CN110873795B - 一种生物芯片及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物芯片及其制备和应用。所述生物芯片包括基底片和修饰层,所述修饰层包括活性氨基层和聚乙二醇层;所述活性氨基层(通过共价键)连接在基底片上以及所述聚乙二醇层(通过共价键)连接在活性氨基层;还包括功能分子层,所述功能分子层(通过共价键)连接在所述聚乙二醇层。修饰有聚乙二醇层和功能分子层的芯片具有低背景、高灵敏度、降低非特异性蛋白吸附及细胞粘附等优点,具有特异性细胞粘附功能。
Description
技术领域
本发明属于生物、化学、药学等技术领域,涉及一种微阵列生物芯片及其制备和功能分子与细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物等相互作用的应用。
背景技术
研究生物活性分子与哺乳动物细胞的相互作用,对基础科学研究和功能生物材料的开发以及组织工程的发展具有重要意义。现有的生物医学材料应用已取得了一定的成绩,但是面对临床应用表现出来的生物相容性差、使用寿命短及长时间功能缺失等问题仍无法解决。赋予材料全新的生物结构与功能活性,使其具有良好的生物相容性、生物安全性及复合多功能性,已成为生物医学材料发展的重要方向。
生物医用材料植入体内与机体的反应首先发生于植入材料的表面/界面,即材料表面/界面对体内蛋白/细胞的吸附/粘附。传统材料的主要问题是对蛋白/细胞的随机吸附/粘附,从而导致炎症、异体反应、植入失效。因此控制材料表面/界面,发展表面改性技术,找到最佳功能活性材料是现阶段提高传统材料的主要途径,也是发展新一代生物医用材料的基础。
目前,为了改善植入材料的生物相容性,常用具有细胞粘附功能的多肽(如RGD,KRSR等),蛋白(如纤连蛋白,胶原蛋白等)以及多糖等。但是其价格昂贵,批次之间差异较大,在体内容易被蛋白酶水解很不稳定。
因此,本领域仍需要开发一种价格便宜且体内稳定性好的具有细胞粘附功能的生物材料。
然而,在筛选与细胞/蛋白相互作用的生物材料之前需要研发一种高通量、低背景和低非特异性细胞粘附的功能芯片,以便于发明人快速、有效的筛选出所需要的生物材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高通量检测功能分子和细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物等物质之间相互作用的生物芯片。
本发明的目的还在于提供上述生物芯片的制备方法以及利用其高通量筛选不同细胞与功能分子之间的相互作用以及检测功能分子的其他生物功能方面的应用。
为达到以上目的,本发明采用如下技术方案:
本发明第一方面提供了一种低背景的生物芯片基片,包括基底片和修饰层,所述修饰层包括活性氨基层和聚乙二醇层(抗非特异性吸附和粘附);所述活性氨基层(通过共价键)连接在基底片上以及所述聚乙二醇层(通过共价键)连接在活性氨基层。
在另一优选例中,所述基底片为玻璃基片。
在另一优选例中,所述聚乙二醇含有5-50个乙二醇单元。
在另一优选例中,所述聚乙二醇含有7-12个乙二醇单元。
在另一优选例中,所述聚乙二醇含有8-12个乙二醇单元。
本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述生物芯片基片的制备方法,包括步骤:
(1)预处理基底片:清洗基底片表面后用UV照射基底片表面(使其获得较多羟基),从而得到表明经预处理的基底片;
(2)引入活性氨基层:将表面经预处理的基底片与活性氨基化合物进行反应,在基底片表面引入活性氨基后,对基片进行退火处理,从而得到表面引入活性氨基层的基片;
(3)引入聚乙二醇层:将表面引入活性氨基层的基片与末端异功能化聚乙二醇进行反应,从而得到本发明第一方面所述生物芯片基片。
在另一优选例中,步骤(1)中,所述UV照射为在波长为100-400nm的紫外光下照射,优选为254nm和185nm。
在另一优选例中,步骤(1)中,所述清洗为依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗。
在另一优选例中,步骤(1)中,所述UV照射的时间为15-30分钟,优选为25分钟。
在另一优选例中,步骤(1)中,所述UV照射的高度为20-40毫米,优选为35毫米。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述活性氨基化合物为3-氨丙基二乙氧基硅烷。
在另一优选例中,步骤(2)中,在基片表面引入活性氨基后和对基片进行退火处理之前还包括对基片进行清洗。例如依次用丙酮、乙醇和去离子水冲洗。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述反应在选自下组的溶剂中进行:甲苯、乙腈、丙酮。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述退火处理时间为3-6小时,优选为4小时。
