CN107402198A - 一种基于多巴胺聚合反应调控的上转换荧光共振能量传递检测组合物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种上转换荧光共振能量传递检测组合物及检测方法,所述方法中采用无油酸配体的上转换荧光纳米材料作为荧光供体,有效缩短了荧光供体和荧光受体之间的能量转移距离,猝灭能力优异,可以有效提高检测灵敏度。不仅如此,本发明采用的上转换荧光共振能量传递体系可以有效避免生物复杂体系中本底荧光的干扰,可以用于过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测,也可以进一步实现对血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测,具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、经济实用等优点,可为解决复杂体系中过氧化氢和葡萄糖的实时监测提供理论依据和技术支持,具有一定的临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种基于多巴胺聚合反应调控的上转换荧光共振能量传递检测过氧化氢和葡萄糖的组合物及检测方法。
背景技术
随着社会的进步和生活水平的提高,国内乃至全球范围内糖尿病的发病率逐年提高,已成为严重危害人体健康的疾病。我国糖尿病患者眼、肾、神经并发症在世界上发生的最早、最多、最严重,并引起了社会的高度关注。目前医学上没有彻底根治糖尿病的方法,减缓糖尿病并发症的常用治疗方法是对人体注射胰岛素。血糖浓度的高低是确诊是否罹患糖尿病的最直接证据,并且可以用于临床治疗效果的动态跟踪,从而有助于病情的及时处理与缓解。因此,在复杂体系中实现精准快速的血糖浓度检测,对糖尿病的诊断起重要作用。
血液是由血浆和血细胞组成的复杂体系。传统血糖分析检测中主要依赖于比色法、荧光法、电化学法等,这些方法对仪器和样品的要求都比较高,并且无法避免血液中复杂成分的干扰,使得这些方法无法实现对血糖浓度快速精准的直接检测。另外,传统血糖检测需要经过离心、电极清洗等前期处理,不仅操作繁琐耗时,而且会造成实际检测结果误差偏大等问题。
稀土掺杂上转换纳米材料具备在近红外光的激发下发射出可见光的独特性质。与传统有机染料和无机半导体纳米材料相比,上转换纳米材料具有发射峰窄、无自发荧光、近红外激发零背景、光稳定性好等优势,非常适合用于血糖浓度的直接检测,为发展便捷、经济、精准的血糖检测方法提供一种新思路。
近年来,绝大多数基于上转换荧光共振能量转移的传感器体系都需要将上转换纳米粒子进行表面修饰及功能分子嫁接,形成上转换纳米复合物后才能用于生物活性分子的检测。这样的检测模式依赖于上转换纳米复合物的设计与制备,会造成检测成本的增加和检测便捷性的降低,并且荧光供体和荧光受体之间的物理距离会降低检测的灵敏度。
因此,开发一种基于上转换荧光共振能量传递检测过氧化氢和葡萄糖的方法,用于复杂体系中过氧化氢和血糖水平的精准检测,达到快速简易、灵敏度高、选择性好、成本低的检测目的,是本发明的重点和意义所在。
发明内容
为了改善上述现有技术的不足,本发明提供了一种基于多巴胺聚合反应调控的上转换荧光共振能量传递检测方法,特别是提供一种基于多巴胺聚合反应调控的上转换荧光共振能量传递检测过氧化氢和葡萄糖的方法;本发明所述的方法只需通过简单混合即可实现血清或全血中过氧化氢和葡萄糖的高灵敏度、高选择性和低成本的检测。本发明还提供了一种组合物,所述组合物用于过氧化氢或与过氧化氢生成体系相关物质的检测。
一种上转换荧光共振能量传递检测方法,其特征在于,所述检测方法是以无配体水溶性上转换荧光纳米材料为荧光供体,以聚合多巴胺为荧光受体,所述检测方法包括如下步骤:
1)将上转换荧光纳米材料与水混合,得到荧光供体溶液;
2)将多巴胺单体与水混合,得到荧光受体的前体溶液;
3)将步骤1)的荧光供体溶液、步骤2)的荧光受体的前体溶液和缓冲液混合,孵育,测定混合液的上转换荧光强度,并计算荧光受体的前体溶液的荧光猝灭效率,选取荧光猝灭效率最大时混合液所对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度值;
4)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
优选地,所述标准曲线的绘制具体包括如下步骤:以步骤3)的荧光猝灭效率最大时对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的荧光供体溶液、标准浓度的荧光受体的前体溶液、缓冲液和不同浓度的待测目标物溶液混合,孵育;测定混合液的上转换荧光强度,绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
