CN108982440A - 上转换微弱光检测器的构建及其用于谷胱甘肽的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种上转换微弱光检测器的构建及其用于谷胱甘肽的检测，涉及构建一台上转换微弱光检测仪，该检测仪的优点主要有：(1)检测性能好，在对UCNPs进行检测时，可以对合成方法简单但发光较弱的α相UCNPs进行检测；(2)对UCNPs的浓度要求低，可以使UCNPs在一个近似于均相的体系中进行检测；其次，研制了一种稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的生物传感器，并将其用于GSH的检测。传感器的荧光响应值与GSH的浓度在0.5~100μM的范围内呈良好的线性关系，检测限为0.24μM。因此，上转换微弱光检测器有望成为一种上转换发光的新型检测方法，在更多领域中进行应用。

Description

上转换微弱光检测器的构建及其用于谷胱甘肽的检测
技术领域
本发明涉及一台上转换微弱光检测器的构建，属于仪器分析领域。
本发明涉及以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针，并通过上转换微弱光检测仪用于谷胱甘肽（GSH）的检测，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione，GSH) 是一种存在于哺乳动物及真核细胞中，含有大量巯基三肽的小分子物质，在调节氧化还原平衡、新陈代谢、解毒等生物过程中起着核心作用。GSH是一种重要的内源性抗氧化剂，可以防止细胞内的物质被活性氧破坏，同时参与代谢及生化反应。更重要的是GSH的水平与多种疾病相关，如HIV感染、牛皮癣、白细胞减少、癌症、肝损伤、心脏病等。因此，准确检测GSH水平显得尤为重要。目前存在的检测方法主要有高效液相色谱法、荧光分光光度法、可见分光光度法、高效毛细电泳法等。这些方法虽然经典，但是存在实验复杂、灵敏度低等缺点。Deng等人在GSH的检测中使用了上转换纳米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)，检测限低达0.9 μM。
尽管UCNPs有着众多优点，但是由于稀土掺杂的上转换纳米材料主要是通过稀土离子的4f-4f的能级跃迁来产生发射光，稀土离子的吸收截面小，对近红外激发光的吸收率低，这使得UCNPs发光效率较低，而这一缺点也限制了UCNPs的应用。在实际应用中，为了克服发光效率低这一缺点，通常会制备发光效率较高的β相来进行实验，或者对UCNPs结构进行改造来，如：制备核壳结构的UCNPs，对UCNPs进行表面修饰等。但这些方法对实验要求高，费时费力。除了对UCNPs的结构进行改造外，还可以通过对UCNPs进行富集或使用新型的检测器来达到理想的检测效果。
近年来，微弱光检测技术受到了人们越来越多的关注，微弱光检测仪也得到一定的发展。微弱光检测仪主要是通过光电转换探测器、电流脉冲变换器对微弱光信号进行采集，使用脉冲技术接口和计算机对所采集信号进行处理，将微弱光信号转变为电信号，其灵敏度远远高于普通的荧光分光光度计。MPI-E电致化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)是一台集电化学检测和多功能化学发光检测于一体的检测器。多功能化学发光检测过程，就是一种微弱光检测的过程，在功能化学发光检测模式中，其光谱接收范围300nm~650 nm，此范围不包括UCNPs的激发光980 nm，因而不会产生光谱干扰现象。
受到上述启发，我们对MPI-E电致化学发光检测仪进行了相应的改造，构建了一台上转换微弱光检测仪，并将我们所构建的上转换微弱光检测仪与普通的荧光分光光度计得检测性能进行了对比，证明上转换微弱光检测仪的检测性能优于荧光分光光度计。并且设计了一个简单的传感策略，利用上转换微弱光检测仪对小分子物质谷胱甘肽进行检测。
发明内容
本发明的目的在于构建一台上转换微弱光检测仪，以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针,利用上转换微弱光检测仪对谷胱甘肽（GSH）进行检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种上转换微弱光检测仪，包括上半部分的一个样品室，其特征是：样品室的底部有检测池，检测池内设有石英窗，在样品室内位于石英窗的正上方设有比色皿，激光器的探头引入样品室中，使探头的位置与比色皿垂直后固定，在样品室的下方连接有真空室，光电倍增管处于真空室中且正对石英窗设置，上转换的荧光通过样品室的底部的比色皿、石英窗，再经由光电倍增管收集，传入计算机系统，进行数据处理。
UCNPs水溶液在980 nm激发光照射时，产生肉眼可见的绿色荧光；当加入MnO2纳米片反应一段时间后，二者吸附在一起发生荧光共振能量转移，使UCNPs的绿色荧光猝灭，接着在UCNPs-MnO2体系中加入具有还原性的L-谷胱甘肽(GSH)，MnO2纳米片能被GSH还原成Mn2 +，游离出UCNPs，绿色荧光恢复，利用上转换微弱光检测仪光电流的变化，直接用于GSH的测定。
