CN111579467B - 双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用。所述的双功能氧化石墨烯复合材料以氧化石墨烯为初始载体，一重功能化为接枝可在生理条件下识别细胞膜表面糖蛋白的硼酸单体，另一重功能化为装载酚酞显色剂。在使用方面，首先将双功能化氧化石墨烯复合纳米材料加入培养有贴壁细胞的细胞培养板中，孵育一段时间后，用磷酸盐缓冲液洗去未结合的双功能氧化石墨烯复合材料，调节pH并使用酶标仪测定吸光度，即可实现对该细胞培养板上待测细胞数目进行定量检测的目的。本发明提供的双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用，材料制备过程简单、成本低廉，检测方法方便快捷、稳定性良好，可以对贴壁细胞进行定量检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用。具体来说，它是以氧化石墨烯作为起始载体，首先在其表面修饰氨基位点，然后接枝可在生理条件下识别细胞膜表面糖蛋白的硼酸单体，最后通过π-π疏水作用在其表面装载pH调控的显色剂酚酞。将上述制备的双功能氧化石墨烯复合材料加入培养有贴壁细胞的细胞培养板中，室温下孵育，用磷酸盐缓冲液洗去未结合的材料后，调节pH为碱性，使用酶标仪测定吸光度，即可以实现定量检测培养板中贴壁细胞数目的目的。
背景技术
细胞数目检测在药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏实验中具有广泛的应用价值。目前较为常用的细胞活度检测方法有MTT法或Cell Counting Kit-8（CCK-8）法。例如，CCK-8法生成的甲瓒物与活细胞的数量成正比，通过检测反应产物的吸光度，可得到较为准确的活细胞数量。但目前市面上常见的CCK-8试剂盒普遍价格较高。因此，有必要开发专属性高且更为经济的细胞检测方法。
糖蛋白广泛存在于哺乳动物细胞膜表面，发挥着十分重要的生理功能。与普通细胞相比，肿瘤细胞的细胞膜表面会过度表达糖蛋白（参Yamamoto M., Takahashi T.,Serada S., Sugase T., Tanaka K., Miyazaki Y., Makino T., Kurokawa Y.,Yamasaki M., Nakajima K., Takiguchi S., Naka T., Mori M., Doki Y., Cancerscience, 2017, 108, 2052-2060）。糖蛋白的糖基含大量顺二羟基，而硼亲和材料对顺二羟基类化合物具有选择性识别作用（参见Chen G. S., Kou X. X., Huang S. M., HuangS. Y., Zhang R., Liu C., Chen J., Zhu F., Ouyang G. F., Advanced functionalmaterials, 2018, 28, 1804129）。硼亲和材料识别顺二羟基的pH值，取决于硼酸单体的pKa值。多数商品化硼酸单体的pKa值大于8，在生理条件下不能识别顺二羟基。2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸是一种较新的硼酸单体，其苯环上氟原子的电负性可以降低此硼酸单体的pKa值，因此2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸可在生理条件下特异性识别顺二羟基类物质（参见Xing R. R., Wang S. S., Bie Z. J., Bie Z. Y., He H., Liu Z., Natureprotocols, 2017, 12, 964-987）。
当前检测技术中，常用的信号放大方法有电化学或磁阻等，这些方法的共同缺陷是检测信号的输出需要操作复杂且价格昂贵的专用仪器。常用的酸碱指示剂在pH控制下可呈现出不同的颜色，通过肉眼观察或紫外-可见分光光度计测定即可对完成检测，但灵敏度和专属性均较差。氧化石墨烯拥有极大的比表面积，且其表面含有大量的羧基、环氧基等活性基团，便于共价接枝硼酸单体。