在另一优选例中,所述的3-氨丙基二乙氧基硅烷的反应浓度为0.2%-5%(V/V),优选为2%(V/V)。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述反应时间为3-12小时,优选为8小时。
在另一优选例中,步骤(2)中,所述退火处理在80-100℃的真空环境下进行,优选为90℃。
在另一优选例中,步骤(3)中,所述末端异功能化聚乙二醇的一端端基为N-羟基琥珀酰亚胺,另一端端基为羟基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、叠氮、炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、巯基、生物素、金刚烷、环糊精中的任意一种。
在另一优选例中,步骤(3)中,所述反应用的溶剂为磷酸盐缓冲溶液、二甲基亚砜、乙腈、甲醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷中的任意一种。
在另一优选例中,步骤(3)中,所述反应时间为1-5小时,优选为3小时。
本发明第三方面提供了一种高通量筛选功能分子的方法,包括步骤:
(a)测试本发明第一方面所述生物芯片基片与细胞、蛋白或多肽的相互作用;
(b)将待筛选分子与本发明第一方面所述生物芯片基片的聚乙二醇层(通过共价键)连接,形成包括本发明第一方面所述的生物芯片基片和待筛选分子层的芯片;
(c)测试步骤(b)得到的芯片与细胞、蛋白或多肽的相互作用;
(d)若步骤(a)的结果显示本发明第一方面所述生物芯片基片与细胞、蛋白或多肽无相互作用或基本上无相互作用,而步骤(c)的结果显示步骤(b)得到的芯片与细胞、蛋白或多肽有相互作用,则该待筛选分子为功能分子。
本发明的功能分子可用于吸附或粘附选自下组的物质:细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物。
在另一优选例中,所述功能分子为尼龙-3聚合物。
本发明第四方面提供了一种功能分子的用途,用于吸附或粘附选自下组的物质:细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物。
在另一优选例中,所述功能分子为尼龙-3聚合物。
在另一优选例中,所述的细胞选自下组:成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、干细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、软骨细胞。
本发明第五方面提供了一种生物芯片,包括本发明第一方面所述的生物芯片基片和功能分子层,所述功能分子层(通过共价键)连接在所述生物芯片基片的聚乙二醇层。
在另一优选例中,所述功能分子为尼龙-3聚合物。
在另一优选例中,所述生物芯片包括但不仅限于,细胞微阵列芯片、蛋白及多肽微阵列芯片、微生物(如细菌、病毒、真菌)微阵列芯片、核酸分子微阵列芯片、糖分子微阵列芯片、聚合物微阵列芯片。
本发明第六方面提供了一种本发明第五方面所述生物芯片的制备方法,包括步骤(4):将本发明第一方面所述生物芯片基片与末端官能化的功能分子化合物进行反应,从而得到本发明第五方面所述的生物芯片。
在另一优选例中,步骤(4)中,所述末端官能化的功能分子的一端末端为卤素、羧基、活性酯基团、酰氯、环氧烷、巯基、烯烃基团、炔基、叠氮、马来酰亚胺、邻二硫吡啶基(OPSS)、环糊精、金刚烷中的任意一种。
在另一优选例中,步骤(4)中,所述末端官能化的功能分子的浓度为0.5mM-5mM,优选为2mM。
在另一优选例中,步骤(4)中,所述反应时间为4-12小时,优选为6小时。
本发明第七方面提供了本发明第五方面所述生物芯片的用途,用于检测功能分子与选自下组的物质的作用(如粘附或吸附作用):细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物。
本发明第八方面提供了一种检测方法,用本发明第五方面所述的生物芯片来检测细胞的粘附数量和细胞形态等指标,且所述的生物芯片中的功能分子为尼龙-3聚合物。
在另一优选例中,所述方法包括以下步骤:(i)将细胞接种于第一方面所述的生物芯片并一起孵育。
在另一优选例中,所述方法还包括以下步骤:
(ii)用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤(i)获得的孵育有细胞的生物芯片,用LIVE/DEAD荧光试剂避光孵育细胞20分钟;
(iii)用荧光显微镜拍摄不同倍数不同区域下的照片,从而获得细胞粘附数量及铺展状态的信息。
