CN113640269A - 一种稀土上转换能量转移纳米传感平台、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稀土上转换能量转移纳米传感平台、构建方法及应用。所述稀土上转换能量转移纳米传感平台包括：氨基修饰的核酸适配体；荧光供体材料，所述核酸适配体的一端共价修饰于所述荧光供体材料表面；以及，荧光受体材料，修饰有核酸适配体的荧光供体材料通过π‑π相互作用组装于所述荧光受体材料表面；其中，所述荧光供体材料为稀土上转换发光材料，所述荧光受体材料为聚多巴胺。本发明采用的荧光受体聚多巴胺具有制备简单、尺寸均匀、水溶性好、荧光淬灭性能优异等优势，可以有效淬灭上转换发光，具有更高的淬灭效率，从而提高检测灵敏度，利用所构建的稀土上转换能量转移纳米传感平台对靶标的检测具有更高的信噪比和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种稀土上转换能量转移纳米传感平台及其构建方法，以及其在靶标检测中的应用，并属于光谱应用技术领域。
背景技术
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer；FRET)是一种将荧光光谱与共振能量转移技术相结合的高灵敏、高空间分辨率、无损伤的均相检测技术。FRET是指荧光供受体在1-10nm范围内，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定重叠时，由于偶极-偶极相互作用，供体激发态能量以非辐射的形式传递给受体。该技术应用于分析化学领域已有40多年，其在自身不断完善的同时，极大地促进了生物医学分析的发展。
但是，作为一种光谱技术，FRET具有一定局限性，例如：荧光供体在紫外-可见光激发下，会导致样本中的背景荧光与散射光干扰；此外，当供体与受体的荧光激发光谱有重叠时，会导致二者同时被激发。为解决上述问题，具有近红外激发特性的稀土上转换发光纳米粒子(UCPs)作为能量供体应用于FRET技术，近红外光激发下，基质中的光学干扰被消除，信噪比或灵敏度得到显著提升。由于UCPs只有表面或距离表面很近的发光中心才容易发生能量转移，有机染料做荧光受体时，能量转移效率通常不高(低于30％)。近些年来，无机纳米受体，如：氧化石墨烯、碳纳米颗粒、纳米金及聚苯胺等，具有很高的摩尔消光系数，能够突破FRET距离限制，极大地淬灭UCPs的发光，提高能量转移效率。然而，这些纳米受体通常或部分存在制备复杂、形貌或尺寸不均匀、胶体不稳定等问题，导致FRET构建过程复杂，检测信号不稳定等问题。
发明内容
本发明的主要目的就是提供一种稀土上转换能量转移纳米传感平台及其构建方法，以克服现有上转换荧光共振能量转移技术存在的部分不足。
本发明的另一目的还在于提供所述稀土上转换能量转移纳米传感平台在靶标检测中的应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种稀土上转换能量转移纳米传感平台，其包括：
氨基修饰的核酸适配体；
荧光供体材料，所述核酸适配体的一端共价修饰于所述荧光供体材料表面；
荧光受体材料，修饰有核酸适配体的荧光供体材料通过π-π相互作用组装于所述荧光受体材料表面；
其中，所述荧光供体材料为稀土上转换发光材料，所述荧光受体材料为聚多巴胺。
进一步地，所述核酸适配体为与靶标分子对应的高亲和性、选定的核酸分子，所述靶标包括抗生素类靶标、霉毒素、生物小分子、蛋白类靶标、银离子等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
本发明实施例还提供了所述稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法，其包括：
提供氨基修饰的核酸适配体；
提供荧光供体材料，并将核酸适配体共价偶联修饰至所述荧光供体材料的表面；
提供荧光受体材料，并将偶联修饰有所述荧光供体材料与所述荧光受体材料混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，从而建立稀土上转换能量转移纳米传感平台。
本发明实施例还提供了所述稀土上转换能量转移纳米传感平台于靶标检测领域中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供的稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法，将核酸适配体共价偶联至荧光供体材料表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体材料与聚多巴胺荧光受体材料混合，因为单链核酸的疏水区域与聚多巴胺表面会发生π-π相互作用自组装，使得荧光供受体距离拉近，发生能量转移以及上转换发光的猝灭，从而构建所述稀土上转换能量转移纳米传感平台。当特异性靶标存在时，靶标分子与适配体亲和力更强，会结合导致构象的变化，从而使得发光体远离聚多巴胺受体，上转换发光得到恢复。由于该技术的激发源为近红外光(980nm)，可以很好的地克服背景荧光、散射光等光学干扰，提高检测灵敏度，能够直接应用于复杂样本基质中靶标高灵敏分析；
2)本发明采用的聚多巴胺荧光受体的制备过程相当简单、尺寸均匀且可调、表面具有丰富的羟基、氨基等功能基团，具有制备简单、尺寸均匀、水溶性好、荧光淬灭性能优异等优势，可以有效淬灭上转换发光，利用所构建的稀土上转换能量转移纳米传感平台对靶标的检测具有更高的信噪比和灵敏度。更为重要的是，与上述纳米受体相比，研究数据表明聚多巴胺的光吸收性能更为优异，相同浓度下，基于聚多巴胺纳米受体的稀土上转换能量转移纳米传感平台将具有更高的淬灭效率，从而提高检测灵敏度。另外，聚多巴胺优异的尺寸均匀性、胶体稳定性和水溶性，可以确保检测信号更加稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中一种稀土上转换能量转移纳米传感平台及氯霉素检测示意图；
图2是本发明实施例1中稀土上转换NaYF4:Yb.Er的透射电子显微(TEM)照片；
图3是本发明实施例1中聚多巴胺纳米颗粒的透射电子显微(TEM)照片；
图4是本发明一典型实施例中不同浓度聚多巴胺纳米颗粒对核酸适配体修饰的上转换发光粒子的荧光淬灭光谱图；
图5是本发明一典型实施例中稀土上转换荧光共振能量转移体系与加入不同浓度氯霉素后引起的上转换荧光恢复光谱图。
