份含4-氨基酚的上层清液逐一进样，记下每个进样时IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，将全部进样的每一个及其对应响应电流的电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标中的一个为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的另一个为大肠杆菌浓度，逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应电流-大肠杆菌浓度曲线，该曲线为一直线，确定大肠杆菌浓度与IrO2-Pd修饰电极响应电流的依从关系为线性关系；
第四步：大肠杆菌浓度的快速检测
利用第三步确立的响应电流-大肠杆菌浓度的线性关系，快速检测水体中的大肠杆菌浓度，操作步骤：1)量取待测水体样品10mL，过滤除去其中的悬浮固体杂质，离心沉淀其中的细菌；2)将离心得到的细菌用10mL上述的LB培养液稀释；3)按上述的第二步进行操作，得到一份由待测水体样品形成的含4-氨基酚的上层清液；4)用流动注射分析快速检测大肠杆菌浓度，流动注射分析的分析条件：电极、流动相、流速与第三步中的流动注射分析的分析条件完全相同，待基线电流稳定后，将所述的由待测水体样品形成的含4-氨基酚的上层清液进样，记下IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值；5)利用第三步得到的响应电流-大肠杆菌浓度曲线和4)步得到的电流值读出该电流值对应的大肠杆菌浓度，该大肠杆菌浓度就是待测水体的大肠杆菌浓度。
2、根据权利要求1所述的快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，第三步中，直角坐标的两个坐标中的横坐标为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的纵坐标为大肠杆菌浓度。
3、根据权利要求1所述的快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，第三步中，直角坐标的两个坐标中的纵坐标为IrO2-Pd修饰电极的响应电流的电流值，直角坐标的两个坐标中的横坐标为大肠杆菌浓度。
4、根据权利要求1或2所述的快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，响应电流-大肠杆菌浓度曲线为一直线用于拟合表达响应电流与大肠杆菌浓度之间依从关系的公式，拟合得到的公式为I＝kn，其中，I为响应电流，单位为A，即安培，k为常数，n为大肠杆菌浓度，单位为cfu/mL，即大肠杆菌数/毫升。
5、根据权利要求1或3所述的快速检测水体中的大肠杆菌浓度的方法，其特征在于，响应电流-大肠杆菌浓度曲线为一直线用于拟合表达响应电流与大肠杆菌浓度之间依从关系的公式，拟合得到的公式为I＝kn，其中，I为响应电流，单位为A，即安培，k为常数，n为大肠杆菌浓度，单位为cfu/mL，即大肠杆菌数/毫升。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101201 Termination date: 20121231 |