为了实现贴壁细胞的快速定量分析，本研究以细胞膜表面糖蛋白作为识别靶点，制备双功能氧化石墨烯复合材料。先在氧化石墨烯活性基团位点接枝硼酸单体，再在其表面装载酸碱指示剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用。以氧化石墨烯为起始载体，首先通过氨基与环氧基开环反应或氨基与羧基反应在其表面修饰氨基，然后通过氨基与醛基反应接枝可在生理条件下识别顺二羟基的硼酸单体，最后通过π-π疏水作用在其装载酸碱指示剂。双功能氧化石墨烯复合材料可以对膜表面含糖蛋白的细胞进行定量检测，可以克服现有细胞检测方法价格昂贵、操作步骤繁琐的缺点。本发明的细胞检测方法与通用的细胞检测方法相比，检测的专属性、灵敏度较高，操作步骤简便，价格低廉，更容易广泛推广使用。
本发明提供的一种双功能氧化石墨烯复合材料，其原料的质量百分数组成：
（一）表面修饰氨基位点氧化石墨烯原料的质量百分数：
氧化石墨烯 14-20%
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 14-21%
N-羟基丁二酰亚胺 32-38%
1,6-已二胺 24-32%
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
（二）硼酸接枝氧化石墨烯原料的质量百分数：
表面修饰氨基位点氧化石墨烯 0.04-0.08%
2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸 0.08-0.013%
牛血清白蛋白 0.087-0.093%
乙醇 88-93%
双蒸水 8.4-9.1%
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
（三）装载酚酞硼亲和氧化石墨烯原料的质量百分数：
硼酸接枝氧化石墨烯 0.04-0.08%
酚酞 0.7-1.4%
二甲基亚砜 92-99%
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
本发明提供双功能化氧化石墨烯复合材料的制备方法具体经过下列步骤：
1）按计量将氧化石墨烯分散在2-吗啡磺酸缓冲液（pH＝6.0, 10 mM）中，超声至氧化石墨烯完全分散后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温下轻微摇动10-15 h，进行活化。活化后，氧化石墨烯用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4,10 mM）洗涤3次，最后分散在磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）中，加入1,6-己二胺在室温下振荡10-15 h，用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）洗涤3次，并再次分散于磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）中，得到表面修饰氨基位点的氧化石墨烯。
2）按计量将2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸加入步骤1）所得修饰氨基位点的氧化石墨烯中，在室温下振荡10-15 h，用乙醇洗涤3次后分散于乙醇中，再加入溶于双蒸水的牛血清白蛋白溶液钝化2-5 h。用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）洗涤3次，并再次分散于磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）中，得到硼酸接枝的氧化石墨烯。
3）按计量将酚酞溶于二甲基亚砜中，加入步骤2）所得硼酸接枝的氧化石墨烯中，室温振荡10-15 h。用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）洗涤3次后，分散在磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）中，在4 ℃下保存，得到装载酚酞的硼亲和氧化石墨烯，即双功能氧化石墨烯复合材料。
本发明提供双功能氧化石墨烯复合材料检测贴壁细胞(viable adherent cells)的方法具体经过下列步骤：
