CN106622165A - 一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球及其制备方法以及一种过氧化氢酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法，包括以下步骤：A)将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子；B)将所述铁氧酸粒子、乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，加热反应后，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球；C)将所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧；D)将步骤C)得到的产物分散于缓冲溶液中、再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
Description
技术领域
本发明属于高分子生物材料技术领域，具体涉及一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法以及一种过氧化氢酶抑制剂。
背景技术
近年研究表明过度提高癌细胞内活性氧的含量能够诱导癌细胞的衰老和凋亡(P.Huang et al.,Nature Reviews Drug Discovery 2009,8,579.)。这主要是由于大量的活性氧存在使得细胞内的DNA和线粒体氧化受损，破坏了细胞的正常代谢和分化。在众多的活性氧物种中，羟基自由基(·OH)拥有最高的氧化能力，从而引起了广泛的关注。但是细胞内的·OH含量却很低(10-15M)，致使·OH在癌症治疗中应用受到很大的限制。细胞内的·OH最主要的来源于Fenton反应，即细胞内过氧化氢(H2O2)在铁离子的催化下均裂产生·OH。因此，获得较高的细胞内·OH浓度，需要细胞中有高浓度的H2O2以及Fe离子。
众所周知，过氧化氢酶(CAT)能催化过氧化氢分解成水和氧气，从而降低细胞内的H2O2水平，不利于Fenton反应的进行。因此，研究人员花费大量精力致力于研制CAT的抑制剂，以抑制或降低其生物活性。然而常见的CAT抑制剂都是小分子的药物，虽然能够一定程度上抑制CAT的活性，却不能将细胞内积累的H2O2转化为毒性更高的·OH。因此，在抑制CAT活性的同时还需要将铁离子引入癌细胞内，用于催化细胞内的Fenton反应，产生高浓度·OH，最终诱导癌细胞的凋亡。然而到目前为止还没有相关报道合成这种多功能的CAT抑制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法以及一种过氧化氢酶抑制剂，本发明提供的对CAT具有特异性吸附的磁性分子印迹微球，它不仅可以吸附并抑制CAT的生物活性，还能够在弱酸性环境中释放铁离子，从而催化H2O2分解生成·OH。
本发明提供了一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法，包括以下步骤：
A)将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子；
B)将所述铁氧酸粒子、乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，加热反应后，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球；
C)将所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧；
D)将步骤C)得到的产物分散于缓冲溶液中，再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
优选的，所述铁源物质选自三氯化铁或其水合物；所述稳定剂选自十六烷基三甲基溴化铵；所述乳化剂选自十六烷基三甲基溴化铵；所述催化剂选自尿素；所述二氧化硅前驱体选自正硅酸四乙酯。
优选的，所述乳化剂、催化剂、水、二氧化硅前驱体、异丙醇和环己烷的摩尔比为0.28:1:167:(28～40):1.31:(0.67～1.78)。
优选的，步骤A)中，所述加热反应的温度为90～105摄氏度，所述加热反应的时间为18～24小时。
优选的，步骤B)中，所述加热反应的温度为65～75摄氏度，所述加热反应的时间为12～16小时。
优选的，所述煅烧的环境为氮气和氢气的混合气体，所述混合气体中氢气所占的体积百分数为5％，所述煅烧的温度为250～700摄氏度，所述煅烧的时间为2～7小时。
优选的，所述缓冲溶液为pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液或pH＝8的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，所述步骤C)得到的产物与多巴胺的质量比为(2～6)：1。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
本发明还提供了一种过氧化氢酶抑制剂，所述过氧化氢酶抑制剂包括上述制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球或上述磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