先对上转换微弱光检测仪和Cary Eclipse荧光分光光度计在同等测试条件下电压：500 V，激发功率：0.25 W/cm2的信噪比进行了比较；将α相UCNPs配制成0.5 mg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比；将β相UCNPs配置成5 μg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比。
α相OA-UCNPs的制备：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 4 mL，十八稀(ODE) 15mL，已制备好的稀土硬脂酸盐 (Y、Yb、Er) 1 mmol，NaF 20 mmol，回流加热至135~145℃保持30 min以脱水脱气，形成澄清液体；然后迅速升温，并将反应温度维持在298~302℃，保持30 min；反应结束后，冷却至室温；对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用；
β相OA-UCNPs的制备 ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 12 mL，十八稀(ODE) 8mL，已制备好的稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er) 0.8 mmol，NaF 28 mmol，回流加热至135~145℃保持30 min以脱水脱气，形成澄清液体，然后迅速升温，并将反应温度维持在312~314℃，保持45 min，反应结束后，冷却至室温，对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用；
无配体的裸上转换纳米粒子(bare-UCNPs)的制备：分别取10 mg α相UCNPs及10 mg β相UCNPs，溶于10 mL的超纯水中，加入适量稀盐酸调节酸度使pH=4，快速搅拌三小时，反应结束后，加入己烷萃取除去游离的油酸，离心收集水相中的上转换纳米粒子，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，获得去除了油酸配体的α相UCNPs和β相UCNPs，真空干燥备用；
上述稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)的制备：0.2 mmol的氧化铒(Er2O3)，2.0 mmol的氧化镱(Yb2O3), 7.8 mmol的氧化钇(Y2O3)置于一烧杯中，加入适量稀硝酸使稀土氧化物溶解，持续加热搅拌至得到稀土硝酸盐固体，自然冷却后加入适量乙醇，密封室温搅拌2 h后得到完全溶解的稀土硝酸盐乙醇溶液，将稀土硝酸盐乙醇溶液与硬脂酸在70 ℃乙醇中混合搅拌回流至均一溶液，在40 min内缓慢逐滴加入119 g/L的NaOH溶液，78 ℃继续回流搅拌30min；然后减压抽滤，水洗2次，再用乙醇洗涤2次，所得滤饼转移至烘箱中在60 ℃条件下干燥12 h，即得白色粉末状稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)；
MnO2纳米片的制备：称取1.094 g TMA•OH 溶于20 mL 3 wt%的双氧水中，将此混合液在15 s内加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O溶液，形成棕色悬浊液，室温下，快速搅拌过夜，使MnCl2•4H2O完全氧化，反应结束后，10000 r/min离心10 min以收集样品，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，60℃真空干燥12小时，将已制备好的MnO2纳米片配置成1 mg/mL的溶液，连续超声10小时，2000 r/min离心10 min取上清液备用。
本发明一种基于上转换微弱光检测器的上转换荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测方法，其特征是：包括如下步骤：10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs水溶液，分别与5 μL~70 μL的1 mg/mL的MnO2纳米片溶液混合，并用超纯水定容至200 μL，室温反应30 min，用上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，以F0为初始荧光，F为加入MnO2纳米片后的荧光，作猝灭率与MnO2体积的变化图，可得最佳反应体积；10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL的MnO2纳米片溶液，分别与20 μL不同浓度的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，使GSH的终浓度为0.1 μM ~150 μM，室温反应20 min，然后用权利要求1所述的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，通过荧光强度F与GSH浓度的标准曲线进行GSH的测定。
