CN111735802A - 一种血液中葡萄糖的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种血液中葡萄糖的检测方法。该方法中葡萄糖氧化酶与二价亚铁离子，在血糖存在的情况下，产生的双氧水进一步与二价亚铁离子发生芬顿反应产生强氧化能力的羟基自由基，从而氧化稀土Er3+纳米粒子表面的吲哚菁绿(ICG)分子。ICG被氧化后无法实现对稀土纳米粒子的敏化增强发光，从而降低了稀土纳米粒子的近红外区的发光。根据近红外发光强度猝灭的情况，实现对待检测样品中是否含有血糖的超灵敏检测，由于该方法中激发激光与发射激光均位于生物窗口内的近红外波段，避免了可见光背景荧光的干扰，具有荧光背景噪声低，成本低，方法简单，便于操作等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种血液中葡萄糖的检测方法。
背景技术
葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物，是生物体内主要的供能物质，且对人体内葡萄糖的含量检测是医学诊断的重要标准，频繁的检测和严格控制血糖水平是有效管理糖尿病和减少相关并发症必不可少的手段。
目前，人们已经研制出多种光化学传感法检测葡萄糖，包含电化学传感，质谱，荧光检测法等等。其中，荧光传感检测方法具有检测快、操作简单的优势，因而成为目前研究的比较热门的检测方法。荧光传感检测方法的性能(如选择性、灵敏度、稳定性)取决于荧光材料或荧光探针的设计。荧光传感检测葡萄糖有两种模式：基于葡萄糖与探针分子作用，导致修饰的荧光基团的淬灭；基于探针材料本身荧光的淬灭或者增强。前一种模式常用于生物传感领域，后一种模式多用于化学传感领域。与生物传感检测法相比，基于探针材料本身荧光增强或淬灭的化学传感检测法的稳定性更好，检测环境(比如pH)对传感性能的影响小。这种荧光化学传感检测法主要基于无机纳米材料，所述材料具有良好的生物兼容性、化学稳定性、良好的荧光发光性能、类酶性和其它催化性能，被广泛用于荧光传感领域。
例如，中国专利文献CN104730052A，公开了一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器。所述的稀土上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb3+，Er3+；基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器检测葡萄糖的步骤为：a.分别配制葡萄糖氧化酶及葡萄糖溶液；b.将葡萄糖与葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃培养箱中培养10-30min，最终形成葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液；c.将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液加入葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液中，再加入缓冲溶液，常温下混合均匀后进行光谱测试；d.固定激发光波长为980nm，收集400-700nm波长范围内的光谱图。该专利文献中通过选用稀土上转换纳米颗粒有效的避免了激发光造成的背景荧光干扰，然而其使用的是400-700nm的可见光发射作为检测波长，仍可激发一定的背景荧光，不利于低噪声的血糖检测。
因此，研发一种近红外光激发，同时检测近红外光发射(尤其是近红外二区的范围1000到1700nm)的检测方法，实现荧光背景低的血糖检测方法，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的可见光发射作为检测波长会激发一定的背景荧光干扰血糖检测的缺陷，从而提供一种血液中葡萄糖的检测方法。
为此，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种血液中葡萄糖的检测方法，在检测体系中添加吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂纳米粒子。
进一步地，本发明提供的血液中葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：
将吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子，葡萄糖氧化酶，亚铁离子混合均匀，得到检测体系；
在所述检测体系中加入待检测血糖样品，进行光谱测试，其中，激发激光和发射激光均采用近红外激光。
进一步地，所述激发激光的波长为600-1000nm；所述发射激光的波长为1000-1600nm；
所述激发激光的波长为808nm；所述发射激光的波长为1532nm。
进一步地，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的用量为0.1-20mg/mL；
所述亚铁离子的用量为10μM-1mM；
所述葡萄糖氧化酶的用量为0.2-40mg/mL
进一步地，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子中Er3+的掺杂比例为5mol％至100mol％；
优选的，所述所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子中Er3+的掺杂比例为15-25mol％。
进一步地，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子为吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的氟化物纳米粒子；