5)检测待测目标物的浓度;
优选地,所述检测具体包括如下步骤:将标准浓度的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的上转换荧光强度,代入步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,计算出未知浓度的待测目标物溶液的浓度。
根据本发明,任选地,步骤1)或2)所得的溶液中可进一步含有其他组分。
根据本发明,步骤1)中,所述荧光供体溶液的浓度为0.1-5.0mg/mL,例如为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、5.0 mg/mL;
优选地,所述上转换荧光纳米材料选自表面无有机配体(如油酸)且可水溶的上转换荧光纳米材料;
优选地,所述上转换荧光纳米材料选自粒径为1~1000nm的球形纳米材料;作为示例性地,所述粒径为20nm、50nm、80nm、100nm、200nm、300nm、 500nm、800nm;
作为实例,所述上转换荧光纳米材料可以选自NaYF4∶Yb,Er。但是,本领域技术人员应当可以理解,所述上转换荧光纳米材料不仅局限于此,也可应用于其他上转换材料,特别是上转换荧光纳米材料。
作为示例性地,所述上转换荧光纳米材料NaYF4∶Yb,Er中稀土离子 [Y3+]∶[Yb3+]∶[Er3+]的摩尔比为(50~98)∶(2~40)∶(0.5-10)。
根据本发明,步骤1)中,所述荧光供体溶液的制备具体包括如下步骤:将上转换荧光纳米材料超声分散于去离子水,制备得到所述荧光供体溶液。
根据本发明,步骤2)中,所述荧光受体的前体溶液的浓度为大于0mM且小于等于50mM;所述荧光受体选自聚合多巴胺;所述荧光受体的前体选自多巴胺单体。
根据本发明,步骤2)中,所述荧光受体的前体溶液的制备具体包括如下步骤:将多巴胺单体超声分散于去离子水,制备得到所述荧光受体的前体溶液。
根据本发明,步骤3)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为 1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液的浓度和体积为任意比例;优选为能够得到混合液的上转换荧光强度和荧光猝灭效率最大时混合液所对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度值即可。
根据本发明,步骤3)中,所述缓冲液选自Tris-HCl;所述缓冲液的浓度为 10mM,所述缓冲液的pH为8.5。
根据本发明,步骤3)中,所述荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液混合后,荧光受体的前体可以生成荧光受体并包覆在上转换荧光纳米材料表面,形成包覆型上转换纳米材料的复合物;
优选地,所述荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液的混合具体包括如下步骤:
3-1)将上转换纳米材料水溶液与多巴胺单体水溶液混合均匀,并定容于 50-1000μL的Tris-HCl缓冲溶液中,得到混合溶液;
3-2)将混合溶液于37℃恒温振荡混匀0.5-3小时,振荡过程中可以观察到溶液颜色从“无色-浅灰色-棕色-棕褐色”的变化过程,说明聚合多巴胺逐渐包覆在NaYF4∶Yb,Er纳米晶表面并且随着时间推移聚合多巴胺的厚度逐渐增加;
3-3)加入10μL 120mM的HCl溶液终止多巴胺聚合反应。
根据本发明,步骤4)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为 1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液、缓冲液和待测目标物溶液的浓度和体积为任意比例;例如所述待测目标物溶液的浓度为0~1000μM;优选为能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可。
根据本发明,步骤4)中,所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标,对应的荧光强度值为纵坐标进行绘制的;
根据本发明,步骤4)中,所述待测目标物选自可以抑制多巴胺单体发生聚合反应生成聚合多巴胺的物质;
优选地,所述待测目标物选自过氧化氢或可生成过氧化氢的生化体系如含有葡萄糖的生化体系如尿酸+尿酸酶体系、乳酸+乳酸过氧化物酶体系、次黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶等;