所使用的MnO2纳米片溶液体积为35 μL，GSH反应时间为20 min，反应的缓冲体系为水；所测定GSH的线性范围为0.5~100 μM，最低检测限为0.24 μM。
本发明上转换微弱光检测器的构建及其用于谷胱甘肽的检测，其特征是对MPI-E电致化学发光检测仪进行了相应的改造，构建了一台上转换微弱光检测仪，并将构建的上转换微弱光检测仪与普通的荧光分光光度计得检测性能进行了对比，证明上转换微弱光检测仪的检测性能优于荧光分光光度计。并且设计了一个简单的传感策略，即UCNPs水溶液在980 nm激发光照射时，产生肉眼可见的绿色荧光；当加入MnO2纳米片反应一段时间后，二者吸附在一起发生荧光共振能量转移，使UCNPs的绿色荧光猝灭，接着在UCNPs-MnO2体系中加入具有还原性的L-谷胱甘肽(GSH)，MnO2纳米片可以被GSH还原成Mn2+，游离出UCNPs，绿色荧光恢复，利用上转换微弱光检测仪光电流的变化，直接用于GSH的测定。
所使用的上转换微弱光检测器的构建方法：以MPI-E电致化学发光检测仪为基础进行改造。如图1所示，仪器的上半部分是一个样品室，样品室的下方连接光电倍增管，光电倍增管处于真空室中。整个检测装置再与计算机处理系统相连，构成了整台上转换微弱光检测仪。上转换的荧光通过样品室的底部的石英窗，再经由光电倍增管收集，传入计算机系统，进行数据处理。检测时，选取一只底部透光的微量荧光比色皿，放入检测池中，调节位置使比色皿位于石英窗的正上方，将MDL-Ⅲ 980 nm激光器的探头引入样品室中，调整探头的位置使其与比色皿垂直，固定二者位置。为避免光电倍增管受到损害，应加上特制的遮光罩。
本发明所述的上转换微弱光检测仪检测性能的测定，其特征是比较上转换微弱光检测仪与荧光分光光度计的检测性能，过程如下：首先，先对上转换微弱光检测仪和CaryEclipse荧光分光光度计在同等测试条件下(电压：500 V，激发功率：0.25 W/cm2)的信噪比进行了比较；将α相UCNPs配制成0.5 mg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比；将β相UCNPs配置成5 μg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比。
本发明所述的基于上转换微弱光检测器的上转换荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测的方法，包括如下步骤：10 μL0.05 mg/mL β相UCNPs水溶液，分别与5 μL~70 μL的1 mg/mL的MnO2纳米片混合，并用超纯水定容至200 μL，室温反应30 min，用上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V。以F0为初始荧光，F为加入MnO2纳米片后的荧光，作猝灭率与MnO2体积的变化图，可得最佳反应体积。10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL的MnO2纳米片，分别与20 μL不同浓度的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，使GSH的终浓度为0.1 μM ~150 μM，室温反应20 min，然后用上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，通过荧光强度F与GSH浓度的标准曲线进行GSH的测定。
所使用的MnO2纳米片体积优选为35 μL，GSH反应时间优选为20 min，反应的缓冲体系优选为水。
所测定GSH的线性范围为0.5~100 μM，最低检测限为0.24 μM。
具体地说，本发明采用以下技术方案：
（一）上转换微弱光检测器的构建及性能研究
以MPI-E电致化学发光检测仪为基础进行改造。选取一只底部透光的微量荧光比色皿，放入样品室中，调节位置使比色皿位于光电倍增管接收窗口的正上方；将MDL-Ⅲ 980 nm激光器的探头引入样品室中，调整探头的位置使其与比色皿垂直，固定二者位置。为避免仪器漏光对光电倍增管造成伤害，检测时加上避光罩。将已制备好的α相、β相配成50 μg/mL的水溶液，分别用荧光分光光度计和上转换微弱光检测仪对其进行检测。分别调节激发功率0.5~2 W/cm2，调节电压500 V~1000 V。比较两台仪器的检测性能。
（二）UCNPs及MnO2纳米片的制备
制备α相OA-UCNPs ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 4 mL，十八稀(ODE) 15 mL，已制备好的稀土硬脂酸盐 (Y、Yb、Er) 1 mmol，NaF 20 mmol，回流加热至135~145℃保持30min以脱水脱气，形成澄清液体。然后迅速升温，并将反应温度维持在298~302℃，保持30min。反应结束后，冷却至室温。对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用。
