CN106518956A - 一种去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，包括以下步骤：1)将核酸酶连接到磁性微球表面，形成磁性微球‑核酸酶复合物；2)向所述蛋白质体系中加入磁性微球‑核酸酶复合物，去除蛋白质体系中的残留核酸；3)通过外加磁场的作用，将磁性微球‑核酸酶复合物从蛋白溶液中完全去除。采用本发明方法，可以去除蛋白纯化体系中残留的核酸污染，同时，通过磁吸的物理方法去除酶，不带来二次污染，相比较传统的化学方法去除酶，本发明既能确保酶的完全去除，同时可以确保蛋白的活性不受影响。
Description
技术领域
本发明属于生化领域，具体属于一种去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法。
背景技术
酶是分子生物学研究中非常重要的工具，酶的克隆、表达、纯化方法已经得到广泛研究，然而如何去除酶中携带的DNA污染，仍是酶纯化中的一大难点。一些购买的酶在使用中常会发现存在DNA污染，对于一些用于PCR反应的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，其携带的微量DNA在PCR反应中也会作为模板扩增，从而影响实验结果的准确性，给实验带来误导。
目前，已有用于去除DNA污染的方法有蛋白纯化柱法、双水相法、PEI沉淀法、辐射法及核酸酶处理法等。然而这些处理方法都有其不可避免的缺陷。
使用蛋白纯化柱纯化蛋白，虽然可以去除一些DNA污染，然而其去除效果较差，另外，由于洗脱体积大，酶被稀释，酶的比活力下降。双水相法操作繁琐，不仅需要对酶各方面的物理、化学性质有熟悉的了解，而且操作过程也需要高速离心和透析，费时费力。辐射法去DNA主要有UV辐射和γ射线辐射法，然而UV和γ射线虽然能破坏DNA的结构，但同时也会影响酶的活性。使用核酸酶处理可以有效的去除酶中的外源DNA，且不影响酶的活性。此外在去除RNA中DNA污染时，也常用核酸酶处理，再通过加入核酸酶抑制剂或苯氯仿抽提的方法使核酸酶失活，然而苯氯仿抽提不仅可以破坏核酸酶的结构，也会使纯化所得的酶样品失活。加入EDTA等金属离子螯合剂虽然可以使核酸酶暂时失活，但是当反应体系中再加入这些金属离子的时候，核酸酶的活性依然可以恢复，且EDTA的加入还有可能会影响目的酶的活性。如何去除残留的核酸酶而不影响目的蛋白的活性，仍是有待解决的难点。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种去除蛋白纯化体中核酸污染的方法，可以在实现去除污染的同时，不引入核酸酶成为二次污染，并能良好地保持目的蛋白的活性。
为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将核酸酶连接到磁性微球表面，形成磁性微球-核酸酶复合物；
2)向所述蛋白质体系中加入磁性微球-核酸酶复合物，利用核酸酶去除蛋白质体系中的残留核酸；
3)通过外加磁场的作用，将磁性微球-核酸酶复合物从蛋白溶液中完全去除。
步骤1)所述的磁性微球表面修饰有化学基团，所述化学基团是NHS基团、链霉亲合素。
步骤1)中所述核酸酶为限制性内切酶、脱氧核糖核酸酶I。
步骤1)中，所述核酸酶通过化学基团与磁性微球链接，形成磁性微球-核酸酶复合物。
核酸酶通过磁吸的方法完全去除，实现去除核酸污染的同时不引入新的污染源。
采用本发明方法，可以去除蛋白纯化体系中残留的核酸污染，同时，通过磁吸的物理方法去除酶，不带来二次污染，相比较传统的化学方法去除酶，一方面确保酶可以完全去除，同时可以确保不影响蛋白的活性。因此，本发明克服了传统蛋白纯化中核酸酶带来的二次污染和蛋白活性损失的技术瓶颈。
附图说明
图1是BeaverBeadsTM消化λDNA后电泳图。
图2是BeaverBeadsTM消化λDNA后QPCR扩增曲线。
具体实施方式
为了便于对本发明的理解，下面将结合附图对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
8.1将脱氧核糖核酸酶I(即DNase I)通过NHS基团链接到磁性微球表面：
取1000μLMag NHS磁性微球(10mg/mL)至1.5mL EP管中，加入1000μL预冷的Washing Buffer A，漩涡30s，磁吸去上清液。加入250μL DNase I溶液(用Coupling Buffer稀释成5mg/mL)，涡旋30s；25℃条件下垂直混合2h。如有必要，25℃条件下垂直混合1h后，4℃孵育过夜；
磁吸去除上清液，加入1000μL Blocking Buffer，涡旋30s，磁吸去除上清液，重复该步骤5次。加入1000μL Blocking Buffer，25℃条件下垂直混合2h；
