CN110947372A

CN110947372A - 一种毛细管表面氨基化方法

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Publication number: CN110947372A
Application number: CN201911292016.3A
Authority: CN
Inventors: 彭真真; 余建军; 韩子华
Original assignee: Chengdu Polytech Biological Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Polytech Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明公开了一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，S1，毛细管预处理使其羟基化；S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；S2步骤具体如下，a.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES(3‑氨丙基三乙氧基硅烷)的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；b.加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，本发明提供一种更为安全且高效的方法来实现羟基化过程，用更为绿色的试剂来替换掉氨基化过程中所涉及的有毒有害的甲苯、甲醇；所需的试剂更为简单、安全，操作也更加简便，更加节省时间。

Description

一种毛细管表面氨基化方法

技术领域

本发明涉及一种表面化学蛋白质固定技术领域，具体涉及一种毛细管表面氨基化方法。

背景技术

生物分子包被固相载体技术在生物学和生物化学的诸多领域都已得到了广泛的应用, 其中之一是免疫分析领域，与传统液相吸附和液相沉淀分离方法相比，固相分离技术在免疫分析中具有分离完全、高效和操作简便等特点，一经提出就受到人们的普遍重视，并已成为当前非均相免疫分析最主要和有效的分离手段之一，引用自《免疫分析固相化学偶联技术_徐韬》固相分离技术的关键是选择合适的固相载体以及连接固相和反应物的连接分子，当前使用最广泛的固相材质是聚苯乙烯，但随着科技发展和对技术要求的不断提高，聚苯乙烯作为固相载体的缺点也开始暴露，SCHONE等研究表明，抗原或抗体分子通过疏水作用和固相界面结合后，其分子构象的变化会发生改变，进而影响其生物学性质。且聚苯乙烯作为高聚物，缺乏结构上的刚性，在多种溶剂和反应物中都有一定的溶解度。

中国发明专利CN101750449A阐述了一种利用物理吸附或是化学键合法在毛细管内部固定一层或多层脂蛋白，该法所制得的脂蛋白毛细管涂层可保留脂蛋白的活性，具有良好的生物相容性，既可用于毛细管表面吸附的抑制和电渗调控，又可作为抗体和药物筛选、临床诊断的测试工具。

中国发明专利CN102980996B介绍了一种利用毛细管作为反应容器的化学发光免疫分析系统，具有反应体积小，检测速度快等优点。除此之外，毛细管作为固相载体，还具有一定的化学稳定性，基本不溶于有机溶剂的特性。

早期以及现在的固相分离技术大多是利用物理吸附原理，使结合标记物仅依靠疏水作用吸附在固相表面，技术也相对成熟，但近年来，随着免疫分析技术的不断发展，越来越多的生物分子很难或者根本不能靠物理作用吸附在固相表面，固相化学偶联技术成为人们新的选择。固相化学偶联技术主要是利用化学或物理方法对固相材料表面进行改性或化学修饰，引入活性基团，再通过合适的化学反应将生物分子通过共价键与固相表面连接。生物分子的固定在很大程度上依赖于基质表面的修饰。随着毛细管表面修饰研究的深入，其中，硅烷氨化是可以引入多种功能基团的最常用的修饰方法。

引用自《玻璃珠表面修饰氨基的新型固相合成载体的制备_王洁颖》,常规的毛细管表面氨基修饰可简单分为羟基化、氨基化两个步骤：

羟基化，即使毛细管表面暴露或引入更多羟基，以供与后续的硅烷偶联剂反应的过程。可操作的方法有多种，大致可分为两类：一是用酸加热浸泡，常用食人鱼溶液，即浓硫酸（98%）和双氧水（30%）以体积比为7:3（或3:1）的比例配制而成，加热温度为70~80℃，浸泡时间为30min~1h；二是用碱，用碱溶液实现羟基化没有通用的方法，文献中涉及到的有：加入1M氢氧化钾在120℃下活化3h、加入按体积比6:1:1制成的二次去离子水、氨水、和双氧水的溶液加热至80℃并保温5min、加入按体积比1:1:5制成的氨水、双氧水、和二次去离子水的溶液加热至70℃保温30min等。

氨基化，即硅烷偶联剂与毛细管表面羟基反应，引入氨基、实现修饰的过程。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）是最常使用的硅烷偶联剂，经过APTES修饰的毛细管可以用于酶和抗体等生物分子的固定。APTES 与毛细管的反应可分为无水和有水两种情况，在无水条件下，硅氧烷键直接与毛细管表面羟基反应实现修饰，硅氧烷键相互之间不会发生反应，APTES 分子之间不会缩合，易于实现单分子层的修饰；在有水条件下，由于APTES 的水解和自身缩合，在毛细管表面容易形成不规则多分子层，研究中使用较少。为增加毛细管的比表面积，张志胜等将枝形大分子聚酰胺-胺(PAMAM)引入到了毛细管的内壁修饰中，制得了一种高效、稳定且寿命长的毛细管柱。树枝状大分子达到一定的分子代数后表面会产生大量功能性端基，这大大提高了提高毛细管固定生物分子的效率。