制备β相OA-UCNPs ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 12 mL，十八稀(ODE) 8mL，已制备好的稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er) 0.8 mmol，NaF 28 mmol，回流加热至135~145℃保持30 min以脱水脱气，形成澄清液体。然后迅速升温，并将反应温度维持在312~314℃，保持45 min。反应结束后，冷却至室温。对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用。
无配体的裸上转换纳米粒子(bare-UCNPs)的制备：分别取10 mg α相UCNPs及10mg β相UCNPs，溶于10 mL的超纯水中，加入适量稀盐酸调节酸度使pH=4，快速搅拌三小时。反应结束后，加入己烷萃取除去游离的油酸，离心收集水相中的上转换纳米粒子，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，获得去除了油酸配体的α相UCNPs和β相UCNPs，真空干燥备用。
MnO2纳米片的制备：称取1.094 g 四甲基氢氧化铵溶于20 mL 3 wt%的双氧水中，将此混合液在15 s内加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O溶液，形成棕色悬浊液。室温下，快速搅拌过夜，使MnCl2•4H2O完全氧化。反应结束后，10000 r/min离心10 min以收集样品，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，60℃真空干燥12小时。将已制备好的MnO2纳米片配置成1mg/mL的溶液，连续超声10小时，2000 r/min离心10 min取上清液备用。
（三）基于上转换微弱光检测器的上转换荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测
10 μL0.05 mg/mL β相UCNPs水溶液，分别与5 μL~70 μL的1 mg/mL的MnO2纳米片混合，并用超纯水定容至200 μL，室温反应30 min，用上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V。以F0为初始荧光，F为加入MnO2纳米片后的荧光，作猝灭率与MnO2体积的变化图，可得最佳反应体积。10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL的MnO2纳米片，分别与20 μL不同浓度的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，使GSH的终浓度为0.1 μM ~150 μM，室温反应20 min，然后用上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，通过荧光强度F与GSH浓度的标准曲线进行GSH的测定。
本发明的优点：
（1）构建了一台上转换微弱光检测仪，该检测仪的优点主要有：检测性能好，在对上转换纳米粒子（UCNPs）进行检测时，可以对合成方法简单但发光较弱的α相UCNPs进行检测；对UCNPs的浓度要求低，可以使UCNPs在一个近似于均相的体系中进行检测；
（2）研制了一种稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的生物传感器，并通过上转换微弱光检测仪用于谷胱甘肽（GSH）的检测；
（3）在最佳条件下，该生物传感器的荧光响应值与GSH的浓度在0.5~100 μM的范围内呈良好的线性关系，检测限为0.24 μM，且具有良好的选择性。
附图说明
图1为上转换微弱光检测仪的结构示意图；
图2为仪器噪音的测定图：图中的a为上转换微弱光检测仪的噪音的测定图; 图2中的b为荧光分光光度计噪音的测定图；
图3为上转换微弱光检测仪与荧光分光光度计对UCNPs的检测结果对比图：图中的a为α相;图中的b为 β相；
图4为上转换荧光探针的原理图；
图5为 MnO2纳米片对UCNPs荧光猝灭效果图：图中的a为不同用量MnO2对UCNPs微弱光猝灭的效率；图中的b为不同用量MnO2对UCNPs荧光猝灭的微弱光电流图；图中的c为含有不同体积MnO2的UCNPs的明场照片；
图6为反应时间对检测体系荧光恢复强度的影响图；
图7为反应缓冲液类型对检测体系荧光恢复强度的影响图；
图8为不同电解质对检测体系荧光强度变化的影响图；
图9为不同浓度GSH对UCNPs荧光恢复影响图：图中的a为检测体系荧光强度与GSH浓度的线性关系图；图中的b为不同浓度GSH对UCNPs荧光恢复影响的微弱光图。
具体实施方式
实例1：
以MPI-E电致化学发光检测仪为基础进行改造。如图1所示，本发明提供一种上转换微弱光检测仪包括上半部分的一个样品室1，样品室1的底部有检测池，检测池内设有石英窗2，在样品室1内位于石英窗2的正上方设有比色皿3，激光器的探头4引入样品室中，使探头4的位置与比色皿3垂直后固定，在样品室1的下方连接有真空室5，光电倍增管6处于真空室5中且正对石英窗2设置，上转换的荧光通过样品室的底部的比色皿3、石英窗2，再经由光电倍增管6收集，传入计算机系统7，进行数据处理，计算机系统7为现有技术产品。具体地说，本仪器的上半部分是一个样品室，样品室的下方连接光电倍增管，光电倍增管处于真空室中。整个检测装置的光电倍增管再与计算机系统相连，构成了整台上转换微弱光检测仪。上转换的荧光通过样品室的底部的石英窗，再经由光电倍增管收集，传入计算机系统，进行数据处理。检测时，选取一只底部透光的微量荧光比色皿，放入样品室中的检测池中，调节位置使比色皿位于石英窗的正上方，将MDL-Ⅲ 980 nm激光器的探头4引入样品室中，调整探头的位置使其与比色皿垂直，固定二者位置，在比色皿中放入待测样品即可开始（下述实例）检测。为避免光电倍增管受到损害，应加上特制的遮光罩。
