CN116359186A - 一种用于检测nse的适配体传感器及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测领域，涉及适配体筛选和适配体传感器构建，特别是指一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法。本申请中的高亲和力NSE适配体其Kd值为3.75 nM，对NSE具有非常高的亲和力，对NSE的检测限为2.6 nM，比以往报道的亲代适配体的检测限提高了6倍，且对NSE具有高特异性。利用该高亲和力适配体构建适配体传感器，为NSE的简单、快速、高灵敏检测提供了新方法，这对于体液中含量极微的其他靶标分子的灵敏检测具有重大的指导意义。本发明中高亲和力适配体的筛选方法对于医疗诊断、药物递送、食品质检、化工监测等领域中适配体的应用也具有强大的推进作用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及适配体传感器，特别是指一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法。
背景技术
神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）作为糖代谢过程的特异性关键酶之一，广泛分布于神经元和周围神经内分泌细胞中。临床医学研究表明，NSE蛋白水平在血清及脑脊液中的动态改变与神经系统疾病的严重程度、临床治疗及预后判断具有密切关系。在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤，NSE 可以作为小细胞肺癌（SCLC）和神经母细胞瘤的肿瘤标志物，尤其是SCLC最敏感最特异的肿瘤标志物，与其临床分期呈正相关，被广泛应用于高危人群SCLC的筛查和诊断。
神经元特异性烯醇化酶被广泛认为是SCLC早期诊断和后续治疗的特异性预测因子。在正常人血清中NSE水平为5-12ng/mL，＞24ng/mL即可诊断为SCLC。截至目前，已有许多方法应用于NSE的检测，包括荧光免疫分析、放射免疫分析、质谱免疫分析、电泳、电化学检测、表面增强拉曼检测等，但上述方法仍在成本、时间和操作上存在些许不足。故寻找一种简便、快速和经济的检测方法至关重要。目前，检测SCLC的方法主要包括胸部X线、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)。然而，这些方法通常不仅需要专门的大型仪器、专业的操作人员、高费用和长时间的诊断报告，而且还需要可检测的肿瘤直径大小≥10mm。这限制了在初级医疗机构和发展中国家对SCLC的早期诊断。因此，需要寻找一种快速、简便和经济的方法辅助诊断肺癌，提高肺癌的确诊率。
核酸适配体是指可与靶标分子特异性结合的单链寡核苷酸链分子，即DNA或RNA，长度一般为25-60个核苷酸，常被开发为生物传感器，用于快速、高灵敏的靶标分子检测。由于DNA相比于RNA的稳定性更好，应用更广泛。而且，与抗体相比，核酸适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但作用的靶分子范围更广，甚至能够识别单抗不能区分的相似物质，比抗体具有更高的特异性和亲和力。因其结构和性能的独特优越性，核酸适配体日益广泛地应用于生物医学基础研究、疾病诊治和药物研发。
但是，关于核酸适配体的筛选还面临很多问题：
传统的适配体筛选方法为指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX)技术,主要包括单链随机序列核酸库的合成、随机序列核酸库与靶标的孵育结合、适配体一靶标复合物的分离、适配体从靶标上的洗脱、适配体的PCR扩增、利用PCR产物制备新的适配体库、用新适配体库重复上述步骤。一般需要20左右轮的筛选，最终通过核酸测序结合试验验证才能获得具有亲和力的核酸适配体，筛选过程比较复杂、劳动强度大、筛选成本高、耗时长，而且试验过程涉及到的有机试剂和危化品会对人体构成一定的危害。虽然SELEX技术已经做了很多方面的改良，但是这些问题依然没有得到解决。