1）弃去细胞培养板中细胞原培养基，用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）淋洗3次以完全除去原细胞培养基、未贴壁的细胞以及细胞碎片。
2）加入上述制备的双功能氧化石墨烯复合材料（以氧化石墨烯质量计大于20 μg/105个细胞），室温下孵育25-35 min，结束后用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）淋洗。
3）加入氢氧化钠溶液（pH=12.0），显色1 min后，通过酶标仪测定553 nm处的吸光度值。
本发明提供了双功能氧化石墨烯复合材料的制备方法及贴壁细胞的检测方法，利用三步反应合成pH响应的硼酸功能化/装载酚酞的氧化石墨烯复合材料，不仅可以提高对贴壁细胞定量检测的灵敏度，引用试剂较少、价格低廉，并且在检测过程中操作简便，结果稳定性好。
通过检测不同数目肝癌HLE细胞的结果表明，本发明制备的双功能氧化石墨烯复合材料用于检测贴壁细胞数量的结果良好。与基于间氨基苯硼酸制备的双功能氧化石墨烯复合材料相比，基于2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸制备的双功能氧化石墨烯复合材料可显著降低与顺二羟基作用的pH值，使硼亲和材料适用于在生理条件下的细胞显色。
通过对所制备的双功能氧化石墨烯复合材料在检测过程中的用量、与肿瘤细胞共孵育时间及显色pH值的考察，优化出最佳检测条件。本发明制备双功能氧化石墨烯复合材料的物理和化学性质稳定，显色后稳定性良好，可广泛用于贴壁细胞的定量检测。
总之，本发明涉及一种双功能氧化石墨烯复合材料的制备及其检测贴壁细胞的应用。该材料的细胞检测方法与通用的细胞检测方法相比，检测的专属性、灵敏度较高，制备过程操作步骤简便，价格低廉。由于检测方法快捷、稳定性好，可对贴壁细胞进行定量检测，容易推广使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的双功能氧化石墨烯复合材料的透射电镜表征图。
图2氧化石墨烯（a）、表面修饰氨基位点氧化石墨烯（b）和硼酸接枝氧化石墨烯（c）的红外表征图。
图3 为不同浓度双功能氧化石墨烯复合材料分别用于检测0.5*106个HLE（a）和Hep3B（b）细胞的吸光度结果图。
图4为双功能氧化石墨烯复合材料与HLE细胞孵育时间和显色后吸光度关系图。
图5为不同浓度双功能氧化石墨烯复合材料用于检测0.5*106个HLE（a）和Hep3B（b）细胞过程中pH调节值与吸光度的关系图。
图6为双功能氧化石墨烯复合材料用于检测0.5*106个HLE（a）和Hep3B细胞（b）过程中显色不同时间的吸光度结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
双功能氧化石墨烯复合材料的制备，首先利用氧化石墨烯表面环氧基或羧基等活性基团与1,6-己二胺的氨基反应，在氧化石墨烯表面进行氨基位点修饰，其次接枝2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸，最后将酚酞通过π-π疏水作用装载于氧化石墨烯表面；并对制备的双功能氧化石墨烯复合材料进行透射电镜表征和红外表征，具体操作步骤如下：
第一步：将氧化石墨烯18.2%（均为质量分数）分散在适量 2-吗啡磺酸溶液（pH=6.0, 10 mM）中，室温超声，至氧化石墨烯分散均匀（超声电功率150瓦），加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐18.4%和N-羟基丁二酰亚胺34.7%，室温下轻微摇动10-15h。用磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4, 10 mM）洗涤活化后的氧化石墨烯3次，每次洗涤后离心(10000 rpm，15 min)弃去上清液，之后分散在与2-吗啡磺酸溶液等体积的磷酸缓冲盐溶液中(pH 7.4, 10 mM)，加入 1,6-己二胺28.7%，在室温下振荡10-15 h，即得表面修饰氨基位点的氧化石墨烯。