在另一优选例中,所述的细胞选自下组:成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、干细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、软骨细胞。
本发明第九方面提供了一种细胞微阵列,其包括本发明第五方面所述的生物芯片和接种于所述芯片的细胞。
本发明提供了所述细胞微阵列的制备方法,包括步骤:将细胞接种于本发明第五方面所述的生物芯片并一起孵育。
本发明提供了所述细胞微阵列的用途,用于检测细胞与功能分子的相互作用。
本发明提供了生物芯片在检测功能分子与细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物等相互作用在生物、化学、制药等相关领域研究中的应用。
本发明中,可以通过调控聚乙二醇衍生物的链段长度来控制微阵列生物芯片表面修饰层的密度和厚度,从而可以简单、快速而高效的制备出低背景和高灵敏度的微阵列生物芯片,解决了聚乙二醇链长较短无法抵制非特异性粘附和链长过长导致的表面功能高分子接枝率降低无法显现足够生物活性的问题。
本发明中,所述基底片采用安全、简单的紫外臭氧清洗机照射预处理方法,替代了传统的,危险性较大的“食人鱼”溶液处理玻璃的方法。
本发明中,可以简单、高效的检测各种分子在细胞粘附等方面的应用。应用本方法发现的尼龙3聚合物(β氨基酸聚合物)在细胞粘附方面的功能,可以应用于组织工程领域,提高植入材料的生物活性和生物相容性,促进受损组织的修复。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
发明人经过大量且非常深入的研究,筛选得到了一种优异的具有细胞粘附功能的尼龙3聚合物,其无需特定氨基酸序列和多肽高级结构。发明人在筛选与如细胞/蛋白等物质相互作用的功能分子之前,首先经过大量研究,建立了一个高通量、低背景的生物芯片。在此基础上完成了本发明。
生物芯片基片是生物芯片的基础,该基片的制备是整个芯片开发中的关键性环节。首先,在基底片上建立一层具有抗细胞和蛋白等物质非特异性粘附和吸附的修饰层,这样才能保证筛选结果不受背景因素的影响和干扰,更能真实反映不同功能分子之间的效果差异,才能实现在众多分子中发现新的生物活性/功能分子。通常选择具有良好亲水性的聚乙二醇作为该修饰层,但是不同的表面接枝方法和工艺以及聚乙二醇分子量的大小将导致表面接枝密度,分子链的形态发生很大改变,从而影响到抵制细胞和蛋白非特异性吸附和粘附的效果以及进一步接枝功能分子的密度。
本发明研制出了具有较高抗细胞和蛋白等物质非特异性粘附和吸附的效果又同时兼顾后续表面接枝功能分子密度和活性的生物芯片基片,对高通量检测功能分子-细胞、功能分子-蛋白、功能分子-微生物、功能分子-核酸分子、功能分子-糖分子、功能分子-聚合物等的相互作用的方法具有极其重要的意义。
本发明提及的共价键可以是硅氧键、酰胺键等共价键。
生物芯片基片
本发明的生物芯片基片包括基底片和修饰层,所述修饰层包括活性氨基层和聚乙二醇层(PEG层)(抗非特异性吸附);所述活性氨基层(通过共价键)连接在基片上以及所述聚乙二醇层(通过共价键)连接在活性氨基层。所述基底片为玻璃基片。所述聚乙二醇含5-50个乙二醇单元,优选7-12个,优选8-12个。
高通量筛选功能分子方法
本发明的生物芯片基片可用于高通量筛选功能分子,具体可包括步骤:
(a)测试本发明的生物芯片基片与细胞、蛋白或多肽的相互作用;
(b)将待筛选分子与本发明的生物芯片基片的聚乙二醇层(通过共价键)连接,形成包括本发明的生物芯片基片和待筛选分子层的芯片;
(c)测试步骤(b)得到的芯片与细胞、蛋白或多肽的相互作用;
(d)若步骤(a)的结果显示本发明的生物芯片基片与细胞、蛋白或多肽无相互作用或基本上无相互作用,而步骤(c)的结果显示步骤(b)得到的芯片与细胞、蛋白或多肽有相互作用,则该待筛选的分子为功能分子。
功能分子
本发明的功能分子的末端连接基团可以为卤素、羧基、活性酯基团、酰氯、环氧烷、巯基、烯烃基团、炔基、叠氮、马来酰亚胺、巯基、生物素、环糊精、金刚烷中的任意一种。功能分子的末端基团只是为了用于与聚乙二醇衍生物相连接。此功能分子包括但不限于具有良好细胞、蛋白粘附和吸附功能的高分子聚合物以及功能多肽,还可以是具有生物功能的天然高分子,如壳聚糖、葡聚糖及其衍生物等。