与现有技术相比，本发明提供了一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法，包括以下步骤：A)将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子；B)将所述铁氧酸粒子、乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，加热反应后，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球；C)将所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧；D)将步骤C)得到的产物分散于缓冲溶液中、再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。该方法先合成出FeOOH纳米粒子，再在其表面包覆一层二氧化硅壳层，经过氢气煅烧将FeOOH核还原成具有磁性的氧化铁后，在微球表面原位聚合包覆一层对过氧化氢酶具有特异性识别和吸附能力的聚多巴胺分子印迹层。该方法所制备的磁性分子印迹微球不但可以从水溶液中特异性地捕捉过氧化氢酶，并使其失去活性，并且可以抑制被捕获的酶的活性，起到酶抑制剂的作用，还能够在弱酸性环境中释放铁离子，从而催化H2O2分解生成·OH。除此之外，所合成的微球具有催化Fenton反应的能力，并可以进行磁性分离。因此，本发明设计并合成出的磁性多功能分子印迹微球，有望作为集磁共振造影及自由基疗法相结合于一体的纳米药物，应用于癌症治疗中。
附图说明
图1为FeOOH纳米粒子的TEM照片；
图2为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2和Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的XRD谱图；
图3为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2微球和MIP-CAT微球的红外光谱图；
图4为Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的TEM照片；
图5为MIP-CAT微球的TEM照片；
图6为用VSM测定的MIP-CAT微球的M-H曲线；
图7为MIP-CAT和NIP微球对CAT,SOD和trypsin的吸附性能；
图8为MIP-CAT和NIP微球对CAT催化H2O2分解反应的影响；
图9为MIP-CAT微球对亚甲基蓝降解的催化效果；
图10为FeOOH纳米粒子的TEM照片；
图11为β-FeOOH@F-SiO2微球的TEM照片；
图12为Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的TEM照片；
图13为MIP-CAT微球的SEM照片。
具体实施方式
本发明提供了一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法，包括以下步骤：
A)将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子；
B)将所述铁氧酸粒子、乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，加热反应后，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球；
C)将所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧；
D)将步骤C)得到的产物分散于缓冲溶液中，再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
本发明首先将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子。
在本发明中，所述铁源物质优选为氯化铁或其水合物，更优选为FeCl3·6H2O。所述稳定剂优选为十六烷基三甲基溴化铵。其中，所述铁源物质和稳定剂的摩尔比为(10～15)：1。
将所述铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应，所述加热反应的温度为90～105摄氏度，所述加热反应的时间为18～24小时。
将加热反应得到的反应产物进行离心、洗涤和烘干，得到铁氧酸粒子。
在本发明中，对所述离心的转速为12000rpm，所述离心的时间为10min。
本发明对所述反应产物洗涤的方法并没有特殊限制，优选采用无水乙醇洗涤，所述洗涤的次数优选为3次。
将洗涤后得到的产物进行烘干，烘干优选在烘箱中进行烘干，烘干结束后，得到棕黄色粉末，即铁氧酸粒子。所述铁氧酸粒子为纺锤形铁氧酸纳米粒子(β-FeOOH)。
将得到的铁氧酸粒子与乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，得到乳液；
优选的，所述乳化剂选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；所述催化剂选自尿素；所述二氧化硅前驱体选自正硅酸四乙酯(TEOS)。
在本发明中，所述乳化剂、催化剂、水、二氧化硅前驱体、异丙醇和环己烷的摩尔比优选为0.28:1:167:(28～40):1.31:(0.67～1.78)。