优选的，所述氟化物为NaYF4，NaLuF4，NaGdF4或LaF3。
进一步地，所述亚铁离子为来自包含亚铁离子的水溶性化合物；
优选的，所述包含亚铁离子的水溶性化合物为氯化亚铁，硫酸亚铁或硝酸亚铁。
进一步地所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
将Er3+掺杂的纳米粒子分散在正己烷中，加入四氟硼酸亚硝溶液进行反应，分离生成的沉淀物，将所得沉淀物分散在二甲基甲酰胺溶液中，加入吲哚菁绿进行修饰，分离修饰后的沉淀物，得所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子。
进一步地，所述吲哚菁绿的用量为0.5-50mg/mL。
进一步地，所述Er3+掺杂的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将YCl3·6H2O和ErCl3.6H2O溶解于油酸1-十八烯中，在惰性气体保护下130-160℃反应20-40min；
将NH4F，NaOH和甲醇的混合溶液加入到上述反应液中，去除甲醇，在280-350℃反应40-80min，冷却后用乙醇分离，得到所述Er3+掺杂的纳米粒子。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种血液中葡萄糖的检测方法，在检测体系中添加吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂纳米粒子。该方法采用了吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂纳米粒子，通过吲哚菁绿的敏化作用产生强的近红外二区的强发光，实现低荧光背景噪声的血糖检测，克服了以往荧光背景高的问题。
2.本发明提供的血液中葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：将吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子，葡萄糖氧化酶，亚铁离子混合均匀，得到检测体系；在所述检测体系中加入待检测血糖样品，进行光谱测试，其中，激发激光和发射激光均采用近红外激光。该方法中葡萄糖氧化酶与二价亚铁离子，在血糖存在的情况下，产生的双氧水进一步与二价亚铁离子发生芬顿反应产生强氧化能力的羟基自由基，从而氧化稀土Er3+纳米粒子表面的吲哚菁绿(ICG)分子。ICG被氧化后无法实现对稀土纳米粒子的敏化增强发光，从而降低了稀土纳米粒子的近红外区的发光。根据近红外发光强度猝灭的情况，实现对待检测样品中是否含有血糖的超灵敏检测，由于该方法中激发激光与发射激光均位于生物窗口内的近红外波段，避免了可见光背景荧光的干扰。该方法具有荧光背景噪声低，成本低，方法简单，便于操作等优点。另外，本发明提供的高灵敏度检测范围可达0.1μM-100μM，该检测限低于常规荧光检测的检测范围(10μM到10mM)，因而可以将血液稀释到更低的浓度来减少背景干扰物对信号的干扰。
3.本发明提供的血液中葡萄糖的检测方法，通过对检测体系中吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子，亚铁离子以及葡萄糖氧化酶用量的进一步限定。如此，能够进一步提高血液中葡萄糖检测检测结果的准确性，如果用量过高，会存在原料的浪费，检测成本过高的问题，如果用量过低，会存在无法检测信号，检测灵敏度下降的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中所使用的Er3+掺杂纳米粒子扫描电镜图；
图2为实施例1中所使用的吲哚菁绿(ICG)修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的近红外二区发射光谱图(空白对照)；
图3为实施例1中加入100μM血糖后吲哚菁绿(ICG)修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的红外发射光谱图；
图4为实施例2中加入40μM血糖后吲哚菁绿(ICG)修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的红外发射光谱图；
图5为实施例1中为分别加入100μM果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，血清，血糖样品后吲哚菁绿(ICG)修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的光谱强度变化图；
图6为实施例1中加入0.1μM血糖后吲哚菁绿(ICG)修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的红外发射光谱图。
图7为实施例5中不同血糖浓度与荧光强度的关系曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供一种血液中葡萄糖的检测方法，具体步骤如下：
(1)20mol％Er3+浓度掺杂的基质为NaYF4的稀土纳米粒子(即NaYF4：20％Er纳米粒子)的制备：
将YCl3·6H2O(0.4mmol)和ErCl3.6H2O(0.1mmol)溶解在3mL油酸,7.5mL1-十八烯的三口瓶中,氩气保护下加热到150℃，保持30分钟,之后在氩气保护下冷却至室温。然后配置NH4F(2mmol),NaOH(1.25mmol)溶解在5mL甲醇中，并加入到以上稀土盐的三口瓶中并加到70℃去除甲醇，之后氩气保护下加热到300℃并保持1小时。最后溶液冷却到室温，并使用乙醇离心，最终溶解在6mL正己烷中，扫描电镜测试结果如图1所示。从图中可以看出，尺寸均匀的纳米粒子被成功制备。
(2)吲哚菁绿(ICG)修饰的20mol％Er3+浓度掺杂的稀土纳米粒子：