本发明的功能分子优选为尼龙-3聚合物。本发明所涉及的尼龙-3聚合物的制备方法可以参见Liu R.,Chen X.和Gellman S.H.等,可以选择性培养内皮细胞的尼龙-3聚合物(Nylon-3Polymers that Enable Selective Culture of Endothelial Cells)[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(44):16296.和Qian Y.,Qi F.和Chen Q.等,模拟宿主防御肽的β-多肽聚合物修饰表面实现高效接触式杀菌(SurfaceModified with a Host Defense Peptide-Mimickingβ-Peptide Polymer KillsBacteria on Contact with High Efficacy).[J].Acs Appl Mater Interfaces,2018.。具体例如下述反应式所示的合成路线。
生物芯片
本发明的生物芯片,包括本发明的生物芯片基片和功能分子层,所述功能分子层(通过共价键)连接在所述聚乙二醇层。
所述生物芯片包括但不仅限于,细胞微阵列芯片、蛋白及多肽微阵列芯片、微生物(如细菌、病毒、真菌)微阵列芯片、核酸分子(如DNA、RNA)微阵列芯片、糖分子微阵列芯片、聚合物微阵列芯片。
本发明生物芯片可用于检测功能分子与选自下组物质的作用(如粘附或吸附作用):细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物。
本发明的生物芯片不仅可以通过功能分子层吸附或粘附选自下组的物质:细胞、蛋白及多肽、微生物、核酸分子、糖分子、聚合物;而且连接的功能分子层还可以支持所连接物质的生长(例如支持细胞的生长和增殖),具有很高的安全性。
生物芯片基片或生物芯片的制备方法
本发明的生物芯片基片的制备方法包括步骤:
(1)预处理基底片:清洗基底片表面后用UV照射基底片表面(使其获得较多羟基),从而得到表明经预处理的基底片;
步骤(1)中,所述UV照射为在波长为100-400nm的紫外光下照射,优选为254nm和185nm。
步骤(1)所述的清洁玻璃表面并产生大量羟基的方法为紫外照射,UV低压紫外汞灯能同时发射波长254nm和185nm的紫外光,这两种波长的光子能量可以直接打开和切断有机物分子中的共价键,使有机物分子活化,分解成离子、游离态原子、受激分子等。与此同时,185nm波长紫外光的光能量能将空气中的氧气分解成臭氧;而254nm波长的紫外光的光能量能将臭氧分解成氧气和活性氧,这个光敏氧化反应过程是连续进行的,在这两种短波紫外光的照射下,臭氧会不断的生成和分解,活性氧原子就会不断的生成,而且越来越多,由于活性氧原子有强烈的氧化作用,与活化了的有机物(即碳氢化合物)分子发生氧化反应,生成挥发性气体(如CO2,H2O等)逸出物体表面,从而彻底清除了粘附在物体表面上的有机污染物,并产生大量羟基。
步骤(1)中,所述清洗为用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗。
步骤(1)中,所述UV照射的时间为15-30分钟,优选为25分钟。
步骤(1)中,所述UV照射的高度为20-40毫米,优选为35毫米。
(2)引入活性氨基层:将表明经预处理的基底片与活性氨基化合物进行反应,在基底片表面引入活性氨基后,对基片进行退火处理,从而得到表面引入活性氨基层的基片;
步骤(2)中,所述活性氨基化合物的反应浓度为0.2%-5%(V/V),优选为2%(V/V)。
步骤(2)中,所述活性氨基化合物为3-氨丙基二乙氧基硅烷。
步骤(2)中,在基片表面引入活性氨基后和对基片进行退火处理之前还包括对基片进行清洗。所述清洗方式为溶剂清洗以及超声清洗中任意一种或两种组合清洗。所述溶剂清洗所用溶剂为去离子水、乙醇、甲苯、丙酮,交替清洗后用氮气吹干。
步骤(2)中,所述反应在选自下组的溶剂中进行:甲苯、乙腈、丙酮,优选为甲苯。
步骤(2)中,所述退火处理时间为3-6小时,优选为4小时。
步骤(2)中,所述反应时间为3-12小时,优选为8小时。
步骤(2)中,所述退火处理在80-100℃的真空环境下进行,优选为90℃。
(3)引入聚乙二醇层:将表面引入活性氨基层的基片与末端异功能化聚乙二醇进行反应,从而得到本发明的生物芯片基片。
步骤(3)中,所述末端异功能化聚乙二醇的一端端基为N-羟基琥珀酰亚胺,另一端端基为羟基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、叠氮、炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、巯基、生物素、金刚烷、环糊精中的任意一种。
步骤(3)中,所述反应用的溶剂为磷酸盐缓冲溶液、二甲基亚砜、乙腈、甲醇、乙醇、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷中的任意一种。
步骤(3)中,所述反应时间为1-5小时,优选为3小时。
(4)将本发明所述生物芯片基片与末端官能化的功能分子化合物进行反应,从而得到本发明的生物芯片。
步骤(4)中,所述末端官能化的功能分子的末端为卤素、羧基、活性酯基团、酰氯、环氧烷、巯基、烯烃基团、炔基、叠氮、马来酰亚胺、邻二硫吡啶基(OPSS)、环糊精、金刚烷中的任意一种。