具体的，所述乳液的制备方法为：
将乳化剂、催化剂、水和铁氧酸纳米粒子混合超声分散后，再加入环己烷、异丙醇和二氧化硅前驱体，在150～350rpm的转速条件下搅拌15～60min，得到乳液。
接着，将得到的乳液进行加热反应后，经过离心、洗涤和烘干，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球。
其中，所述加热反应的温度优选为65～75摄氏度，所述加热反应的时间优选为12～16小时，更优选为13～15小时。
将加热反应得到的反应产物进行离心、洗涤和烘干，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球。
在本发明中，对所述离心的转速为8000rpm，所述离心的时间为10min。
本发明对所述反应产物洗涤的方法并没有特殊限制，优选采用无水乙醇洗涤，所述洗涤的次数优选为3次。
将洗涤后得到的产物进行烘干，烘干优选在烘箱中进行烘干，烘干结束后，得到棕黄色粉末，即SiO2包覆铁氧酸粒子的微球。
在本发明中，所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球为纤维状SiO2包覆β-FeOOH的微球，可用β-FeOOH@F-SiO2表示。
将得到的SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧，在本发明中，所述煅烧的环境为氮气和氢气的混合气体，所述混合气体中氢气所占的体积百分数为5％，所述煅烧的温度优选为250～700摄氏度，更优选为400～600℃，所述煅烧的时间为2～7小时，优选为5～6小时。
煅烧结束后，使β-FeOOH还原成Fe3O4和Fe单质的混合物，得到Fe3O4/Fe@F-SiO2微球。
将煅烧后得到的产物分散于缓冲溶液中、再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应。
所述缓冲溶液优选为pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液或pH＝8的磷酸盐缓冲溶液。
所述煅烧后得到的产物与多巴胺的质量比优选为(2～6)：1，更优选为(3～5)：1。
所述聚合反应的温度为室温条件，所述聚合反应的时间为4～12小时，优选为8～10小时。
将经过聚合反应得到的反应产物经过离心、洗涤后，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
具体的，所述反应产物包括下层沉淀物质和上层液体，将上层液体去除之后，将下层沉淀物之进行离心和洗涤。
所述离心洗涤的方法具体为：
用含有10％十二烷基硫酸钠和5％乙酸的水溶液浸泡洗涤下层沉淀物质，然后进行离心，去除上层液体。重复上述步骤五次后，再将下层沉淀物质有去离子水洗涤离心三次。
最后，将洗涤后的产物进行干燥，得到黑色粉末状最终产物，即磁性过氧化氢酶分子印迹微球(MIP-CAT微球)。
本发明还提供了一种采用上述制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
本发明还提供了一种过氧化氢酶抑制剂，所述过氧化氢酶抑制剂包括上述制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球或上述磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
所述过氧化氢酶抑制剂可以有效抑制CAT的生物活性，还能在弱酸性环境中释放铁离子，从而催化H2O2分解生成·OH，有望作为集磁共振造影及自由基疗法相结合于一体的纳米药物，应用于癌症治疗中。
该方法先合成出FeOOH纳米粒子，再在其表面包覆一层二氧化硅壳层，经过氢气煅烧将FeOOH核还原成具有磁性的氧化铁后，在微球表面原位聚合包覆一层对过氧化氢酶具有特异性识别和吸附能力的聚多巴胺分子印迹层。该方法所制备的磁性分子印迹微球不但可以从水溶液中特异性地捕捉过氧化氢酶，并使其失去活性，并且可以抑制被捕获的酶的活性，起到酶抑制剂的作用，还能够在弱酸性环境中释放铁离子，从而催化H2O2分解生成·OH。除此之外，所合成的微球具有催化Fenton反应的能力，并可以进行磁性分离。因此，本发明设计并合成出的磁性多功能分子印迹微球，有望作为集磁共振造影及自由基疗法相结合于一体的纳米药物，应用于癌症治疗中。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的磁性过氧化氢酶分子印迹微球及其制备方法以及过氧化氢酶抑制剂进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1、合成纺锤形铁氧酸纳米粒子(β-FeOOH)。
首先将8.1g三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解到300mL去离子水中。再称取1g CATB加入到上述溶液中，待溶解后，将溶液转入500mL反应器中。上述混合液在磁力搅拌器下升温至90℃，加热18小时后停止反应。将反应液倒入离心管中，在12000rpm的转速下离心10min(飞鸽TGL-16C离心机)，将上层滤液倒入废液桶，用去离子水浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的离心分离。重复上述乙醇洗涤-离心分离步骤两次后，将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到棕黄色粉末。