具体的氨基化过程分为以下三步：

一、毛细管经预处理后，通入甲苯冲洗5min，再通入体积分数为10%的APTES的甲苯溶液, 然后置于烘箱中, 于110 ℃下恒温4 h后，依次用甲苯及甲醇冲洗，制得内壁硅烷化的毛细管；

二、通入体积分数为10%的丙烯酸甲酯甲醇溶液, 封口, 于烘箱中恒温40 ℃, 反应30h后用甲醇冲洗；

三、通入体积分数为20%的乙二胺的甲醇溶液, 封口, 恒温40 ℃, 反应35 h后依次用甲醇及水冲洗, 得到一代(1G )PAMAM 键合的毛细管。

重复步骤二、三即可得到多代枝形大分子PAMAM。氨基化修饰完成后，即可利用戊二醛或辛二酸二琥珀酰亚胺酯等偶联剂固定抗体或抗原分子。

然而，使用碱溶液进行羟基化没有相对标准的方法，文献中所使用到的碱溶液的种类、比例、反应温度、时间等都不尽相同，有学者在对比浓硫酸、食人鱼溶液、1M氢氧化钠等六种溶液的羟基化作用时发现，1M氢氧化钠的效果明显不如食人鱼溶液。

羟基化过程中使用的食人鱼溶液具有极强的腐蚀性，配制时需要佩戴手套，穿戴实验服，于通风橱中进行，增加了操作的难度。且在配制过程中，操作人员需严格遵守将双氧水溶液加入浓硫酸中，顺序不能颠倒，否则因反应过程剧烈放热，高浓度的过氧化氢可能有发生爆炸的危险。郑金颖等在通过测量处理前后二氧化硅表面羟基数的变化时发现，由于浓硫酸与过氧化氢具有强氧化性，可能会破坏二氧化硅表面的结构，从而导致表面羟基数减少。

氨基化过程中使用甲苯、甲醇作为溶剂和洗涤液，二者均对中枢神经系统具有麻醉作用，长期接触会给人体带来不可逆的伤害。且甲苯对环境也有严重的危害性，如果处理不当，对空气、水源都会造成污染。

因此，需要找到一种更加方便、安全，对人体和环境都友好的方法来实现毛细管的氨基化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更为安全且高效的方法来实现羟基化过程，用更为绿色的试剂来替换掉氨基化过程中所涉及的有毒有害的甲苯、甲醇；本发明所述方法所需的试剂更为简单、安全，操作也更加简便，更加节省时间。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，

S1，毛细管预处理使其羟基化；

S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；

其特征在于：

S2步骤具体如下，

a.经过S1步骤处理后的毛细管加入体积分数为8~12%的APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷) 的乙醇溶液，置于烘箱中60~80℃反应3~5h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；

b. 加入体积分数为8~12%的MMA（甲基丙烯酸甲酯）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干；

c．加入体积分数为15~25%的EDA（乙二胺）的乙醇溶液，置于烘箱中35~45℃反应20~24h，然后排掉毛细管内试剂，用无水乙醇洗3~5次，每次浸泡2~4min，吹干或烘箱中20~30℃过夜烘干。

其中，

S1具体步骤如下，毛细管中加入灭菌水，超声或上下震动排除管内气泡，确保毛细管中无气泡，然后置于烘箱中90~110℃恒温3~5h后，排掉毛细管内水分，再次放入烘箱中90~110℃干燥固定1~2h。

进一步优化，a步骤中，APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)体积分数为10%，置于70℃的烘箱中反应4 h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

进一步优化，b步骤中，MMA（甲基丙烯酸甲酯）的体积分数为10%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

进一步优化，c步骤中，EDA（乙二胺）体积分数为20%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

最后，将处理好的毛细管做好标记（批号和编号）并放入4℃冰箱干燥保存备用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供的优化方案通过加入灭菌水，90~110℃恒温3~5h的过程来实现毛细管的羟基化，规避了酸、碱等的使用，保证了操作过程的安全性。

（2）本发明提供的优化方案将乙醇作为溶剂，替换了甲苯、甲醇两种对人体和环境有严重危害的试剂，保证了操作人员的安全，更加环保。

（3）本发明提供的优化方案APTES的反应温度为60~80℃，丙烯酸甲酯和乙二胺的反应时间为20~24h，更高效、节能、易于控制。

（4）本发明提供的优化方案，无需使用酸碱，对操作人员的要求更低，不用配制羟基化溶液，直接使用灭菌水，大大提高了速度，简化了操作步骤。

（5）本发明提供的优化方案，避免了甲苯、甲醇的使用，保证了操作人员的安全，降低了对环境的污染。缩短了反应时间，有效节省了人力、物力、财力。

附图说明

图1为本发明线性论证时的拟合图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，S1，毛细管预处理使其羟基化；S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；其中，