还优选地,所述待测目标物为血清或全血中的过氧化氢或可生成过氧化氢生化体系如含有葡萄糖的生化体系。
根据本发明,步骤5)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为 1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和待测目标物溶液的浓度和体积为任意比例;优选为能够得到在步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出上转换荧光强度的即可。
本发明还提供上述检测方法的用途,其用于过氧化氢或与过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测;还优选地,用于血清或全血样品中葡萄糖的检测。
本发明还提供一种组合物,所述组合物包含如下组分:
(1)上转换荧光纳米材料;(2)多巴胺单体;
根据本发明,所述上转换荧光纳米材料作为荧光供体;所示多巴胺单体作为荧光受体的前体。
根据本发明,所述组合物中,所述上转换荧光纳米材料所占的百分比为 0.01%-20%;所述多巴胺单体所占的百分比为80%-99.99%。
根据本发明,所述组合物用于过氧化氢或与过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测;
还优选地,用于血清或全血样品中葡萄糖的检测。
本发明还提供一种生物传感器,所述生物传感器包括上述的组合物。
本发明中,所述上转换荧光纳米材料在近红外光980nm激发下,在可见光区有最大发射,经酸洗后的上转换荧光纳米材料如NaYF4∶Yb,Er(UCNPs)表面带正电,易与多巴胺单体发生静电吸附;当体系中不存在过氧化氢时,多巴胺单体在碱性体系中易于发生自发氧化聚合反应,生成聚合多巴胺而吸附在 UCNPs表面;和多巴胺单体溶液不同,聚合多巴胺在300-700nm处具有极宽的光吸收,该混合体系是以NaYF4∶Yb,Er上转换纳米材料作为能量供体,聚合多巴胺作为能量受体,使得UCNPs与聚合多巴胺之间可以发生荧光共振能量传递,上转换荧光纳米材料的荧光被聚合多巴胺猝灭。
本发明中,所述无油酸配体水溶性上转换荧光纳米材料是将上转换荧光纳米材料采用酸洗处理的方法制备得到的,所述酸洗后的上转换纳米材料表面带正电荷的稀土离子Ln3+(其中Ln代表稀土元素,即元素周期表中第57号元素La 到71号元素Lu的15种元素)裸露出来使得所述荧光纳米材料可以均匀分散于水溶液中,所述无油酸配体水溶性上转换荧光纳米材料的制备方法具体包括如下步骤:
a)取15mL无水乙醇溶液,滴入适量盐酸,使其pH=1-5,例如为1、2、3、 4、5;
b)将30mg NaYF4∶Yb,Er粒径为1-1000nm的荧光纳米材料溶解于步骤a)的乙醇溶液,超声,清洗,制备得到无油酸配体水溶性上转换荧光纳米材料。
本发明中,所述的清洗包括先用pH=1-5,例如为1、2、3、4、5的乙醇溶液洗涤一次,再用无水乙醇及蒸馏水洗涤数次;所述清洗过程优选采用15000rpm 的转速离心10分钟,得到的酸洗后的荧光纳米材料为透明状,表明清洗效果良好。
申请人在本发明的研究发现,过氧化氢的存在可以有效抑制多巴胺单体向聚合多巴胺的转变,当体系中存在过氧化氢时,上转换荧光纳米材料表面吸附的多巴胺单体无法发生氧化聚合反应,从而阻止了聚合多巴胺包覆上转换荧光纳米材料复合物的形成,上转换荧光不会发生猝灭。H2O2的含量与多巴胺聚合反应的抑制效果正相关,因此可以通过上转换荧光强弱反映H2O2的含量。而且,葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下能够生成过氧化氢,因此借助葡萄糖氧化酶的作用,通过检测生成的过氧化氢实现对葡萄糖的定性定量检测。
本发明中,所述的混合液的上转换荧光强度的测定是在装配有980nm激光器的酶标仪中进行的。
本发明的有益效果在于:
本发明提供了一种上转换荧光共振能量传递检测组合物及检测方法,与传统的上转换荧光共振能量转移检测方法相比,本发明所述的方法无需进行荧光受体或荧光供体-受体复合物的前期制备,只需通过荧光供体和荧光受体的前体溶液进行简单混合即可精准获悉待检测物的浓度,操作简易方便、成本低廉、省时省力。所述方法中采用无油酸配体的上转换荧光纳米材料作为荧光供体,有效缩短了荧光供体和荧光受体之间的能量转移距离,猝灭能力优异,可以有效提高检测灵敏度。不仅如此,本发明采用的上转换荧光共振能量传递体系可以有效避免生物复杂体系中本底荧光的干扰,可以用于过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测,也可以进一步实现对血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测,具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、经济实用等优点,可为解决复杂体系中过氧化氢和葡萄糖的实时监测提供理论依据和技术支持,具有一定的临床应用潜力。