目前已经有学者通过SELEX技术筛选到NSE的核酸适配体【参考文献In vitroselection of DNA aptamers for the development of chemiluminescence aptasensorfor neuron-specific enolase (NSE)detection. DOI: 10.1039/c9ra00785g】，但是亲和力还不够高，导致检测灵敏度不够高。基于计算机辅助提高核酸适配体亲和力的筛选方法，我们成功筛选到对NSE具有高亲和力的核酸适配体。专利CN 114594258 A公开了用于小细胞肺癌NSE检测的电化学适体传感器的制备方法及应用，公开了一种电化学传感器，利用生物捕获适体探针结合电化学方法对NSE进行检测，该方法通过电化学方法提高适体探针的灵敏度，但是电化学方法的操作流程复杂，采用的检测体系制备繁琐；而本课题组一直致力于如何提高常规适配体的亲和力，亟待研究一种对NSE具有高亲和的适配体。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
高亲和力NSE适配体的获得：
（1）将已通过SELEX技术筛选到的三条NSE适配体（40nt）作为亲代适配体序列，输入计算机碱基突变程序，并生成新的DNA序列库。
（2）利用Mfold 网络服务器 (http://unafold.rna.albany.edu) 对适配体序列库中的每一个DNA序列进行二级结构的预测，折叠温度设为37℃，离子浓度设为150 mM Na+，其他设置选择默认状态，执行折叠后选择自由能最低的结构，并保存其Vienna输出格式；
（3）将上个步骤中得到的Vienna格式输入到RNA Composer 服务器(http://rnacomposer.ibch.poznan.pl/Home)中，并将序列中的T修改为U，模拟得到其对应单链RNA的三维结构，输出PDB文件；
（4）在Molecular Operating Environment 软件中进行核糖核苷酸到脱氧核糖核苷酸的转化，执行单链RNA到单链DNA三维结构的转换，并进行能量最小化，保存优化后的单链DNA三维结构的PDB文件；
（5）查询蛋白质结构数据库RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）中NSE的蛋白晶体结构，最终，选择并下载分辨率为1.36Å 的NSE蛋白晶体结构（编码：2AKZ）作为受体；
（6）以NSE蛋白晶体结构作为受体，单链DNA的三维结构作为配体，在ZDOCK服务器(http://zdock.umassmed.edu) 中输入两者的PDB格式，进行分子对接。
（7）选择对接结果中打分值最高的五条序列，再进行新一轮的碱基突变，并再次构建DNA序列库，并再次执行第2步骤、第3步骤、第4步骤和第6步骤；
（8）重复执行第7步骤，循环反复多次；
（9）计算每一个对接结果中函数打分值排列前十的平均值和SD值，进行显著性差异分析（如图3所示）；
（10）最后，比较ZDOCK打分值显著高于亲代适配体的DNA序列的折叠结构和最低自由能，选择折叠结构相似且自由能相对较低的几条序列（见表1）在生工生物工程有限公司进行合成。
（11）利用BLI技术测试选择的序列与靶蛋白NSE之间的亲和力，选择SA探针为试验探针，该探针表面包被了链霉亲和素，可以捕获生物素修饰的DNA序列。DNA序列的试验浓度为500 nM，靶蛋白NSE的试验浓度分别为0 nM（空白对照）、6.4 nM、12.8 nM、25.6 nM、64nM、128 nM。试验过程包括固化、基线、结合、解离四个步骤，时间分别为300 s、100 s、120s、120 s。计算得到相应浓度信号响应值的倒数(1/Req)与NSE浓度的倒数（1/CNSE）呈现非常好的线性关系，即，1/Req=19.026×1/CNSE+5.075 (R2= 0.985) （图4）。
（12）结果：基于计算机辅助的筛选方法，最终得到一条对NSE具有高亲和力的核酸适配体序列，即Apt-55C8G序列如SEQ ID No.1所示，解离常数（Kd值）为3.75nM，相比于亲代适配体Apt-P如SEQ ID No.5所示，亲和力（Kd值：24.02nM）提高了一个数量级。该适配体与NSE的分子对接模型见图5。除此之外，另外两条适配体的亲和力也显著高于亲代适配体（Apt-54G10T序列如SEQ ID No.3所示，其Kd值：15.70nM，Apt-54A29C序列如SEQ ID No.4所示，其Kd值：9.17nM），