其形貌如图1所示，图1为FeOOH纳米粒子的TEM照片。由图1可知，粒子长径平均约为110nm，短径约为25nm。
产物的XRD谱图如图2所示，图2为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2和Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的XRD谱图，与JCPDS标准卡片No.75-1594对比，表明产物为β-FeOOH。
产物的红外光谱图如图3所示，图3为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2微球和MIP-CAT微球的红外光谱图。
2、β-FeOOH纳米粒子表面包覆纤维状SiO2(F-SiO2)壳层(β-FeOOH@F-SiO2)。
首先将4.0g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2.4g尿素，120mL去离子水和0.1g步骤1)中制备的β-FeOOH纳米粒子加入500mL三口烧瓶中，将单口瓶放入KUDOS型超声机中，超声分散30min。再依次加入120mL环己烷，4mL异丙醇和6mL正硅酸四乙酯。上述混合液在室温下机械搅拌30min(250rpm)后，加热至75℃反应16h。将反应液倒入离心管中，在8000rpm的转速下离心10min(飞鸽TGL-16C离心机)，将上层滤液倒入废液桶，用无水乙醇浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的离心分离。重复上述乙醇洗涤-离心分离步骤两次后，将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到棕黄色粉末。
产物的XRD见图2，图2为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2和Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的XRD谱图，β-FeOOH的衍射峰上又叠加了非晶衍射峰。
产物的红外光谱谱图如图3所示，图3为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2微球和MIP-CAT微球的红外光谱图，1080cm-1处出现了Si-O-Si的特征伸缩振动吸收峰，说明有SiO2包覆在β-FeOOH表面。
3、β-FeOOH@F-SiO2微球的煅烧还原得到Fe3O4/Fe@F-SiO2微球。将步骤2)中所得粉末放入400℃的管式炉中，在氢气氛围下煅烧5h。冷却至室温得到微球。
其形貌如图4所示。图4为Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的TEM照片。
产物的XRD见图2，图2为FeOOH纳米粒子，FeOOH@F-SiO2和Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的XRD谱图，β-FeOOH的特征衍射峰消失，出现了Fe3O4和Fe单质的特征衍射峰。
4、制备CAT分子印迹微球(MIP-CAT)。将100mg步骤3)中制备的Fe3O4/Fe@F-SiO2微球粉末和20mg CAT加入40mL Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)，放入冰水浴中，保持0℃，磁力搅拌4h后，加入20mg多巴胺。从冰水浴中取出反应瓶，室温下磁力搅拌反应12h。将反应液倒入离心管中，将磁铁放置在离心管底部5min，将产物吸至离心管底部。将上层滤液倒入废液桶，用含有10％十二烷基硫酸钠和5％乙酸的水溶液浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的分离。重复上述溶液洗涤-离心分离步骤五次。再将产物用去离子水洗涤三次，最后将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到黑色粉末状最终产物(MIP-CAT微球)。
其形貌如图5所示，图5为MIP-CAT微球的TEM照片。与图4对比，可以发现原先纤维状SiO2壳层中的空隙被物质填充。
产物的红外光谱图见图3，而红外光谱中(图3)可以看到苯环的特征吸收峰(1500cm-1～1610cm-1)，表明纤维状SiO2壳层包覆了聚多巴胺。
用振动样品磁强计(VSM)测得产物的磁化强度-磁场强度(M-H)曲线如图6所示，图6为用VSM测定的MIP-CAT微球的M-H曲线，由此计算出产物的饱和磁化强度为40emu/g，完全能够满足磁性分离的要求。
实施例2制备NIP微球。
将100mg实施例1中步骤3制备的Fe3O4/Fe@F-SiO2微球粉末加入40mL Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)，放入冰水浴中，保持0℃，磁力搅拌4h后，加入20mg多巴胺。从冰水浴中取出反应瓶，室温下磁力搅拌反应12h。将反应液倒入离心管中，将磁铁放置在离心管底部5min，将产物吸至离心管底部。将上层滤液倒入废液桶，用含有10％十二烷基硫酸钠和5％乙酸的水溶液浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的分离。重复上述溶液洗涤-离心分离步骤五次。再将产物用去离子水洗涤三次，最后将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到黑色粉末状最终产物(NIP微球)。