步骤(4)中,所述末端官能化的功能分子的浓度为0.5mM-5mM,优选为2mM。
步骤(4)中,所述反应时间为4-12小时,优选为6小时。
在本发明中,基底片是生物芯片的基础,硅烷化的活性氨基基片的芯片开发中一个十分重要的环节。表面氨基的密度决定了最后功能分子的接枝密度,以及功能分子的活性是否显著。基底片表面氨基化是本发明的重点之一,传统的玻璃表面硅烷化都是用过将玻璃基片在浓硫酸与双氧水的混合溶液,俗称“食人鱼”溶液中浸泡甚至煮沸来进行玻璃基片的预处理。众所周知,浓硫酸和双氧水都具有强烈的危险性和腐蚀性,且对环境造成巨大污染。为了避免危险试剂的使用以及对环境的污染,本发明采用的是高效、环保的UV照射方式来对基底片进行预处理。UV照射固体表面后,表面的污染物有机分子被强的光能切断、氧化或老化,而后被分解成CO2和H2O等环境友好型且易挥发性物质,最终挥发消失,表面被清洗后的基底片其清洁度极高,照射后的表面还能形成有利于表面硅烷化的羟基。
在本发明中,聚乙二醇衍生物链主要用于连接基底片并提供末端活性基团,与要检测的功能分子连接,同时能够起到抗非特异性蛋白吸附和细胞粘附,降低背景的作用。然而聚乙二醇衍生物链的长短对生物芯片的功能影响很大,如果链段较短则无法抵御蛋白和细胞非特异性吸附和粘附,背景较高,难以筛选出优异的功能分子;如果链段过长,则末端活性基团易被包埋,导致功能分子接枝密度降低,无法体现其生物活性。
在本发明中,所述端基异功能化聚乙二醇衍生物的端基基团一端为N-羟基琥珀酰亚胺,另一端为羟基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、叠氮、炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、巯基、生物素、金刚烷、环糊精中的任意一种。聚乙二醇衍生物的末端功能化基团主要用于进一步的化学修饰,为了连接需要筛选的功能生物活性分子,不同末端基团可以有不同的化学修饰方法,但反应原理都是基本的化学共价或非共价键结合。
本发明的主要优点在于:
本发明的生物芯片用合适链长的PEG来获得一个既能抵制非特异性蛋白吸附和细胞粘附的表面,又能充分展示下一步接枝的功能分子的生物活性与功能。所述功能分子可以是具有良好细胞、蛋白等物质的粘附和吸附功能的高分子聚合物或功能多肽,还可以是具有生物功能的天然高分子,如壳聚糖、葡聚糖或其衍生物。
另外用无需特定氨基酸序列和多肽高级结构的尼龙-3聚合物,获得了具有促进成骨细胞粘附的功能,并能够媲美细胞粘附金标准RGD多肽。
在获得细胞粘附功能的同时,针对性的克服了ECM蛋白/多肽易被蛋白酶水解、制备困难、价格昂贵等缺点。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1一种微阵列用活性氨基修饰的基片的制备方法,包括步骤如下:
步骤(1),玻璃基片预处理:将玻璃基片依次用丙酮,乙醇,去离子水超声清洗5分钟,氮气吹干后置于UV臭氧机中在185nm和254nm下照射20分钟。
步骤(2),将步骤(1)得到的预处理后的玻璃基片与体积浓度为2%的3-氨丙基二乙氧基硅烷的无水甲苯溶液充分反应8小时,引入活性氨基基团。然后用丙酮、乙醇、去离子水冲洗玻璃基片,氮气吹干后置于90度真空干燥器中退火4小时,然后冷却至室温得到微阵列用活性氨基修饰基片。
通过接触角测试,活性氨基修饰基片的接触角为92°,椭圆偏振测试其干态厚度为4.05nm。
实施例2一种微阵列用OEG4修饰基片的制备方法,包括步骤如下:
将实施例1制得的活性氨基修饰的基片浸入5mg/ml的一端端基为N-羟基琥珀酰亚胺的OEG4的PBS溶液,反应3小时后,用去离子水清洗干净,氮气吹干得到OEG4修饰的玻璃基片。
通过接触角测试,OEG4修饰基片的接触角为49°,椭圆偏振测试其干态厚度为5.24nm。
实施例3一种微阵列用OEG8修饰基片的制备方法,包括步骤如下:
实验方法同实施例2,不同点在于,用OEG8替换OEG4,OEG8浓度为10mg/ml。
通过接触角测试,OEG8修饰基片的接触角为46°,椭圆偏振测试其干态厚度为5.47nm。
实施例4一种微阵列用PEG-2K修饰基片的制备方法,包括步骤如下:
实验方法同实施例2,不同点在于,用PEG2K替换OEG4,PEG2K浓度为10mg/ml。
通过接触角测试,PEG2K修饰基片的接触角为36°,椭圆偏振测试其干态厚度为6.38nm。
实施例5微列阵用OEG4修饰基片对成纤维细胞的粘附作用,包括步骤如下:
按实施例2的方法制备OEG4修饰的基片,然后将该玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将成纤维细胞(NIH 3T3)酶解2-3分钟,待细胞脱落,用3mlDMEM培养基终止酶解,并将成纤维细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,弃去上清液,加入新的培养基,得到细胞悬液。然后将细胞悬液稀释至1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。24小时后移除培养基,用Live/Dead染色,在荧光显微镜下观察细胞的粘附情况。
结果发现大部分细胞能够粘附,铺展。
实施例6微列阵用OEG8修饰基片对成纤维细胞的粘附作用,包括步骤如下:
按实施例3的方法制备OEG8修饰的基片,然后将该玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将成纤维细胞(NIH 3T3)酶解2-3分钟,待细胞脱落,用3mlDMEM培养基终止酶解,并将成纤维细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,弃去上清液,加入新的培养基,得到细胞悬液。然后将细胞悬液稀释至1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。24小时后移除培养基,用Live/Dead染色,在荧光显微镜下观察细胞的粘附情况。
结果发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
实施例7微列阵用OEG8修饰基片对内皮细胞的粘附作用
实验方法同实施例6,不同点在于,用人血管内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC)替换了成纤维细胞(NIH 3T3)。
结果显示:发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
实施例8微列阵用OEG8修饰基片对平滑肌细胞的粘附作用
实验方法同实施例6,不同点在于,用人血管平滑肌细胞(human vascular smoothmuscle,SMCs)替换成纤维细胞(NIH 3T3)。
结果显示:发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
实施例9微列阵用OEG8修饰基片对成骨细胞的粘附作用
实验方法同实施例6,不同点在于,用成骨细胞(MC-3T3-E1)替换了成纤维细胞(NIH 3T3fibroblast)。
结果显示:发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
实施例10微列阵用OEG8修饰基片对干细胞的粘附作用
实验方法同实施例6,不同点在于,用骨髓间充质干细胞(BMSCs)替换了成纤维细胞(NIH 3T3fibroblast)。
结果显示:发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
实施例11微列阵用PEG2K修饰基片对成纤维细胞的粘附作用,包括步骤如下:
按实施例4的方法制备PEG2K修饰的基片,然后将该玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将成纤维细胞(NIH 3T3)酶解2-3分钟,待细胞脱落,用3mlDMEM培养基终止酶解,并将成纤维细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,弃去上清液,加入新的培养基,得到细胞悬液。然后将细胞悬液稀释至1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。24小时后移除培养基,用Live/Dead染色,在荧光显微镜下观察细胞的粘附情况。
结果发现表面几乎没有细胞,剩余的个别细胞也是呈圆球状。
由上述结果可知,基片表面经OEG8或PEG2K修饰后消除了非特异性细胞粘附对后续功能性聚合物的细胞粘附实验的影响。
实施例12在OEG8修饰基片上接枝尼龙-3聚合物DM-CO系列或DM-CH系列
按实施例3的方法制备OEG8修饰的基片,将OEG8修饰的玻璃基片浸入2mg/ml的尼龙-3聚合物PBS溶液中,反应6小时后,用乙醇、去离子水清洗,氮气吹干即可。
尼龙-3聚合物(DM-CO系列)和尼龙-3聚合物(DM-CH系列)的制备方法参见Liu R.,Chen X.和Gellman S.H.等,可以选择性培养内皮细胞的尼龙-3聚合物(Nylon-3Polymersthat Enable Selective Culture of Endothelial Cells)[J].Journal of theAmerican Chemical Society,2013,135(44):16296.和Qian Y.,Qi F.和Chen Q.等,模拟宿主防御肽的β-多肽聚合物修饰表面实现高效接触式杀菌(Surface Modified with aHost Defense Peptide-Mimickingβ-Peptide Polymer Kills Bacteria on Contactwith High Efficacy).[J].Acs Appl Mater Interfaces,2018.。