用于检测NSE的适配体传感器，包括高亲和力适配体、荧光分子信标和缓冲溶液。
上述高亲和力适配体的Kd值为3.75 nM。
上述高亲和力适配体的序列如SEQ ID No.1所示。
上述荧光分子信标与高亲和力适配体部分互补。
上述荧光分子信标序列如SEQ ID No.2所示，其5’端设有6-FAM基团，3’端设有淬灭基团BHQ1。
上述换成溶液为NaCl的磷酸盐缓冲液。
上述的适配体传感器的使用方法，步骤为：
①配置试剂：分别配置0.2 μΜ的MB和0.3 μΜ的Apt-55C8G溶于含150 mM NaCl的磷酸盐缓冲液中。
②制备检测试剂：分别取100 μL MB溶液和100 μL Apt-55C8G溶液置于同一个反应管中（摩尔浓度比：1:1.5），混合均匀，将混合液置于95℃水浴加热10min，之后缓慢冷却至室温后再反应30 min，使两条DNA序列充分杂交。
③检测靶蛋白NSE：取步骤2中制备的混合溶液，加入50 μL待测样本，混合均匀并反应1 h后进行荧光检测。荧光实验的激发波长为495 nm，发射波长为517 nm，荧光光谱的测定波长为510nm-670 nm。荧光信号的衰减效率的计算公式为：(F0-F)/F0× 100%（其中，F0和F分别为不加NSE和加NSE反应后测得的荧光信号强度）。在2 nM到80 nM范围内，荧光信号的衰减效率与NSE浓度呈现很好的线性关系，即，Y=2.223+0.359 CNSE(R2=0.985)（图7）。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明中的适配体筛选方法相比于单纯地利用SELEX技术进行核酸适配体的筛选，实验次数大大少，工作强度显著降低，操作安全性得到提高，节约了时间成本和实验成本，能更加高效快速地进行核酸适配体的筛选，显著提高核酸适配体亲和力，极大地提高了适配体筛选的准确度和成功率。本发明对于构建适配体靶向的生物传感器或者探针，用于体外快速、高灵敏的靶标分子检测以及体内靶向成像或治疗具有重大意义，能够满足日益增长的科研需求，对于医疗诊断、药物递送、食品质检、化工监测等领域的应用也具有强大的推进作用。
2、本发明中获得的高亲和力适配体其Kd值为3.75 nM，对NSE具有非常高的亲和力。用高亲和力适配体构建的适配体传感器对NSE的检测限为2.6 nM，比以往报道的的亲代适配体的检测限提高了6倍，显著提高了适配体传感器的检测灵敏度，并且对NSE具有高特异性。该方法简单易操作，为NSE的灵敏检测提供了新策略和新方法。本发明中适配体传感器的建立对于在血清、尿液、泪液或脑脊液等体液中含量极微的疾病标志物的灵敏检测具有重要的指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于计算机辅助提高核酸适配体亲和力筛选方法的流程图。
图2为基于计算机碱基突变程序生成新的序列库的执行流程图。
图3为NES蛋白与适配体序列（Apt-P、Apt-55C8G、Apt-54G10T、Apt-54A29C）的ZDOCK打分的显著性差异分析。
图4为基于BLI技术测得的Apt-55C8G与不同浓度NSE的时间结合曲线。插图为NSE的浓度倒数（1/CNSE）与NSE浓度响应值倒数(1/Req)的线性关系。
图5为靶蛋白NSE（绿色标记）与适配体Apt-55C8G（橘色标记）的ZDOCK分子对接模型。
图6为荧光实验的实验原理图。
图7为适配体Apt-55C8G对NSE的荧光检测图谱。插图为荧光信号的衰减效率(F0-F)/F0×100%与NSE浓度CNSE的线性关系。
图8为适配体Apt-P对NSE的荧光检测图谱。插图为荧光信号的衰减效率(F0-F)/F0×100%与NSE浓度CNSE的线性关系。
图9为适配体Apt-55C8G的检测特异性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
高亲和力NSE适配体的获得：
（1）将已通过SELEX技术筛选到的三条NSE适配体（40nt）作为亲代适配体序列，输入计算机碱基突变程序，并生成新的DNA序列库。
（2）利用Mfold 网络服务器 (http://unafold.rna.albany.edu) 对适配体序列库中的每一个DNA序列进行二级结构的预测，折叠温度设为37℃，离子浓度设为150 mM Na+，其他设置选择默认状态，执行折叠后选择自由能最低的结构，并保存其Vienna输出格式；