实施例3
MIP-CAT微球分子印迹性能
为考察CAT分子印迹微球的印迹性能，选取实施例1中的微球进行吸附试验。
称取实施例1中所制备的MIP-CAT微球和实施例2制备的没有加入CAT模板分子制备的非印迹微球(NIP)各5mg加入到25mL单口烧瓶中，并加入5mL PBS缓冲溶液中(pH＝7.4)。将单口瓶放入KUDOS型超声机中，超声分散10min，得到1mg/mL的微球分散液。再称取5mg CAT溶解在上述分散液中，室温下吸附12h后，将反应液倒入离心管中，用磁铁在离心管底部吸附5min，收集上层液体，并用UV-2041紫外可见分光光度计测定上层液体中CAT的吸光度，从而计算出其吸附量。
在考察MIP-CAT微球的特异性性吸附时，选取超氧化物歧化酶(SOD)和胰蛋白酶(trypsin)作为对照组，操作与上述吸附步骤相同。
微球对三种蛋白的吸附量如图7所示，图7为MIP-CAT和NIP微球对CAT,SOD和trypsin的吸附性能。可以看出MIP-CAT微球对CAT的吸附量最高，对其他两种蛋白的吸附量都很低，而NIP微球对三种蛋白质的吸附量都不高，由此可见，所制备的MIP-CAT微球对CAT分子呈现出特异性的吸附性能。为了更直观的表示这种差异性的吸附，定义参数印迹指数(IF)
IF＝QMIP/QNIP
其中，QMIP和QNIP分别表示MIP和NIP微球对特定蛋白的吸附量。IF值越大，表明这种特异性吸附越明显。从图7中也可以看出MIP-CAT微球对CAT的印迹指数可达7.39，而对其他两种蛋白的IF均只有1.4左右。
实施例4
MIP-CAT微球对CAT生物活性的抑制作用
选取CAT催化过氧化氢分解的过程作为模型反应考察MIP-CAT微球对CAT生物活性的抑制作用。
称取实施例1中所制备的MIP-CAT和实施例2制备的没有加入CAT模板分子制备的非印迹微球(NIP)各4mg加入到15mL塑料离心管中，并向离心管中加入20mL Tris-HCl缓冲溶液中(pH＝8)。将塑料离心管放入KUDOS型超声机中，超声分散10min，得到0.2mg/mL的微球分散液。再称取5mg CAT溶解在上述分散液中，室温下吸附20h。取20μL上述的分散液加入到2mL的H2O2溶液中(0.036wt％)，并立刻用UV-2041紫外可见分光光度计测定分散液在波长为241nm处的吸光度。
对照组中，不加入任何微球，其他条件与样品组相同。
各组样品的吸光度如图8所示，图8为MIP-CAT和NIP微球对CAT催化H2O2分解反应的影响。可以看出对照组中溶液的吸光度迅速降低，表明在CAT的催化下，H2O2迅速分解成氧气和水。加入NIP微球后，吸光度降低速度只有微弱减慢，而加入MIP-CAT微球后吸光度降低的速度被大大减慢。这表明上述合成的MIP-CAT微球吸附CAT后，其生物活性也得到了有效的抑制。图8中，滴管的位置表示开始向反应体系中加入反应的催化剂，即MIP-CAT微球和酶的混合液。
实施例5
MIP-CAT微球对Fenton反应的催化性能
选取H2O2降解亚甲基蓝(MB)作为模型反应考察MIP-CAT微球对Fenton反应的催化性能。具体操作如下：称取实施例1中所制备的MIP-CAT微球10mg加入到50mL烧杯中，并向烧杯中加入20mL MB溶液(pH＝5.4)，将烧杯放入KUDOS型超声机中，超声分散5min，并在黑暗条件下搅拌30分钟以达到吸附平衡。再将1.2mL H2O2加入上述体系中，并立刻用UV-2041紫外可见分光光度计测定分散液在波长为664nm处的吸光度。
对照组中，不加入MIP-CAT微球，其他条件与样品组一致。
如图9所示，图9为MIP-CAT微球对亚甲基蓝降解的催化效果。对照组中，溶液的吸光度基本不发生变化，而实验组中溶液的吸光度随着时间的增加而逐渐降低，说明溶液中H2O2分解生成·OH的速度很快，从而导致MB迅速被降解，从而证明了所制备的MIP-CAT微球可以作为Fenton反应的催化剂使用。图9中，滴管的位置表示开始向反应体系中加入反应的催化剂，即MIP-CAT微球和酶的混合液。
实施例6
1、合成纺锤形铁氧酸纳米粒子(β-FeOOH)。
首先将8.1g三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解到300mL去离子水中。再称取0.8g CATB加入到上述溶液中，待溶解后，将溶液转入500mL反应器中。上述混合液在磁力搅拌器下升温至90℃，加热18小时后停止反应。将反应液倒入离心管中，在12000rpm的转速下离心10min(飞鸽TGL-16C离心机)，将上层滤液倒入废液桶，用去离子水浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的离心分离。重复上述乙醇洗涤-离心分离步骤两次后，将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到棕黄色粉末。
其形貌如图10所示，图10为FeOOH纳米粒子的TEM照片。由图10可知，粒子长径平均约为250nm，短径约为40nm。
2、β-FeOOH纳米粒子表面包覆纤维状SiO2(F-SiO2)壳层(β-FeOOH@F-SiO2)。