附图说明
图1为本发明所述上转换荧光共振能量传递检测方法用于H2O2和葡萄糖检测的原理示意图。
图2为本发明制备例1所述油溶性NaYF4∶Yb,Er的物化表征结果。
图3为本发明实施例1所述不同浓度过氧化氢作用下混合液的(a)上转换荧光光谱图和(b)上转换荧光强度的过氧化氢浓度依赖型响应曲线。
图4为本发明实施例2所述不同浓度葡萄糖添加后混合液的(a)上转换荧光光谱图和(b)上转换荧光强度的葡萄糖浓度依赖型响应曲线。
图5为本发明实施例3的在葡萄糖检测中的抗干扰性考察。
图6为本发明实施例4的去糖血清的血糖浓度依赖型标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外,应理解,在阅读了本发明所记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
除非另有说明,实施例中采用的原料或试剂均可商购获得,或者可通过已知的方法制备。
仪器:检测透射电镜图的仪器型号为JEOL公司生产的JEM-2010;检测荧光信号分子的仪器为荧光酶标仪,型号为BioTek公司生产的Synergy 4。
制备例1
采用高温共沉淀法制备稀土掺杂NaYF4上转换荧光纳米材料
以稀土醋酸盐、氟化铵、氢氧化钠、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)为原料,制备方法如下:
将称量好的1mmol的稀土醋酸盐:0.8mmol Y(CH3COO)3、0.18mmol Yb(CH3COO)3、0.02mmol Er(CH3COO)3、加入到100mL圆底三口烧瓶中,然后加入6mL的油酸和15mL的十八烯。在氮气保护下将上述反应原料搅拌均匀使之形成乳浊液,再加热至150℃反应30min形成澄清透明的均相溶液,再将反应温度降低至室温;
将事先准备好的溶解有0.1g NaOH和0.148g NH4F的甲醇溶液滴加入反应烧瓶中,室温搅拌30min,确保体系均匀分散;将反应液加热至60℃,搅拌反应1h去除反应体系中的甲醇,之后再升温至120℃搅拌10min,确保残余甲醇被完全排尽;将反应液继续升温至300℃后保持反应1h,N2流通强度不宜太大,之后将反应溶液冷却至室温;在三口烧瓶中加入过量的乙醇并搅拌30min,离心后将上层清液与沉淀分离,将得到的沉淀用环己烷/无水乙醇重复洗涤三次,再离心除去反应的副产物;将反应沉淀物一部分复分散于环己烷中冷藏保存,一部分置于60℃的真空烘箱中干燥过夜,得到NaYF4∶Yb,Er纳米材料的粉末。
制备得到的油溶性上转换纳米材料的表征结果见图2,其中,(a)为油溶性 NaYF4∶Yb,Er上转换荧光纳米材料分散于环己烷中光学图片;(b)为油溶性 NaYF4∶Yb,Er上转换荧光纳米材料的透射电镜图;(c)为油溶性NaYF4∶Yb,Er上转换荧光纳米材料的电子衍射花样(SAED);(d)为NaYF4∶Yb,Er上转换荧光纳米材料的粒径分布柱形图(数据统计于透射电镜图随机200个上转换荧光纳米材料);(e)为NaYF4∶Yb,Er上转换荧光纳米材料的XRD衍射图样。由结果可以看出制得的上转换纳米材料为纯的六方相,粒径均一,直径约为25nm。
制备例2
采用酸洗处理的方法制备水溶性无油酸配体的上转换荧光纳米材料
取15mL无水乙醇溶液,滴入适量盐酸,使其pH=1;将制备例1制备的油溶性上转换纳米颗粒溶解于上述乙醇溶液,超声30min;离心后用无水乙醇及蒸馏水洗涤数次;清洗过程采用15000rpm的转速离心10分钟,最后获取的酸洗后纳米颗粒为透明状,表明清洗效果良好,最后将无配体上转换纳米材料溶于4mL 的去离子水中,超声分散,获取浓度约为5.0mg/mL的纳米颗粒水溶液。
实施例1
本实施例用于过氧化氢浓度的检测,具体操作过程如下:
(1)检测所用载体为聚苯乙烯96孔板,在设定好的微孔中依次加入100μL 制备例2制备的上转换荧光纳米材料(UCNPs)水溶液,80μL多巴胺单体水溶液,用100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)将混合液定容至200μL,得到8 组混合液,分别测得8组混合液的上转换荧光强度,并计算多巴胺单体水溶液的荧光猝灭效率;当荧光猝灭效率最大时混合液所对应的UCNPs浓度为0.4 mg/mL,多巴胺单体浓度为500μM;并以此为标准浓度;进行过氧化氢的浓度依赖型曲线的绘制;