具体实施方式
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是：将核酸适配体共价偶联至荧光供体材料表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体材料与所述聚多巴胺荧光受体材料混合，因为单链核酸的疏水区域与聚多巴胺表面会发生π-π相互作用自组装，使得荧光供受体距离拉近，发生能量转移以及上转换发光的猝灭，从而构建所述稀土上转换能量转移纳米传感平台。如下将结合附图对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的一种稀土上转换能量转移纳米传感平台(亦可称为“上转换荧光共振能量转移体系”)包括：
氨基修饰的核酸适配体；
荧光供体材料，所述核酸适配体的一端共价修饰于所述荧光供体材料表面；
荧光受体材料，修饰有核酸适配体的荧光供体材料通过π-π相互作用组装于所述荧光受体材料表面；
其中，所述荧光供体材料为稀土上转换发光材料，所述荧光受体材料为聚多巴胺。
进一步地，所述荧光供体材料为稀土上转换发光纳米粒子，其粒径为20～60nm。
进一步地，所述荧光受体材料为聚多巴胺纳米颗粒，其粒径为50～200nm。
进一步地，所述荧光供体材料与荧光受体材料的质量比为1:1～1:10。
进一步地，所述荧光供体材料与核酸适配体的摩尔比为1000:1～5000:1。
在一些实施例中，所述核酸适配体可以为与任一靶标分子所对应的高亲和性、选定的核酸分子，所述靶标可以为抗生素类靶标(例如氯霉素)、霉毒素(例如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、生物小分子(例如三磷酸腺苷、半胱氨酸等)、蛋白类靶标(例如凝血酶)、银离子等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法，其包括：
提供氨基修饰的核酸适配体；
提供荧光供体材料，并将核酸适配体共价偶联修饰至所述荧光供体材料的表面；
提供荧光受体材料，并将偶联修饰有所述荧光供体材料与所述荧光受体材料混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，从而建立稀土上转换能量转移纳米传感平台。
在一些实施例中，所述构建方法具体包括：
提供第一缓冲溶液，
使所述第一缓冲溶液、荧光供体材料和偶联剂混合，得到第一反应液，并离心收集，得到第一上层液体；
将所述第一上层液体与第二缓冲溶液混合，并加入核酸适配体，得到第二反应液，之后离心收集，得到第二上层液体。
进一步地，所述荧光供体材料与荧光受体材料的质量比为1:1～1:10。
进一步地，所述荧光供体材料与核酸适配体的摩尔比为1000:1～5000:1。
进一步地，所述荧光供体材料与偶联剂的质量比为1～10：2～20。
在一些实施例中，所述构建方法还包括：
将所第二上层液体与所述荧光受体材料混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，从而建立稀土上转换能量转移纳米传感平台。
作为一更典型的实施案例，所述稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法包括如下步骤：
步骤S1：将核酸适配体共价偶联至荧光供体材料表面；
步骤S2：提供一免标记荧光受体材料；
步骤S3：将偶联有核酸适配体的荧光供体材料与所述免标记荧光受体材料进行混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，得到所述稀土上转换能量转移纳米传感平台。
在一些实施例中，步骤S1中将核酸适配体共价偶联至荧光供体材料表面，包括下述步骤：
步骤S1-1：提供第一缓冲溶液；
步骤S1-2：在所述第一缓冲溶液中加入质量份数比例为(1～10)：(2～20)的荧光供体材料和偶联剂，得到第一反应液；
步骤S1-3：离心分离所述第一反应液，收集第一上层液体；
步骤S1-4：将所述第一上层液体添加到第二缓冲溶液中，并加入氨基修饰的核酸适配体(0.5～5OD)，得到第二反应液；
步骤S1-5：离心分离所述第二反应液，获取第二上层液体，并置于4摄氏度冰箱中保存备用。
进一步地，步骤S1中，所述荧光供体材料为稀土上转换发光纳米粒子。
进一步地，步骤S1中，所述核酸适配体可以为任一靶标分子所对应的高亲和性、特定的核酸分子，所述靶标可以为抗生素类靶标(例如氯霉素)、霉毒素(例如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、生物小分子(例如三磷酸腺苷、半胱氨酸等)、蛋白类靶标(例如凝血酶)、银离子(Ag(Ⅰ)离子)等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，步骤S2中，所述荧光受体材料为聚多巴胺纳米颗粒。
进一步地，步骤S1-1中，所述第一缓冲溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液，所述MES缓冲溶液的pH值为4.5～7.0，浓度为10～100mmol/L。
进一步地，步骤S1-2中，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)等，但不限于此。
进一步地，步骤S1-4中，所述第二缓冲溶液为HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液，所述HEPES缓冲溶液的pH值为6.8～9.5，浓度为10～100mmol/L。
在一些实施例中，步骤S2中，所述聚多巴胺纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：
将多巴胺加入到乙醇和水的混合溶剂中，剧烈搅拌，得到第三反应液；
向所述第三反应液中加入浓氨水(体积为上述混合溶剂的0.2～2％)，继续常温搅拌反应24小时，得到第四反应液；
对所述第四反应液进行离心分离，收集底部沉淀物；
将所述沉淀物用纯水洗涤后，再超声分散至水溶液中得到所述聚多巴胺纳米颗粒。
进一步的，所述多巴胺、乙醇与水的质量比为0.01：3：1～0.1：3：1。
综上所述，本发明中采用的聚多巴胺纳米颗粒的制备过程相当简单、尺寸均匀且可调、表面具有丰富的羟基、氨基等功能基团、水溶性优异，具有制备简单、尺寸均匀、水溶性好、荧光淬灭性能优异等优势，可以有效淬灭上转换发光。