S1具体步骤如下，

毛细管中加入灭菌水，超声或上下震动排除管内气泡，确保毛细管中无气泡，然后置于烘箱中90~110℃恒温3~5h后，排掉毛细管内水分，再次放入烘箱中90~110℃干燥固定1~2h。

S2步骤具体如下，

在本实施例a步骤中，APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)体积分数为10%，置于70℃的烘箱中反应4 h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

在本实施例b步骤中，MMA（甲基丙烯酸甲酯）的体积分数为10%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

在本实施例c步骤中，EDA（乙二胺）体积分数为20%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

下面结合对比例对本发明进行进一步说明：

（一）通过两种氨化方式分别处理毛细管

（1）对比例1：采用常规的方式处理毛细管

毛细管装管：将毛细管装入50ml离心管内（装量：300根/管），通过上下震动或借助镊子让毛细管竖直平铺一层于离心管中。

a.加入piranha溶液（H₂O₂：浓H₂SO₄=1:3），70℃超声浸泡30min。倒去piranha 溶液，去离子水清洗5次，干燥空气吹干或70℃烘干；

b.加入10%APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)-甲苯溶液110℃浸泡4h后，依次用甲苯及甲醇清洗3遍，吹干；

c. 加入10%MMA（甲基丙烯酸甲酯）-甲醇溶液40℃浸泡30h，甲醇清洗3遍，吹干；

d.加入20%EDA（乙二胺）-甲醇溶液40℃浸泡35h，依次用甲醇及水清洗3遍，吹干或70℃烘干。

（1）对比例2：采用本发明的方法处理毛细管

a.加入灭菌水（13ml/管，确保水浸没毛细管），放入烘箱中100℃空气浴4h，排掉毛细管内水分，再次放入烘箱中100℃干燥固定1h；

b.加入10%APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)-无水乙醇溶液。70℃浸泡4h后，无水乙醇清洗3遍，吹干；

c.加入10%MMA（甲基丙烯酸甲酯）-无水乙醇溶液40℃浸泡24h，无水乙醇清洗3遍，吹干；

d.加入20%EDA（乙二胺）-无水乙醇溶液40℃浸泡24h，无水乙醇清洗3遍，吹干或70℃烘干；然后将处理好的毛细管做好标记并放入4℃冰箱干燥保存备用。

（二）采用对比例1和对比例2中的毛细管固定犬细小病毒（CPV）抗体

其方法如下：

步骤1：待包被抗体溶液配制：称取4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用100mmol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH＝6.0±0.05)配制成浓度为4mg/mL的溶液；用100mmol/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液(pH＝6.0±0.05)稀释CPV抗体，并向其中加入浓度为4mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，使抗体和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的终浓度分别为10ug/ml、400ug/ml。

步骤2：将步骤1所配制的抗体包被液混匀后立即加入两种不同氨化方式处理的毛细管中，室温包被30min，包被完成后用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液（pH=7.4±0.5）洗去多余抗体溶液，干燥空气吹干。

步骤3：得到的毛细管用封闭液进行37℃封闭1.5小时，用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液（pH=7.4±0.5）洗去多余封闭液，干燥空气吹干，于2～8℃保存备用。

（三）采用对比例1及对比例2中已包被抗体毛细管相关性分析

取具有溯源性的标准品，将其依次稀释出至少7个浓度梯度，对每一浓度均重复测定至少2次，计算其平均值。

常规方法处理毛细管测值如下表所示：

本发明的方法处理毛细管测值如下表所示：

将两组均值进行相关性分析可知，其结果如图1所示，R²=0.9996＞0.99，说明本发明所述毛细管氨化方法可以达到常规氨化方法能达到的效果。

Claims

1.一种毛细管表面氨基化方法，包括如下步骤，

S1，毛细管预处理使其羟基化；

S2，将羟基化处理后的毛细管进行氨基化；

其特征在于：

S2步骤具体如下，

2.根据权利要求1所述的一种毛细管表面氨基化方法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的一种毛细管表面氨基化方法，其特征在于：a步骤中，APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)体积分数为10%，置于70℃的烘箱中反应4 h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

4.根据权利要求1所述的一种毛细管表面氨基化方法，其特征在于：b步骤中，MMA（甲基丙烯酸甲酯）的体积分数为10%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。

5.根据权利要求1所述的一种毛细管表面氨基化方法，其特征在于：c步骤中，EDA（乙二胺）体积分数为20%，40℃烘箱反应24h，无水乙醇清洗3次，每次浸泡2min。