(2)检测所用载体为聚苯乙烯96孔板,在设定好的微孔中依次加入100μL 制备例2制备的上转换荧光纳米材料(UCNPs)水溶液,40μL多巴胺单体水溶液,40μL不同浓度的过氧化氢水溶液,最后用100mM的Tris-HCl缓冲溶液 (pH=8.5)将混合液定容至200μL,得到8组混合液,各混合液中的UCNPs浓度为0.4mg/mL,多巴胺单体浓度为500μM,过氧化氢的浓度分别为 0,5,30,60,100,150,200,250μM,置于37℃恒温振荡1h,之后加入10μL 120mM的 HCl溶液终止反应。将反应后的96孔板置于装配有980nm激光器的酶标仪中读取 8组混合液的上转换荧光强度值,其上转换荧光光谱图见图3。如图3所示,以过氧化氢在混合液中的浓度对荧光强度作图可以得到过氧化氢的浓度依赖型曲线。
图3a表明本发明建立的检测体系能够对一定浓度范围内的过氧化氢响应,过氧化氢的浓度越高,所对应的混合液荧光强度也越高。图3b表明在一定浓度范围内荧光强度与过氧化氢的浓度呈现良好的线性关系。
图3a和图3b的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对过氧化氢浓度的检测。
实施例2
本实施例用于过氧化氢生成体系相关物质(以葡萄糖为例)浓度的检测,具体操作过程如下:
首先在96孔板中先对检测孔板进行预设定,在设定好的微孔中分别加入100 μL上转换荧光纳米材料水溶液,10μL葡萄糖氧化酶GOx(终浓度为0.5mg mL-1),30μL一系列不同浓度的葡萄糖溶液和40μL多巴胺单体水溶液,之后用 100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)将混合液定容至200μL,得到12组混合液,各混合液中的UCNPs浓度为0.4mg/mL,多巴胺单体浓度为500μM,葡萄糖的浓度分别为0,2,15,30,45,60,80,100,150,200,250,300μM,置于37℃恒温振荡反应1h,之后取10μL盐酸溶液(120mM)终止反应,将反应后的96孔板置于带有 980nm激光器的酶标仪中测定设定孔中12组混合溶液的上转换荧光光谱,监测 540nm处的上转换荧光信号,其对应上转换荧光光谱图见图4。空白组检测得到的荧光信号(F0)最小,随着葡萄糖浓度的增加,荧光信号值(F)逐渐减大,以葡萄糖在混合液中的浓度对荧光强度作图可以得到葡萄糖的浓度依赖型曲线 (图4)。
实施例3
对识别待检测物葡萄糖的抗干扰性考察
1.实验所需试剂和仪器与实施例2相同,实验所需荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液与实施例2一致。
2.实验选取血液中常见干扰物:果糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、金属盐离子 (K+、Ca2 +、Na+、Mg2+、Zn2+)、人免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸等等。
3.首先在96孔板中对检测孔板进行分组设定,将1mM的上述干扰物和1 mM葡萄糖溶液加入到含有葡萄糖氧化酶GOx(终浓度0.5mg/mL)、UCNPs (终浓度0.4mg/mL)、多巴胺单体(终浓度500μM)的Tris-HCl缓冲溶液中,得到20组混合液,将96孔板置于37℃恒温振荡反应1h,之后取10μL盐酸溶液(120mM)终止反应,将反应后的96孔板置于带有980nm激光器的酶标仪中测定设定孔中20组混合溶液的上转换荧光强度,其对应的上转换荧光强度值见图5。
由图5的柱形图可以看出,只有葡萄糖能够有效抑制上转换荧光的猝灭,而其余干扰物都会造成上转换荧光的大幅度猝灭,表明葡萄糖和GOx反应生成的过氧化氢对多巴胺的聚合反应具有非常好的选择性抑制作用,在实际检测中能够避免这些干扰物的影响。
实施例4
对于复杂体系样品中葡萄糖回收率的考察
1.实验所需序列和仪器与实施例2相同,实验所需荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液与实施例2一致。
2.复杂体系实验所使用的模型基质为健康人血清和全血样品。
对于血清或全血样品中葡萄糖浓度的检测,利用加样回收率实验来验证其可行性,具体操作步骤如下:
葡萄糖在人血清中的标准曲线的制备:
将血清样品预先用葡萄糖氧化酶处理,以去除血清中固有的葡萄糖,之后将葡萄糖氧化酶灭活,并加入N-乙基马来酰亚胺。将去除葡萄糖的血清作为分散液,配制不同浓度的葡萄糖血清溶液,并加入96孔板预设定孔内。将 NaYF4∶Yb,Er纳米颗粒水溶液(0.4mg mL-1),多巴胺水溶液(500μM),葡萄糖氧化酶(0.05mg mL-1)与葡萄糖血清溶液混合均匀。于37℃恒温振荡反应1h,将反应后的96孔板置于带有980nm激光器的酶标仪中测定设定孔的上转换荧光信号。最后以葡萄糖浓度为横坐标,上转换荧光强度为纵坐标绘制葡萄糖在人血清中的标准曲线。