更为重要的是，与上述纳米受体相比，研究数据表明聚多巴胺的光吸收性能更为优异，相同浓度下，基于聚多巴胺纳米受体的稀土上转换能量转移纳米传感平台将具有更高的淬灭效率，从而提高检测灵敏度。另外，聚多巴胺优异的尺寸均匀性、胶体稳定性和水溶性，可以确保检测信号更加稳定。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述稀土上转换能量转移纳米传感平台于靶标检测领域中的应用。
进一步地，所述靶标可以为抗生素类靶标(例如氯霉素)、霉毒素(例如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等)、生物小分子(例如三磷酸腺苷等)、重金属离子靶标(例如银离子等)、蛋白类靶标(例如凝血酶)、银离子等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，利用本发明所构建的稀土上转换能量转移纳米传感平台对靶标的检测具有更高的信噪比和灵敏度。
综上，本发明提供的稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法及作用机理在于：
将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体材料与所述聚多巴胺荧光受体材料混合，因为单链核酸的疏水区域与聚多巴胺表面会发生π-π相互作用自组装，使得荧光供受体距离拉近，发生能量转移以及上转换发光的猝灭，从而构建所述基于稀土上转换荧光共振能量转移新技术。当特异性靶标存在时，靶标分子与适配体亲和力更强，会结合导致构象的变化，从而使得发光体远离聚多巴胺受体，上转换发光得到恢复。由于该技术的激发源为近红外光(980nm)，可以很好的地克服背景荧光、散射光等光学干扰，提高检测灵敏度，能够直接应用于复杂样本基质中靶标高灵敏分析。
下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及其抗生素(如：氯霉素)检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)氯霉素核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM)，随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的氯霉素核酸适配体(序列SEQ ID NO:1：5'-NH2-C6-ACT TCA GTGAGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G-3')，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及氯霉素检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为6μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺6μg/ml，然后加入一系列浓度0、2、5、8、10、15、20、30、50nM的氯霉素溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立氯霉素浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现氯霉素浓度在2-30nM具有较好的线性关系，检出限为0.8nM。
实施例2：基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及其食源性毒素(如：黄曲霉毒素b1,AFB1)检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)AFB1核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM)，随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的AFB1核酸适配体(序列SEQ ID NO:2:5'-NH2-C6-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAAGCGGAACTGA-GGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC-3’)，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及AFB1检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为4μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺4μg/ml，然后加入一系列浓度0、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、30nM的AFB1溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立AFB1浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现AFB1浓度在0.2-10nM具有较好的线性关系，检出限为0.036nM。
实施例3：基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及其食源性毒素(如：赭曲霉毒素A,OTA)检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)OTA核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM)，随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的OTA核酸适配体(序列SEQ ID NO:3:5'-NH2-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’)，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及OTA检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为6μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺4μg/ml，然后加入一系列浓度0、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、30nM的OTA溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立AFB1浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现OTA浓度在0.5-20nM具有较好的线性关系，检出限为0.18nM。