实例2：
制备α相OA-UCNPs ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 4 mL，十八烯(ODE) 15 mL，已制备好的稀土硬脂酸盐 (Y、Yb、Er) 1 mmol，NaF 20 mmol，回流加热至135~145℃保持30min以脱水脱气，形成澄清液体。然后迅速升温，并将反应温度维持在298~302℃，保持30min。反应结束后，冷却至室温。对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用。
制备β相OA-UCNPs ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 12 mL，十八烯(ODE) 8mL，已制备好的稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er) 0.8 mmol，NaF 28 mmol，回流加热至135~145℃保持30 min以脱水脱气，形成澄清液体。然后迅速升温，并将反应温度维持在312~314℃，保持45 min。反应结束后，冷却至室温。对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用。
无配体的裸上转换纳米粒子(bare-UCNPs)的制备：分别取10 mg α相UCNPs及10mg β相UCNPs，溶于10 mL的超纯水中，加入适量稀盐酸调节酸度使pH=4，快速搅拌三小时。反应结束后，加入己烷萃取除去游离的油酸，离心收集水相中的上转换纳米粒子，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，获得去除了油酸配体的α相UCNPs和β相UCNPs，真空干燥备用。
制备稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)：0.2 mmol的氧化铒(Er2O3)，2.0 mmol的氧化镱(Yb2O3), 7.8 mmol的氧化钇(Y2O3)置于一烧杯中，加入适量稀硝酸使稀土氧化物溶解，持续加热搅拌至得到稀土硝酸盐固体。自然冷却后加入适量乙醇，密封室温搅拌2 h后得到完全溶解的稀土硝酸盐乙醇溶液。将稀土硝酸盐乙醇溶液与硬脂酸在70 ℃乙醇中混合搅拌回流至均一溶液，在40 min内缓慢逐滴加入119 g/L的NaOH溶液，78 ℃继续回流搅拌30min；然后减压抽滤，水洗2次，再用乙醇洗涤2次，所得滤饼转移至烘箱中在60 ℃条件下干燥12 h，即得白色粉末状稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)。
实例3：
对实例1制备的上转换微弱光检测仪的性能进行研究，首先，先对两台仪器的信噪比进行了比较，如图2所示，图中的a、b分别为上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计在测试空白样品时的噪音图。在同等测试条件下(电压：500 V，激发功率：0.25 W/cm2)，上转换微弱光检测器的基线为一条平直的直线，而荧光分光光度计的基线有明显的抖动，说明上转换微弱光检测仪的检测性能优于荧光分光光度计。
将实例2制得的α相UCNPs配制成0.5 mg/mL的水溶液，β相UCNPs配置成5 μg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用实例1制备的上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，结果如图3所示，其中ΔI为信号值与背景噪音的差值图。在浓度一致、激发功率一致的条件下，上转换微弱光检测仪的检测结果扣除背景噪音后，信号强度依然很高；而荧光分光光度计的检测结果在扣除背景噪音后，信号强度几乎为零。
实例4：
MnO2纳米片的制备：称取1.094 g四甲基氢氧化铵溶于20 mL 3 wt%的双氧水中，将此混合液在15 s内加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O溶液，形成棕色悬浊液。室温下，快速搅拌过夜，使MnCl2•4H2O完全氧化。反应结束后，10000 r/min离心10 min以收集样品，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，60℃真空干燥12小时。将已制备好的MnO2纳米片配置成1 mg/mL的溶液，连续超声10小时，2000 r/min离心10 min取上清液备用。
实例5：