首先将4.0g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2.4g尿素，120mL去离子水和0.1g上述步骤中制备的β-FeOOH纳米粒子(约250nm)加入500mL三口烧瓶中，将单口瓶放入KUDOS型超声机中，超声分散30min。再依次加入120mL环己烷，4mL异丙醇和6mL正硅酸四乙酯。上述混合液在室温下机械搅拌30min(250rpm)后，加热至75℃反应16h。将反应液倒入离心管中，在8000rpm的转速下离心10min(飞鸽TGL-16C离心机)，将上层滤液倒入废液桶，用无水乙醇浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的离心分离。重复上述乙醇洗涤-离心分离步骤两次后，将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到棕黄色粉末。产物的形貌如图11所示，图11为β-FeOOH@F-SiO2微球的TEM照片。
3、β-FeOOH@F-SiO2微球的煅烧还原得到Fe3O4/Fe@F-SiO2微球。将步骤2)中所得粉末放入700℃的管式炉中，在氢气氛围下煅烧4h。冷却至室温得到微球。
其形貌如图12所示，图12为Fe3O4/Fe@F-SiO2微球的TEM照片。可以看到粒子长径平均约为420nm，短径约为225nm。与图11对比，可以发现原先内部的β-FeOOH在还原后体积收缩，并且纤维状SiO2壳层纤维状结构也变得更加稀疏。
4、制备CAT分子印迹微球(MIP-CAT)。将100mg步骤3)中制备的Fe3O4/Fe@F-SiO2微球粉末和15mg CAT加入40mL Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)，放入冰水浴中，保持0℃，磁力搅拌4h后，加入15mg多巴胺。从冰水浴中取出反应瓶，室温下磁力搅拌反应12h。将反应液倒入离心管中，将磁铁放置在离心管底部5min，将产物吸至离心管底部。将上层滤液倒入废液桶，用含有10％十二烷基硫酸钠和5％乙酸的水溶液浸泡洗涤沉于离心管底部的产物，再进行相同条件的分离。重复上述溶液洗涤-离心分离步骤五次。再将产物用去离子水洗涤三次，最后将产物收集在玻璃培养皿中，置于Boxun GZX-9070MBE型鼓风烘箱中50℃烘干，得到黑色粉末状最终产物(MIP-CAT微球)。
产物形貌如图13所示，图13为MIP-CAT微球的SEM照片。可以看到粒子长径平均约为450nm，短径约为240nm。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种磁性过氧化氢酶分子印迹微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将铁源物质、稳定剂与水混合进行加热反应后，得到铁氧酸粒子；
B)将所述铁氧酸粒子、乳化剂、催化剂、二氧化硅前驱体、水、异丙醇和环己烷混合搅拌，加热反应后，得到SiO2包覆铁氧酸粒子的微球；
C)将所述SiO2包覆铁氧酸粒子的微球进行煅烧；
D)将步骤C)得到的产物分散于缓冲溶液中，再加入过氧化氢酶和多巴胺，在空气中进行聚合反应，得到磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铁源物质选自三氯化铁或其水合物；所述稳定剂选自十六烷基三甲基溴化铵；所述乳化剂选自十六烷基三甲基溴化铵；所述催化剂选自尿素；所述二氧化硅前驱体选自正硅酸四乙酯。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳化剂、催化剂、水、二氧化硅前驱体、异丙醇和环己烷的摩尔比为0.28:1:167:(28～40):1.31:(0.67～1.78)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，所述加热反应的温度为90～105摄氏度，所述加热反应的时间为18～24小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)中，所述加热反应的温度为65～75摄氏度，所述加热反应的时间为12～16小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述煅烧的环境为氮气和氢气的混合气体，所述混合气体中氢气所占的体积百分数为5％，所述煅烧的温度为250～700摄氏度，所述煅烧的时间为2～7小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液或pH＝8的磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C)得到的产物与多巴胺的质量比为(2～6)：1。
9.一种如权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
10.一种过氧化氢酶抑制剂，其特征在于，所述过氧化氢酶抑制剂包括权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的磁性过氧化氢酶分子印迹微球或权利要求9所述的磁性过氧化氢酶分子印迹微球。
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