实施例4：基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及三磷酸腺苷(ATP)检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)ATP核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM)，随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的ATP核酸适配体(序列SEQ ID NO:4:5'-NH2-C6-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’)，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及ATP检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为6μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺6μg/ml，然后加入一系列浓度0、0.05、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30μM的ATP溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立AFB1浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现ATP浓度在0.2-20μM具有较好的线性关系，检出限为0.04μM。
实施例5：基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及其Ag(I)离子检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)Ag(I)核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM)，随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的Ag(I)核酸适配体(序列SEQ ID NO:5:5'-NH2-C6-CTCTCTTCTCTTCATTTTTCAACACAACACAC-3’)，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及L-Cys检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为8μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺8μg/ml，然后加入一系列浓度0、1、5、10、25、50、75、100、200nM的Ag(I)溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立Ag(I)浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现Ag(I)浓度在5.0-75nM具有较好的线性关系，检出限为2.7nM。
实施例6：基于UCPs-PDA上转换荧光共振能量转移体系的构建及其凝血酶检测分析
(1)稀土上转换发光材料制备与水溶性修饰
以含1mmol Ln(CF3COO)3(Y:Yb:Er＝78:20:2)的水溶液为前驱物，十八烯和油酸为溶剂，磁力搅拌下加热至150℃下反应形成油酸稀土盐，冷却至室温，然后向体系里面加入甲醇(包含：NH4F和NaOH),搅拌0.5h，随后加热到100℃除去甲醇，然后在氩气氛围下，将体系温度升至290℃，反应1.5h,冷却至室温，加入乙醇将沉淀析出，并用乙醇洗涤3次，沉淀即为油溶性的UCPs。随后，称取300mg聚丙烯酸(PAA)，30ml二乙二醇，110度下通氮气，直至PAA溶解，待上述溶液冷却至50C后，加入UCPs 100mg(溶解于8ml甲苯)，然后升到100摄氏度，抽真空，去除甲苯、环己烷，保持30分钟，升温至240度，保持2h。冷却至室温后，离心分离用乙醇洗涤沉淀，即得到水溶性UCPs。
(2)凝血酶核酸适配体与PAA-UCPs的共价偶联
称取5mg PAA-UCPs溶解入1ml MES缓冲溶液(pH.6.1,100mM),随后加入10mgEDC.HCl和15mg Sulfo-NHS活化羧基，常温震荡反应30分钟。随后，用稀NaOH溶液(1M)调节反应液pH至7.4，加入1OD的凝血酶核酸适配体(序列SEQ ID NO:6:5'-NH2-C6-ACGGTTGGTGTGGTTGG-3’)，反应4h后，离心分离，用水洗涤1次，最后保存在HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)，置于4摄氏度冰箱备用。
(3)聚多巴胺纳米受体制备
称取0.2g多巴胺溶解于4ml水中，然后将其快速加入含有浓氨水(1ml)、乙醇(15ml)和水(35ml)的混合溶剂中，剧烈搅拌，常温下反应12小时，然后离心分离，水洗涤3次，溶解于水中置于4摄氏度冰箱备用。
(4)稀土上转换荧光共振能量转移体系的构建及其凝血酶检测应用