（3）将上个步骤中得到的Vienna格式输入到RNA Composer 服务器(http://rnacomposer.ibch.poznan.pl/Home)中，并将序列中的T修改为U，模拟得到其对应单链RNA的三维结构，输出PDB文件；
（4）在Molecular Operating Environment 软件中进行核糖核苷酸到脱氧核糖核苷酸的转化，执行单链RNA到单链DNA三维结构的转换，并进行能量最小化，保存优化后的单链DNA三维结构的PDB文件；
（5）查询蛋白质结构数据库RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）中NSE的蛋白晶体结构，最终，选择并下载分辨率为1.36Å 的NSE蛋白晶体结构（编码：2AKZ）作为受体；
（6）以NSE蛋白晶体结构作为受体，单链DNA的三维结构作为配体，在ZDOCK服务器(http://zdock.umassmed.edu) 中输入两者的PDB格式，进行分子对接。
（7）选择对接结果中打分值最高的五条序列，再进行新一轮的碱基突变，并再次构建DNA序列库，并再次执行第2步骤、第3步骤、第4步骤和第6步骤；
（8）重复执行第7步骤，循环反复多次；
（9）计算每一个对接结果中函数打分值排列前十的平均值和SD值，进行显著性差异分析（如图3所示）；
（10）最后，比较ZDOCK打分值显著高于亲代适配体的DNA序列的折叠结构和最低自由能，选择折叠结构相似且自由能相对较低的几条序列（见表1）在生工生物工程有限公司进行合成。
（11）利用BLI技术测试选择的序列与靶蛋白NSE之间的亲和力，选择SA探针为试验探针，该探针表面包被了链霉亲和素，可以捕获生物素修饰的DNA序列。DNA序列的试验浓度为500 nM，靶蛋白NSE的试验浓度分别为0 nM（空白对照）、6.4 nM、12.8 nM、25.6 nM、64nM、128 nM。试验过程包括固化、基线、结合、解离四个步骤，时间分别为300 s、100 s、120s、120 s。计算得到相应浓度信号响应值的倒数(1/Req)与NSE浓度的倒数（1/CNSE）呈现非常好的线性关系，即， 1/Req=19.026×1/CNSE+5.075 (R2= 0.985) （图4）。
（12）结果：基于计算机辅助的筛选方法，最终得到一条对NSE具有高亲和力的核酸适配体序列，即Apt-55C8G序列如SEQ ID No.1所示，解离常数（Kd值）为3.75nM，相比于亲代适配体Apt-P如SEQ ID No.5所示，亲和力（Kd值：24.02nM）提高了一个数量级。该适配体与NSE的分子对接模型见图5。除此之外，另外两条适配体的亲和力也显著高于亲代适配体（Apt-54G10T序列如SEQ ID No.3所示，其Kd值：15.70nM，Apt-54A29C序列如SEQ ID No.4所示，其Kd值：9.17nM），
各适配体的序列表见表1
表1 本发明所涉及到的合成序列，以及模拟和实验参数
适配体的应用及实验验证：
首先，我们设计了一个与适配体Apt-55C8G部分碱基互补的荧光分子信标（MB序列如SEQ ID No.2所示，其5’端设有6-FAM基团，3’端设有BHQ1基团： 5’-3’：6-FAM-GCGCGGCGTT ATT AAT GTA GGAGCGCGC-BHQ1），通过荧光实验验证该适配体的应用性能，探究该适配体对NSE的检测灵敏度及检测特异性。实验原理如图6所示：MB自身能形成稳定的发夹结构，淬灭基团BHQ1紧紧靠近荧光基团FAM，至使荧光淬灭。适配体Apt-55C8G存在时，可以与MB发生碱基互补配对形成Apt/MB复合物，打开发夹结构从而导致荧光信号的恢复，但是当加入NSE，由于靶分子与适配体的高亲和力，形成的双链结构会被重新打开，导致荧光信号的减弱。荧光信号的衰减效率与NSE的浓度呈正相关。
其详细实验步骤如下所示：
①配置试剂：分别配置0.2 μΜ的MB和0.3 μΜ的Apt-55C8G溶于含150 mM NaCl的磷酸盐缓冲液中。
②制备检测试剂：分别取100 μL MB溶液和100 μL Apt-55C8G溶液置于同一个反应管中（摩尔浓度比：1:1.5），混合均匀，将混合液置于95℃水浴加热10min，之后缓慢冷却至室温后再反应30 min，使两条DNA序列充分杂交。