取葡萄糖浓度已知的两份健康人血清样品和一份健康人全血样品,用 Tris-HCl缓冲溶液将血清样品和全血样品均稀释100倍,于稀释样品中各加入一定量的葡萄糖溶液;在设定好的微孔中分别加入100μL制备例2制备的上转换荧光纳米材料(UCNPs),10μL葡萄糖氧化酶(终浓度为0.5mg mL-1),30μL 葡萄糖加样后的血清和全血样品稀释液和40μL最优浓度的多巴胺单体溶液,之后用100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)将混合液定容至200μL,各混合液中的UCNPs浓度为0.4mg/mL,多巴胺单体浓度为500μM,样品中葡萄糖的加入量分别为0.5mM、1mM、5mM,实际样品中葡萄糖的原始浓度见表1。 37℃恒温振荡反应1h后,测定混合液的上转换荧光强度,然后代入标准曲线计算血清和全血样本加样后的葡萄糖含量,通过如下公式计算加样回收率:
回收率%=(检测值-本底值)/添加量×100%。
结果如表1所示。从表1中可以看到,血清样本和全血样本的加样回收率数值均落在95.2-107.4%范围内,并且其变异系数均小于8.6%。结果表明,本发明的检测体系可以有效地屏蔽复杂体系的背景干扰,检测方法具有良好的精密度和重现性。
表1实施例4中葡萄糖的检测结果
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种上转换荧光共振能量传递检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:
1)将上转换荧光纳米材料与水混合,得到荧光供体溶液;
2)将多巴胺单体与水混合,得到荧光受体的前体溶液;
3)将步骤1)的荧光供体溶液、步骤2)的荧光受体的前体溶液和缓冲液混合,孵育,测定混合液的上转换荧光强度,并计算荧光受体的前体溶液的荧光猝灭效率,选取荧光猝灭效率最大时混合液所对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度值;
4)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
5)检测待测目标物的浓度;
任选地,步骤1)或2)所得的溶液中进一步含有其他组分。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤1)中,所述荧光供体溶液的浓度为0.1-5.0mg/mL,例如为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、5.0mg/mL;
优选地,所述上转换荧光纳米材料选自表面无有机配体(如油酸)且水溶解性好的上转换荧光纳米材料;
优选地,所述上转换荧光纳米材料选自粒径为1~1000nm的球形纳米材料;作为示例性地,所述粒径为20nm、50nm、80nm、100nm、200nm、300nm、500nm、800nm;
优选地,所述上转换荧光纳米材料选自NaYF4:Yb,Er;
优选地,所述上转换荧光纳米材料NaYF4:Yb,Er中稀土离子[Y3+]∶[Yb3+]∶[Er3+]的摩尔比为(50~98)∶(2~40)∶(0.5-10);
优选地,步骤1)中,所述荧光供体溶液的制备具体包括如下步骤:将上转换荧光纳米材料超声分散于去离子水,制备得到所述荧光供体溶液。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,步骤2)中,所述荧光受体的前体溶液的浓度为大于0mM且小于等于50mM;所述荧光受体选自聚合多巴胺;所述荧光受体的前体选自多巴胺单体;
优选地,步骤2)中,所述荧光受体的前体溶液的制备具体包括如下步骤:将多巴胺单体超声分散于去离子水,制备得到所述荧光受体的前体溶液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法,其特征在于,步骤3)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液的浓度和体积为任意比例;优选为能够得到混合液的上转换荧光强度和荧光猝灭效率最大时混合液所对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度值即可;
优选地,步骤3)中,所述缓冲液选自Tris-HCl;所述缓冲液的浓度为10mM,所述缓冲液的pH为8.5;