磁吸去除上清液，加入1000μL Washing Buffer B，漩涡60s，磁吸去除上清液，重复该步骤5次。加入1000μL Strorage Buffer，混匀磁性微球后，得到磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free，置于-20℃保存。
8.2磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free对λDNA消化能力的评价：
取100μL磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free至1.5mL EP管中，磁吸去除上清液。加入1000μL Enzyme Reaction Buffer，涡旋30s，磁吸去除上清液，重复该步骤5次。最后加入35μL Enzyme Reaction Buffer，标注为1号。
重复上述操作，分别标注：2号、3号、4号。
取0.5μL DNase I溶液(5mg/mL)，加入34.5μL Enzyme Reaction Buffer，标注为5号。
直接加入35μL Enzyme Reaction Buffer，标注为6号。
分别向1号～6号加入15μLλDNA(0.4μg/μL)，涡旋30s，置于37℃水浴反应。1号、2号、3号分别反应5min、10min、20min，4号、5号、6号全部反应30min。1号～4号每隔5min漩涡混匀1次。每次将反应结束后将EP管12000rpm离心2min，取上清液，为下一步琼脂糖电泳及q-PCR备用。
8.3琼脂糖电泳操作流程及结果显示：
1)电泳结果
结果见图1。BeaverBeadsTM：表示在λDNA酶反应液中加入磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free，5min、10min、20min、30min四个时间段后的上清；30(+)：表示在λDNA酶反应液中加入DNase I，30min后的上清；30(-)：表示在λDNA酶反应液中未加入DNaseI，30min后的上清。
图1表明，磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTMDNA Free较好地保持了核酸酶DNase I的活性，在37℃条件下，30分钟内可完全消化体系中的DNA。与磁性微球的结合并未影响到核酸酶DNase I的活力。
8.4 q-PCR操作流程及结果显示
将8.3的4号、5号、6号样品分别进行q-PCR扩增，q-PCR扩增曲线见图2。
q-PCR扩增结果显示，4号样品的λDNA体系中无可做模板的残留DNA存在，说明磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free较好地保持了核酸酶DNase I的活性，在37℃条件下，30分钟内可完全消化体系中的DNA。
8.5加磁去除磁性微球-核酸酶复合物
通过外加磁场作用，将磁性微球-核酸酶复合物BeaverBeadsTM DNA Free从体系中去除，磁性微球Mag NHS和核酸酶DNase I均可回收再利用。
采用本发明方法，可以去除蛋白纯化体系中残留的核酸污染，同时，通过磁吸的物理方法去除酶，不带来二次污染，相比较传统的化学方法去除酶，本发明既能确保酶的完全去除，同时可以确保蛋白的活性不受影响，克服了传统蛋白纯化中核酸酶带来的二次污染和蛋白活性损失的技术瓶颈。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。
Claims (4)
1.一种去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将核酸酶连接到磁性微球表面，形成磁性微球-核酸酶复合物；
2)向所述蛋白质体系中加入磁性微球-核酸酶复合物，去除蛋白质体系中的残留核酸；
3)通过外加磁场的作用，将磁性微球-核酸酶复合物从蛋白溶液中完全去除。
2.如权利要求1所述的去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，其特征在于，步骤1)所述的磁性微球表面修饰有化学基团，所述化学基团是NHS基团、链霉亲合素。
3.如权利要求1所述的去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，其特征在于，步骤1)所述的核酸酶为限制性内切酶、脱氧核糖核酸酶I。
4.如权利要求1所述的去除蛋白质纯化体系中核酸污染的方法，其特征在于，步骤1)中，所述核酸酶通过化学基团与磁性微球链接，形成磁性微球-核酸酶复合物。
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