平行配置含有UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)的EP管，随后加入0、2、4、6、8、10、15μg/mL的聚多巴胺，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光淬灭光谱，确定最大淬灭效率下的聚多巴胺浓度为10μg/ml。进一步，平行配置含UCPs-核酸适配体偶联物(5μg/mL)、聚多巴胺10μg/ml，然后加入一系列浓度0、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20nM的凝血酶溶液，最后HEPES缓冲(50mM,pH:7.4)定容至1.0ml，充分混合，震荡孵育后，测定上转换荧光恢复光谱，建立凝血酶浓度与UCPs最强发射波长处发光强度间的工作曲线，发现凝血酶浓度在0.2-10nM具有较好的线性关系，检出限为0.037nM。
此外，本案发明人还利用前文所列出的其它原料以及其它工艺条件等替代实施例中的各种原料及相应工艺条件进行了相应试验，所获得的结果基本与实施例相似。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以上述实施例作为代表说明本发明申请优异之处。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院宁波材料技术与工程研究所
<120> 一种稀土上转换能量转移纳米传感平台、构建方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gcatcactac agtcattacg catcgggtaa gcggaactga ggagtgggag gtaaatcgtg 60
tgaagtgctg tccc 74
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ctctcttctc ttcatttttc aacacaacac ac 32
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
acggttggtg tggttgg 17
Claims (10)
1.一种稀土上转换能量转移纳米传感平台，其特征在于，包括：
氨基修饰的核酸适配体；
荧光供体材料，所述核酸适配体的一端共价修饰于所述荧光供体材料表面；
荧光受体材料，修饰有核酸适配体的荧光供体材料通过π-π相互作用组装于所述荧光受体材料表面；
其中，所述荧光供体材料为稀土上转换发光材料，所述荧光受体材料为聚多巴胺。
2.根据权利要求1所述的稀土上转换能量转移纳米传感平台，其特征在于：所述荧光供体材料为稀土上转换发光纳米粒子，其粒径为20～60nm；和/或，所述荧光受体材料为聚多巴胺纳米颗粒，其粒径为50～200nm；和/或，所述荧光供体材料与荧光受体材料的质量比为1:1～1:10；和/或，所述荧光供体材料与核酸适配体的摩尔比为1000:1～5000:1。
3.根据权利要求1所述的稀土上转换能量转移纳米传感平台，其特征在于：所述核酸适配体为与靶标分子对应的高亲和性、选定的核酸分子，所述靶标包括抗生素类靶标、霉毒素、生物小分子、蛋白类靶标、银离子中的任意一种或两种以上的组合，优选的，所述抗生素类靶标包括氯霉素，优选的，所述霉毒素包括黄曲霉毒素和/或赭曲霉毒素，优选的，所述生物小分子包括三磷酸腺苷和/或半胱氨酸，优选的，所述蛋白类靶标包括凝血酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述稀土上转换能量转移纳米传感平台的构建方法，其特征在于，包括：
提供氨基修饰的核酸适配体；
提供荧光供体材料，并将氨基修饰的核酸适配体共价偶联修饰至所述荧光供体材料的表面；
提供荧光受体材料，并将偶联修饰有所述荧光供体材料与所述荧光受体材料混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，从而建立稀土上转换能量转移纳米传感平台。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，具体包括：
提供第一缓冲溶液，
使所述第一缓冲溶液、荧光供体材料和偶联剂混合，得到第一反应液，并离心收集，得到第一上层液体；
将所述第一上层液体与第二缓冲溶液混合，并加入核酸适配体，得到第二反应液，之后离心收集，得到第二上层液体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述荧光供体材料与荧光受体材料的质量比为1:1～1:10；
和/或，所述第一缓冲溶液为2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，所述第一缓冲溶液的pH值为4.5～7.0，浓度为10～100mmol/L；
和/或，所述偶联剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
和/或，所述荧光供体材料与偶联剂的质量比为1～10：2～20；
和/或，所述第二缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，所述第二缓冲溶液的pH值为6.8～9.5，浓度为10～100mmol/L。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括：将所第二上层液体与所述荧光受体材料混合，直至所述荧光供体材料的荧光猝灭，从而建立稀土上转换能量转移纳米传感平台。
8.权利要求1-3中任一项所述稀土上转换能量转移纳米传感平台于靶标检测领域中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述靶标包括抗生素类靶标、霉毒素、生物小分子、蛋白类靶标、银离子中的任意一种或两种以上的组合。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗生素类靶标包括氯霉素；和/或，所述霉毒素包括黄曲霉毒素和/或赭曲霉毒素；和/或，所述生物小分子包括三磷酸腺苷和/或半胱氨酸；和/或，所述蛋白类靶标包括凝血酶。
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- 2021-09-01 CN CN202111018090.3A patent/CN113640269A/zh active Pending
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