③检测靶蛋白NSE：取步骤2中制备的混合溶液，加入50 μL待测样本，混合均匀并反应1 h后进行荧光检测。荧光实验的激发波长为495 nm，发射波长为517 nm，荧光光谱的测定波长为510nm-670 nm。荧光信号的衰减效率的计算公式为：(F0-F)/F0× 100%（其中，F0和F分别为不加NSE和加NSE反应后测得的荧光信号强度）。其中，待测样本分别为NSE浓度为0 nM（空白对照）、2 nM、20 nM、40 nM、60 nM、80 nM和100 nM的标准品，空白对照做11次重复，其余浓度分别做3次重复。在2 nM到80 nM范围内，荧光信号的衰减效率与NSE浓度呈现很好的线性关系，即，Y=2.223+0.359 CNSE(R2=0.985)（图7）。
④结果：根据检测灵敏度的计算公式，3s/k，即，空白对照响应值标准偏差的三倍除以标准曲线的斜率，计算得到对NSE的检测限为2.6 nM。
⑤检测限的对比实验：为了进一步证明我们筛选到的适配体Apt-55C8G相较于亲代适配体Apt-P具有跟高的检测灵敏度，我们利用相同的荧光实验测试了Apt-P对NSE的检测限。结果显示，在20 nM到80 nM范围内，荧光信号的衰减效率与NSE浓度呈现很好的线性关系，即，Y=8.222+0.172 CNSE(R2=0.966)（图8），根据3s/k计算得到对NSE的检测限为13.5nM。
特异性分析：为了验证本发明中筛选到的适配体Apt-55C8G的检测特异性，我们选择了CEA、HAS和IgG作为干扰分子，进行荧光实验的测试（图9），结果均显示较小的荧光信号衰减效率，证明了该适配体对NSE检测的高特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测NSE的适配体传感器，其特征在于：包括高亲和力适配体、荧光分子信标和缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测NSE的适配体传感器，其特征在于：所述高亲和力适配体的Kd值为3.75 nM。
3.根据权利要求2所述的用于检测NSE的适配体传感器，其特征在于：所述高亲和力适配体的序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测NSE的适配体传感器，其特征在于：所述荧光分子信标与高亲和力适配体部分互补，缓冲溶液为含NaCl的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的用于检测NSE的适配体传感器，其特征在于：所述荧光分子信标序列如SEQ ID No.2所示，其5’端设有6-FAM基团， 3’端设有淬灭基团BHQ1。
6.权利要求1-3、5任一项所述的适配体传感器的使用方法，其特征在于，步骤为：
（1）分别将高亲和力适配体和荧光分子信标溶于含NaCl的磷酸盐缓冲液中，制备高亲和力适配体溶液和荧光分子信标溶液；
（2）将一定量的高亲和力适配体溶液和荧光分子信标溶液混合均匀，水浴加热反应后冷却至室温再反应，得传感器溶液；
（3）向步骤（2）的混合溶液中加入待测样本，混合均匀反应1h后进行荧光检测，计算荧光信号的衰减效率，代入线性方程获得待测样本中NSE的浓度。
7.根据权利要求6所述的适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）中高亲和力适配体溶液的浓度为0.3μΜ，荧光分子信标溶液的浓度为0.2μΜ。
8.根据权利要求6所述的适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述步骤（2）中高亲和力适配体溶液和荧光分子信标溶液的摩尔浓度比为1:1.5；水浴加热的温度为95℃、时间为10min；室温再反应的时间为30min。
9.根据权利要求7-8所述的适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述步骤（3）中混合溶液与待测样本的体积比为4:1。
10.根据权利要求9所述的适配体传感器的使用方法，其特征在于：所述荧光检测的激发波长为495 nm，发射波长为517 nm，荧光光谱的测定波长为510 nm-670 nm；线性方程为Y=2.223+0.359 CNSE ，R2=0.985。
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