第二步：向上一步反应后的氧化石墨烯分散系中加入2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸0.13%，在室温下振荡10-15 h，用乙醇洗涤3次后，分散于乙醇91%，加入溶有牛血清白蛋白0.11%的双蒸水8.76%，钝化2-5 h。用磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4, 10 mM）洗涤三次后，再分散于磷酸缓冲盐溶液中（pH 7.4, 10 mM），即得硼酸接枝的氧化石墨烯。
第三步：将酚酞1.2%溶于二甲基亚砜98.8%中，加入到硼酸接枝的氧化石墨烯分散系中，室温下振荡10-15 h，用磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4, 10 mM）洗涤3次后，最后分散于磷酸缓冲盐溶液中（pH 7.4, 10 mM），于4 ℃保存，即得装载酚酞的硼亲和氧化石墨烯，即双功能氧化石墨烯复合材料。
红外表征：使用傅里叶变换红外光谱仪表征氧化石墨烯材料，证明硼酸单体成功与氧化石墨烯骨架相连。如图2所示，接枝1,6-己二胺后的氧化石墨烯出现了新的吸收峰，N-H面内弯曲和C-N伸缩振动的重合峰1550 cm-1和N-H面外弯曲峰1020 cm-1；与2,4-二氟-4-甲酰基苯硼酸结合后出现苯环1，2，3，4四取代吸收峰860 cm-1、B-O伸缩振动峰1318 cm-1和O-H面内弯曲峰1400 cm-1，证明硼酸基团已经成功通过1,6-己二胺与石墨烯骨架相连。
实施例2
基于双功能氧化石墨烯复合材料的贴壁细胞检测，首先将细胞与双功能氧化石墨烯复合材料共孵育，除去未结合的双功能氧化石墨烯复合材料后，通过加入碱液调节pH。其中对双功能氧化石墨烯复合材料的用量、与贴壁细胞共同孵育时间及碱液pH值进行考察并优化。具体操作步骤如下：
同上述实施例1中的方法合成双功能氧化石墨烯复合材料。
双功能氧化石墨烯复合材料检测贴壁细胞操作步骤如下：
首先弃去细胞培养板中细胞原培养基，用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）淋洗。加入上述制备的双功能氧化石墨烯复合材料，室温下与待测细胞共同孵育，孵育结束后用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）淋洗。加入氢氧化钠溶液（pH=12.0）调节pH值。显色后根据所用细胞培养板的规格及型号设定酶标仪参数，并将检测波长设定为553 nm，测吸光度值。
离体的细胞的培养：人肝癌HLE细胞系与Hep3B细胞系在10 cm细胞培养皿中用DMEM全培养基（含10%血清）培养。实验前取对数生长期的HLE和Hep3B细胞5*105个用无血清DMEM培养基铺入12孔细胞培养板中，37 ℃培养3小时使其贴壁。
不同浓度双功能氧化石墨烯复合材料的配制：将实施例1中制备的材料用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4, 10 mM）分别稀释至质量（以氧化石墨烯质量计）为0 μg mL-1、20 μg mL-1、40μg mL-1、60 μg mL-1、80 μg mL-1、100 μg mL-1、120 μg mL-1。
不同pH的氢氧化钠溶液配制：分别用双蒸水配制pH为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的氢氧化钠溶液。
图3表明，双功能氧化石墨烯复合材料用于检测细胞的显色吸光度，首先随着双功能氧化石墨烯复合材料用量增加而升高，而后达到饱和。在0至100 μg mL-1范围内，细胞表面糖蛋白多于双功能氧化石墨烯复合材料表面的硼酸吸附位点，吸光度随着所用双功能氧化石墨烯复合材料用量的增加而持续增加；而当双功能氧化石墨烯复合材料的用量大于100 μg mL-1时，硼酸位点相对于细胞表面糖蛋白过量，吸光度不再上升，达到饱和。而对于人肝癌HLE细胞系和Hep3B细胞系而言，两者达到饱和的双功能氧化石墨烯复合材料浓度相近。
图4表明，对于人肝癌HLE细胞系，随着孵育时间的延长，双功能氧化石墨烯复合材料用于检测细胞的显色吸光度，呈现出先增加后平稳的趋势。0-30分钟内，在室温条件下，硼酸位点与细胞表面糖蛋白充分接触吸附，随着时间的延长吸附量逐渐增加；30分钟之后硼酸位点与细胞表面糖蛋白完全结合，随着时间的延长吸光度不再继续增加。
图5表明，双功能氧化石墨烯复合材料表面装载的酚酞脱落进行显色所需的pH值在7.0-14.0之间，呈现出先增加后降低的趋势，且在pH=12.0时达到最大值。而对于人肝癌HLE细胞系和Hep3B细胞系而言，两者的最优pH值相同。