10 μL实例2制得的0.05 mg/mL β相UCNPs水溶液，分别与5 μL~70 μL的1 mg/mL的实例4制备的MnO2纳米片溶液混合，并用超纯水定容至200 μL，室温反应30 min，用实例1制备的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V。以F0为初始荧光，F为加入MnO2纳米片后的荧光，作猝灭率与MnO2体积的变化图，由图5中的a可知，随着MnO2体积的增大，体系的淬灭率不断提高；当MnO2体积为35 μL~70 μL时，体系的淬灭率趋于稳定。因此，本发明选择MnO2的最佳反应体积为35 μL。
实例6：
10 μL 实例2制得的0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL的实例4制备的MnO2纳米片溶液，与20 μL浓度为100 μM的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，室温下反应不同时间，然后用实例1制备的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，如图6，记录不同时间的荧光强度的变化，当反应时间达到20 min时，光强值趋于稳定。因此，本发明选择的最佳反应时间为20 min。
实例7：
10 μL实例2制得的 0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL实例4制备的MnO2纳米片溶液，在以Tris、PBS、PB、HEPES、MOPs、H2O六种溶液作为缓冲体系的UCNPs-MnO2的复合物中加入同等浓度的GSH(25 μM)，室温下反应20 min，然后用实例1制备的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，如图7，记录不同缓冲体系的荧光强度，以水作为缓冲体系时，回复效果最佳。因此，本发明选择的最佳反应缓冲体系为水。
实例8：
10 μL 实例2制得的0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL实例4制备的MnO2纳米片溶液，与20μL不同电解质混合，再加入135 μL的超纯水，室温下反应20 min，然后用实例1制备的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，如图8，在UCNPs-MnO2体系中加入硫酸钠(NaSO4)、葡萄糖(Glu)等物质后，体系的荧光并没有太大变化；加入GSH后，UCNPs的荧光得到恢复，F0-F/F0的比值显著增大，证明本发明所构建的测定方法对GSH具有良好的选择性。
实例9：
10 μL 实例2制得的0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL实例4制备的MnO2纳米片溶液，分别与20 μL不同浓度的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，使GSH的终浓度为0.1 μM ~150 μM。室温反应20 min，然后用实例1制备的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5W/cm2，电压500 V。由图9中a可以看出GSH 的检测范围为0.5~100 μM，并且GSH在0.5~100 μM浓度范围内与UCNPs荧光恢复程度呈良好的线性关系，线性方程为 F=825.61+73.125C (r=0.9980)。F为加入GSH后的UCNPs的光强，C为GSH的浓度，检出限(LOD)为 0.24 μM；由图9中b可以看出，随着GSH大的浓度不断增大，UCNPs的电流越来越强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种上转换微弱光检测仪，包括上半部分的一个样品室（1），其特征是：样品室（1）的底部有检测池，检测池内设有石英窗（2），在样品室（1）内位于石英窗（2）的正上方设有比色皿（3），激光器的探头（4）引入样品室中，使探头（4）的位置与比色皿（3）垂直后固定，在样品室（1）的下方连接有真空室（5），光电倍增管（6）处于真空室（5）中且正对石英窗（2）设置，上转换的荧光通过样品室的底部的比色皿（3）、石英窗（2），再经由光电倍增管（6）收集，传入计算机系统（7），进行数据处理。
2.权利要求1所述的上转换微弱光检测仪用于谷胱甘肽的检测，其特征是：UCNPs水溶液在980 nm激发光照射时，产生肉眼可见的绿色荧光；当加入MnO2纳米片反应一段时间后，二者吸附在一起发生荧光共振能量转移，使UCNPs的绿色荧光猝灭，接着在UCNPs-MnO2体系中加入具有还原性的L-谷胱甘肽(GSH)，MnO2纳米片能被GSH还原成Mn2+，游离出UCNPs，绿色荧光恢复，利用上转换微弱光检测仪光电流的变化，直接用于GSH的测定。
3.根据权利要求2所述的上转换微弱光检测仪用于谷胱甘肽的检测，其特征是：先对上转换微弱光检测仪和Cary Eclipse荧光分光光度计在同等测试条件下电压：500 V，激发功率：0.25 W/cm2的信噪比进行了比较；将α相UCNPs配制成0.5 mg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用权利要求1所述的上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比；将β相UCNPs配置成5 μg/mL的水溶液，在激发功率0.5 W/cm2，电压500 V的条件下分别用权利要求1所述的上转换微弱光检测仪和荧光分光光度计进行检测，通过信号值与背景噪音的差值ΔI进行对比。