优选地,步骤3)中,所述荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液混合后,荧光受体的前体可以生成荧光受体并包覆在上转换荧光纳米材料表面,形成包覆型上转换纳米材料的复合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法,其特征在于,所述荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和缓冲液的混合具体包括如下步骤:
3-1)将上转换纳米材料水溶液与多巴胺单体水溶液混合均匀,并定容于50-1000μL的Tris-HCl缓冲溶液中,得到混合溶液;
3-2)将混合溶液于37℃恒温振荡混匀0.5-3小时,振荡过程中可以观察到溶液颜色从“无色-浅灰色-棕色-棕褐色”的变化过程,说明聚合多巴胺逐渐包覆在NaYF4:Yb,Er纳米晶表面并且随着时间推移聚合多巴胺的厚度逐渐增加;
3-3)加入10μL120mM的HCl溶液终止多巴胺聚合反应。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法,其特征在于,步骤4)中,所述标准曲线的绘制具体包括如下步骤:以步骤3)的荧光猝灭效率最大时对应的荧光供体溶液和荧光受体的前体溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的荧光供体溶液、标准浓度的荧光受体的前体溶液、缓冲液和不同浓度的待测目标物溶液混合,孵育;测定混合液的上转换荧光强度,绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
优选地,步骤4)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液、缓冲液和待测目标物溶液的浓度和体积为任意比例;例如所述待测目标物溶液的浓度为0~1000μM;优选为能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可;
优选地,步骤4)中,所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标,对应的荧光强度值为纵坐标进行绘制的;
优选地,步骤4)中,所述待测目标物选自可以抑制多巴胺单体发生聚合反应生成聚合多巴胺的物质;
优选地,所述待测目标物选自过氧化氢或可生成过氧化氢的生化体系如含有葡萄糖的生化体系如尿酸+尿酸酶体系、乳酸+乳酸过氧化物酶体系、次黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶;
优选地,所述待测目标物为血清或全血中的过氧化氢或可生成过氧化氢生化体系如含有葡萄糖的生化体系。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法,其特征在于,步骤5)中,所述检测具体包括如下步骤:将标准浓度的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的上转换荧光强度,代入步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,计算出未知浓度的待测目标物溶液的浓度;
优选地,步骤5)中,所述孵育的温度为20~60℃;所述孵育的时间为1~240min;所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述混合的荧光供体溶液、荧光受体的前体溶液和待测目标物溶液的浓度和体积为任意比例;优选为能够得到在步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出上转换荧光强度的即可。
8.权利要求1-7任一项所述的检测方法的用途,其用于过氧化氢或与过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中葡萄糖的检测。
9.一种组合物,其中,所述组合物包含如下组分:
(1)上转换荧光纳米材料;(2)多巴胺单体;
优选地,所述上转换荧光纳米材料作为荧光供体;所示多巴胺单体作为荧光受体的前体;
优选地,所述组合物中,所述上转换荧光纳米材料所占的百分比为0.01%-20%;所述多巴胺单体所占的百分比为80%-99.99%;
优选地,所述组合物用于过氧化氢或与过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中的过氧化氢或过氧化氢生成体系相关物质的检测;
优选地,用于血清或全血样品中葡萄糖的检测。
10.一种生物传感器,所述生物传感器包括权利要求9所述的组合物。
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