实施例3
双功能氧化石墨烯复合材料显色后吸光度的稳定性研究主要反映了该方法对贴壁细胞定量检测的精密度和稳定性。
同上述实施例1中的方法合成双功能氧化石墨烯复合材料。
同上述实施例2中的方法进行双功能氧化石墨烯复合材料检测贴壁细胞操作。
离体细胞的培养：人肝癌HLE细胞系与Hep3B细胞系在10 cm细胞培养皿中用DMEM全培养基（含10%血清）培养。实验前取对数生长期的HLE和Hep3B细胞5*105个用无血清DMEM培养基铺入12孔细胞培养板中，37 ℃培养3小时使其贴壁。
图6表明，本发明制备的双功能氧化石墨烯复合材料用于人肝癌HLE细胞和Hep3B细胞显色，吸光度值在0至30小时之内基本保持不变，稳定性良好。
本发明提供了一种双功能氧化石墨烯复合材料及其检测贴壁细胞的应用。所述的双功能氧化石墨烯复合材料以氧化石墨烯为初始载体，一重功能化为接枝可在生理条件下识别细胞膜表面糖蛋白的硼酸单体，另一重功能化为装载酚酞显色剂。用于贴壁细胞的检测，在检测过程中注意洗涤过量的双功能氧化石墨烯复合材料。本发明材料制备过程简单、成本低廉，检测方法方便快捷、稳定性良好，可以对贴壁细胞进行定量检测，具有广阔的应用前景。
Claims (2)
1.一种双功能氧化石墨烯复合材料用于检测贴壁细胞的应用，所述的双功能氧化石墨烯复合材料的制备方法经过下列步骤：
1）按计量将氧化石墨烯分散在pH＝6.0, 10 mM 2-吗啡磺酸缓冲液中，超声至氧化石墨烯完全分散后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，室温下轻微摇动10-15 h进行活化；用pH=7.4, 10 mM磷酸盐缓冲液洗涤活化后的氧化石墨烯3次，最后分散在磷酸盐缓冲液中，加入1,6-己二胺在室温下振荡10-15 h，得到表面修饰氨基位点的氧化石墨烯；
2）按计量将2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸加入步骤1）所得表面修饰氨基位点的氧化石墨烯中，在室温下振荡10-15 h，用乙醇洗涤3次后分散于乙醇中，再加入溶于双蒸水的牛血清白蛋白溶液钝化2-5 h；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，并再次分散于磷酸盐缓冲液中，得到硼酸接枝的氧化石墨烯；
3）按计量将酚酞溶于二甲基亚砜中，加入步骤2）所得硼酸接枝的氧化石墨烯中，室温振荡10-15 h；用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，分散在磷酸盐缓冲液中，在4 ℃下保存，得到装载酚酞的硼亲和氧化石墨烯，即双功能氧化石墨烯复合材料；
所述的双功能氧化石墨烯复合材料原料的质量百分数组成：
（一）表面修饰氨基位点氧化石墨烯原料的质量百分数：
氧化石墨烯 14-20%
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 14-21%
N-羟基丁二酰亚胺 32-38%
1,6-已二胺 24-32%
上述的各原料的质量组成之和为100 %；
（二）硼酸接枝氧化石墨烯原料的质量百分数：
表面修饰氨基位点氧化石墨烯 0.04-0.08%
2,4-二氟-3-甲酰基苯硼酸 0.08-0.013%
牛血清白蛋白 0.087-0.093%
乙醇 88-93%
双蒸水 8.4-9.1%
上述的各原料的质量组成之和为100 %；
（三）装载酚酞硼亲和氧化石墨烯原料的质量百分数：
硼酸接枝氧化石墨烯 0.04-0.08%
酚酞 0.7-1.4%
二甲基亚砜 92-99%
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于具体经过下列步骤：
1）弃去细胞培养板中细胞原培养基，用pH=7.4, 10 mM磷酸盐缓冲液淋洗；
2）加入双功能氧化石墨烯复合材料，以氧化石墨烯质量计20 μg /105个细胞，室温下孵育30 min，结束后用磷酸盐缓冲液淋洗；
3）加入氢氧化钠溶液调pH=12.0，显色1 min后，通过酶标仪测定553 nm处的吸光度值。
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