4.根据权利要求2或3所述的上转换微弱光检测仪用于谷胱甘肽的检测，其特征是：
α相OA-UCNPs的制备：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 4 mL，十八稀(ODE) 15 mL，已制备好的稀土硬脂酸盐 (Y、Yb、Er) 1 mmol，NaF 20 mmol，回流加热至135~145℃保持30min以脱水脱气，形成澄清液体；然后迅速升温，并将反应温度维持在298~302℃，保持30min；反应结束后，冷却至室温；对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用；
β相OA-UCNPs的制备 ：取一洁净的三颈烧瓶，加入油酸(OA) 12 mL，十八稀(ODE) 8mL，已制备好的稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er) 0.8 mmol，NaF 28 mmol，回流加热至135~145℃保持30 min以脱水脱气，形成澄清液体，然后迅速升温，并将反应温度维持在312~314℃，保持45 min，反应结束后，冷却至室温，对所得产物进行离心(11000 r/min)，离心结束后将其上清液弃去，保留离心沉淀物，并用环己烷、乙醇、蒸馏水对沉淀物清洗数次，70℃真空干燥备用；
无配体的裸上转换纳米粒子(bare-UCNPs)的制备：分别取10 mg α相UCNPs及10 mg β相UCNPs，溶于10 mL的超纯水中，加入适量稀盐酸调节酸度使pH=4，快速搅拌三小时，反应结束后，加入己烷萃取除去游离的油酸，离心收集水相中的上转换纳米粒子，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，获得去除了油酸配体的α相UCNPs和β相UCNPs，真空干燥备用；
上述稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)的制备：0.2 mmol的氧化铒(Er2O3)，2.0 mmol的氧化镱(Yb2O3), 7.8 mmol的氧化钇(Y2O3)置于一烧杯中，加入适量稀硝酸使稀土氧化物溶解，持续加热搅拌至得到稀土硝酸盐固体，自然冷却后加入适量乙醇，密封室温搅拌2 h后得到完全溶解的稀土硝酸盐乙醇溶液，将稀土硝酸盐乙醇溶液与硬脂酸在70 ℃乙醇中混合搅拌回流至均一溶液，在40 min内缓慢逐滴加入119 g/L的NaOH溶液，78 ℃继续回流搅拌30min；然后减压抽滤，水洗2次，再用乙醇洗涤2次，所得滤饼转移至烘箱中在60 ℃条件下干燥12 h，即得白色粉末状稀土硬脂酸盐(Y、Yb、Er)；
MnO2纳米片的制备：称取1.094 g TMA•OH 溶于20 mL 3 wt%的双氧水中，将此混合液在15 s内加入10 mL 0.3 M MnCl2•4H2O溶液，形成棕色悬浊液，室温下，快速搅拌过夜，使MnCl2•4H2O完全氧化，反应结束后，10000 r/min离心10 min以收集样品，并用无水乙醇和超纯水对样品进行清洗，60℃真空干燥12小时，将已制备好的MnO2纳米片配置成1 mg/mL的溶液，连续超声10小时，2000 r/min离心10 min取上清液备用。
5.一种基于上转换微弱光检测器的上转换荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测方法，其特征是：包括如下步骤：10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs水溶液，分别与5 μL~70 μL的1 mg/mL的MnO2纳米片溶液混合，并用超纯水定容至200 μL，室温反应30 min，用权利要求1所述的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，以F0为初始荧光，F为加入MnO2纳米片后的荧光，作猝灭率与MnO2体积的变化图，可得最佳反应体积；10 μL 0.05 mg/mL β相UCNPs、35 μL的MnO2纳米片溶液，分别与20 μL不同浓度的GSH水溶液混合，再加入135 μL的超纯水，使GSH的终浓度为0.1 μM ~150 μM，室温反应20 min，然后用权利要求1所述的上转换微弱光检测仪进行检测，激发功率0.5 W/cm2，电压500 V，通过荧光强度F与GSH浓度的标准曲线进行GSH的测定。
6.根据权利要求5所述的基于上转换微弱光检测器的上转换荧光探针对谷胱甘肽(GSH)的检测方法，其特征是：所使用的MnO2纳米片溶液体积为35 μL，GSH反应时间为20min，反应的缓冲体系为水；所测定GSH的线性范围为0.5~100 μM，最低检测限为0.24 μM。
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