具体地,DM-CH参见文献Qian Y.,Qi F.和Chen Q.等,模拟宿主防御肽的β-多肽聚合物修饰表面实现高效接触式杀菌(Surface Modified with a Host Defense Peptide-Mimickingβ-Peptide Polymer Kills Bacteria on Contact with High Efficacy).[J].Acs Appl Mater Interfaces,2018中的单体/聚合物合成部分。DM-CO的合成与DM-CH类似,在合成过程中只需要把单体CH替换成单体CO即可。
实施例13在OEG8修饰基片上接枝尼龙-3聚合物(DM-CO系列)后检测对成骨细胞的粘附效果
将尼龙-3修饰的玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将成骨细胞(MC-3T3-E1)酶解2-3分钟,待细胞脱落用3mlα-MEM培养基终止酶解,并分别将细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,异去上清液,加入新的培养基,得到成骨细胞悬液。然后将三种细胞悬液稀释到1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。24小时后移除培养基,用Live/Dead染色,在荧光显微镜下观察细胞的粘附情况。
结果显示:在接枝OEG8的表面,可以观察到成骨细胞基本上不粘附,在OEG8表面进一步接枝了尼龙-3的表面,成骨细胞能够很好的粘附、铺展。
实施例14在OEG8修饰基片上接枝尼龙-3聚合物(DM-CO系列)后检测对成骨细胞的增殖效果
将尼龙-3修饰的玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将成骨细胞(MC-3T3-E1)酶解2-3分钟,待细胞脱落用3mlα-MEM培养基终止酶解,并分别将细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,异去上清液,加入新的培养基,得到成骨细胞悬液。然后将三种细胞悬液稀释到1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。在细胞生长至1天,3天,5天三个时间节点时,将培养基移除,孵育含有10%Alamer Blue的细胞培养基,孵育4小时后,在酶标仪下检测其荧光强度(λex=560nm,λem=590nm)。
结果显示:第一天测得的荧光强度为589,第三天测得的荧光强度为1732,第五天测得的荧光强度为9483,说明尼龙-3修饰的表面能够支持成骨细胞的生长,增殖。
实施例15在OEG8修饰基片上接枝尼龙-3聚合物(DM-CH系列)后检测对干细胞的粘附效果
将尼龙-3修饰的玻璃基片置于细胞培养皿中,用0.5ml胰酶将骨髓间充质干细胞(BMSCs)酶解2-3分钟,待细胞脱落用3mlα-MEM培养基终止酶解,并分别将细胞轻轻吹打下来,细胞液在1200rpm下离心4分钟,异去上清液,加入新的培养基,得到成骨细胞悬液。然后将三种细胞悬液稀释到1×105个/毫升,滴加到玻璃表面,将玻璃片置于37°培养箱孵育两小时后加入15ml培养基,使玻璃片浸没。24小时后移除培养基,用Live/Dead染色,在荧光显微镜下观察细胞的粘附情况。
结果显示:在接枝OEG8的表面,可以观察到骨髓间充质干细胞基本上不粘附,在OEG8表面进一步接枝了尼龙-3的表面,骨髓间充质干细胞能够很好的粘附、铺展。
实施例16在OEG8修饰基片上接枝尼龙-3聚合物后检测对纤连蛋白(FN)的吸附
用含有10%FBS的α-MEM培养基滴加到尼龙-3聚合物修饰的玻璃表面,将其置于37°培养箱中孵育两小时。浸入PBS中置于摇床上轻晃3分钟,重复3次,洗去未粘附的蛋白。然后用3%BSA封闭半小时,浸入PBS中置于摇床上轻晃3分钟,重复3次。再用纤连蛋白一抗4°孵育表面,过夜。孵育结束,浸入PBS中置于摇床上轻晃3分钟,重复3次,洗去未粘附的抗体。再次用3%BSA封闭半小时,最后用带有荧光染料的二抗,室温孵育2小时。通过荧光扫描仪计算表面的荧光强度,从而获得表面蛋白的吸附量。
结果显示:在OEG8表面相对荧光强度为4×103,而尼龙-3聚合物表面的相对荧光强度为8×103。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (20)
1.一种低背景的细胞检测用生物芯片,其特征在于,包括:
一基片,所述基片包括基底片和修饰层,所述修饰层包括活性氨基层和聚乙二醇层;所述活性氨基层通过共价键连接在基底片上,所述聚乙二醇层通过共价键连接在活性氨基层上;其中,所述聚乙二醇含有7-12个乙二醇单元;和
功能分子层,所述功能分子层连接在所述聚乙二醇层上。
2.如权利要求1所述的生物芯片,其特征在于,所述基底片为玻璃基片。
3.如权利要求1所述的生物芯片,其特征在于,所述聚乙二醇含有8-12个乙二醇单元。
4.一种根据权利要求1所述生物芯片的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(1)预处理基底片:清洗基底片表面后用UV照射基底片表面,从而得到表明经预处理的基底片;
(2)引入活性氨基层:将表面经预处理的基底片与活性氨基化合物进行反应,在基底片表面引入活性氨基后,对基片进行退火处理,从而得到表面引入活性氨基层的基片;
(3)引入聚乙二醇层:将表面引入活性氨基层的基片与末端异功能化聚乙二醇进行反应,和
(4)然后将功能分子与所述末端异功能化聚乙二醇相连接,以形成功能分子层,从而得到权利要求1所述生物芯片。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述活性氨基化合物为3-氨丙基二乙氧基硅烷。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述退火处理在80-100℃的真空环境下进行。
7.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述末端异功能化聚乙二醇的一端端基为N-羟基琥珀酰亚胺,另一端端基为羟基、马来酰亚胺、丙烯酸酯、叠氮、炔基、邻二硫吡啶基、巯基、生物素、金刚烷、环糊精中的任意一种。
8.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述功能分子经末端官能化从而与所述末端异功能化聚乙二醇相连接。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,末端官能化的功能分子的一端末端为卤素、羧基、活性酯基团、酰氯、环氧烷、巯基、烯烃基团、炔基、叠氮、马来酰亚胺、邻二硫吡啶基、环糊精、金刚烷中的任意一种。
10.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述末端官能化的功能分子的一端末端为卤素、巯基或马来酰亚胺。
11.一种高通量筛选功能分子的方法,其特征在于,包括步骤:
(a) 测试如权利要求1所述生物芯片的空白基片与细胞相互作用;
(b) 将待筛选分子与权利要求1所述生物芯片的基片的聚乙二醇层连接,形成如权利要求1所述的生物芯片;
(c) 测试步骤(b)得到的芯片与细胞的相互作用;和
(d) 若步骤(a)的结果显示所述空白基片与细胞无相互作用或基本上无相互作用,而步骤(c)的结果显示步骤(b)得到的芯片与细胞有相互作用,则该待筛选分子为功能分子。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述功能分子为尼龙-3聚合物。
13.根据权利要求1所述生物芯片的用途,其特征在于,用于检测功能分子与细胞的作用。
14.一种检测方法,其特征在于,用权利要求1所述的生物芯片来检测细胞的粘附数量和细胞形态,且所述的生物芯片中的功能分子为尼龙-3聚合物。
15. 如权利要求14所述的检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(i) 将细胞接种于权利要求1所述的生物芯片并一起孵育。
16.如权利要求14所述的检测方法,其特征在于,所述的细胞选自下组:成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、干细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、软骨细胞。
17.一种细胞微阵列,其特征在于,其包括如权利要求1所述的生物芯片和接种于所述芯片的细胞。
18.一种如权利要求17所述的细胞微针列,其特征在于,所述的细胞选自下组:成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、干细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、软骨细胞。
19.一种如权利要求17所述的细胞微针列的制备方法,其特征在于,包括步骤:将细胞接种于根据权利要求1所述的生物芯片并一起孵育。
20.一种如权利要求17所述的细胞微针列的用途,其特征在于,用于检测细胞与功能分子的相互作用。
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