将16mL分散在正己烷中的Er3+掺杂的稀土纳米粒子(约20mg/mL)与500μL NOBF4(0.1mg/mL)混合，然后轻轻振摇，直到观察到Er3+掺杂的稀土纳米粒子沉淀为止。最后，将沉淀物在8500rpm下离心10分钟，然后分散在20mL二甲基甲酰胺溶液中，然后加入100μg吲哚菁绿到溶液中搅拌半小时，8500rpm离心后，重新分散在水溶液中，近红外光808nm激发下产生的近红外光1532nm发射的光谱图如图2所示。
(3)血糖的检测：吲哚菁绿(ICG)修饰的20mol％Er3+掺杂的稀土纳米粒子(1mg)，2mg葡萄糖氧化酶，100μL FeSO4(100μM)溶解在2mL PBS溶液中，之后，加入10μL血糖(血清与葡萄糖混合所得，最终反应体系中葡萄糖浓度是100μM)加入到2mL反应液中，反应半小时。之后通过近红外波长808nm激发，对近红外波段发射波长1532nm进行检测，根据发射光强变化情况，确定血糖的有无及相关浓度，当存在血糖的情况下，引起近红外发射的发光强度的下降，血液葡萄糖浓度越高，近红外发射下降越明显。实验结果如图3所示，近红外1532nm的发射光下降，从而证实血糖的存在。
实施例2
与实施例1相比，区别在于血糖检测步骤中，吲哚菁绿(ICG)修饰的20mol％Er3+掺杂的稀土纳米粒子的用量为0.5mg，亚铁离子的用量为50μL FeSO4(100μM)，葡萄糖氧化酶的用量为1mg；激发激光波长为808nm，发射激光波长为1530nm。测试结果如图4所示。
实施例3
与实施例1类似，进行检测特异性验证，分别加入相同浓度的100μM果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，血清，血糖样品，进行特异性检测，测试结果如图5。从图中可以看出，只有加入血糖的样品，实现了近红外荧光发射光谱的下降，而其他样品均未对荧光光谱信号产生影响，从而证实我们的实验方案可以实现血糖的特异性检测。
实施例4
与实施例1类似，进行检测限测试，将入0.1μM血糖样品，进行1530nm检测，仍可以观察到光谱的下降，测试结果如图6。
实施例5
与实施例1类似，加入不同浓度(0，5μM，10μM，20μM，40μM，70μM，100μM)的血糖样品后，808nm激发下，测试近红外1530nm发射光谱的变化情况，绘制荧光强度变化与血糖浓度的关系图，如图7所示，血糖浓度在0到100μM范围内，荧光强度与血糖浓度呈线性关系，从而可以实现血糖浓度的定量检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，在检测体系中添加吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子，葡萄糖氧化酶，亚铁离子混合均匀，得到检测体系；
在所述检测体系中加入待检测血糖样品，进行光谱测试，其中，激发激光和发射激光均采用近红外激光。
3.根据权利要求2所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述激发激光的波长为600-1000nm；所述发射激光的波长为1000-1600nm；
所述激发激光的波长为808nm；所述发射激光的波长为1532nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的用量为0.1-20mg/mL；
所述亚铁离子的用量为10μM-1mM；
所述葡萄糖氧化酶的用量为0.2-40mg/mL。
5.根据权利要求4所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子中Er3+的掺杂比例为5mol％至100mol％；
优选的，所述所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子中Er3+的掺杂比例为15-25mol％。
6.根据权利要求4所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子为吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的氟化物纳米粒子；
优选的，所述氟化物为NaYF4，NaLuF4，NaGdF4或LaF3。
7.根据权利要求4所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述亚铁离子为来自包含亚铁离子的水溶性化合物；
优选的，所述包含亚铁离子的水溶性化合物为氯化亚铁，硫酸亚铁或硝酸亚铁。
8.根据权利要求1-7任一项所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
将Er3+掺杂的纳米粒子分散在正己烷中，加入四氟硼酸亚硝溶液进行反应，分离生成的沉淀物，将所得沉淀物分散在二甲基甲酰胺溶液中，加入吲哚菁绿进行修饰，分离修饰后的沉淀物，得所述吲哚菁绿修饰的Er3+掺杂的纳米粒子。
9.根据权利要求8所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述吲哚菁绿的用量为0.5-50mg/mL。
10.根据权利要求8所述的血液中葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述Er3+掺杂的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将YCl3·6H2O和ErCl3.6H2O溶解于油酸1-十八烯中，在惰性气体保护下130-160℃反应20-40min；
将NH4F，NaOH和甲醇的混合溶液加入到上述反应液中，去除甲醇，在280-350℃反应40-80min，冷却后用乙醇分离，得到所述Er3+掺杂的纳米粒子。
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