CN107083241B - 水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒及其制备和用于检测分析pka的活性和抑制性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒(HAP‑NPs)及其制备和用于检测分析PKA的活性和抑制性的方法；HAP‑NPs的制备是以钙盐和磷酸盐为原料通过水热反应得到，通过HAP‑NPs构建生物分子探针，利用蛋白激酶PKA催化三磷酸腺苷ATP生成ADP和磷酸根，且磷酸根转移到含有丝氨酸的多肽上，使多肽的特定位点发生了磷酸化，磷酸化多肽与HAP‑NPs中的Ca2+结合可以使HAP‑NPs发生荧光猝灭的原理，可以实现蛋白激酶PKA及抑制性的分析检测，具有灵敏度高，稳定性好，操作简单、成本低等优点，可以推广应用。

Description

水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒及其制备和用于检测分析 PKA的活性和抑制性的方法
技术领域
本发明涉及一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒，特别涉及一种及蛋白激酶PKA利用水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒构建的生物传感器用于检测PKA活性及抑制性的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
常见的荧光纳米材料包括金属纳簇、量子点、上转换材料等，由于其粒径小，比表面积大而被广泛应用在医学诊断和治疗中，其中掺杂了镧系元素(Eu3+,Tb3+, Yb3+,Er3+等)或者有机染料的羟基磷灰石纳米颗粒是一种常见的荧光探针，它具有高的光稳定性，窄的光发射带和长的荧光寿命。HAP-NPs其密度和人类的牙齿和骨头相近，它是一种无机矿物质，具有良好的生物相容性，有利于骨组织生长等优点而被认为是一种最具潜力的人体硬组织替换材料。但是掺杂了镧系元素的 HAP-NPs具有毒性，限制了其在人体内的应用，因此发展一种自发荧光的HAP-NPs 是十分有必要的。
蛋白激酶在生命过程中调节细胞各项功能时起到了十分关键的作用，在500 多种已经被编码了的激酶中已有200种被成功证实与人类多种疾病相关，因此构建方便、快捷、精确、灵敏检测蛋白质激酶活性及其抑制剂的方法，对相关重大疾病的了解，诊断以及对以后治疗疾病的药物的开发意义非常重大。
蛋白激酶催化的磷酸化过程为：序列中包含有磷酸化位点的底物蛋白质/底物多肽，在蛋白激酶催化的条件下将ATP的γ磷酸基团转移到底物中特定的位点即氨基酸上(通常是丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸)，大多数的磷酸化过程发生在丝氨酸这一残基位点上，从而使底物蛋白/底物多肽的特定位点产生了磷酸基团，完成磷酸化这一反应过程。通过将蛋白质转化为磷酸化了的蛋白质实现了调节生命体的重要的各项生命活动。能够产生磷酸化的氨基酸残基有很多，但主要是丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)这几种，其中发生反应最有可能的是Ser这种氨基酸。
传统测定蛋白激酶的方法有放射性同位素标记法、表面等离子共振法、质谱法、荧光法和免疫法等，这些检测手段和方法在一定程度上促进了对蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素标记ATP技术，检测方法直接，灵敏度高，但存在放射性污染，不能进行组织标记；免疫法对磷酸化识别抗体的要求较高，专一性不强，费用高。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的第一个目的是在于提供一种水溶性好、荧光强度高、低毒性、较好生物相容性的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒。
本发明的另一个目的是在于提供一种步骤简单、成本低的制备水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的方法。
本发明的第三个目的是在于提供一种基于水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒构建一种灵敏度高、检测下限低、操作简单的生物传感器用于检测分析PKA的活性及其抑制性的方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的制备方法，该方法是在搅拌条件下，将含柠檬酸钠和磷酸盐的溶液II缓慢滴加到pH为8.5～9.5、且含钙盐和聚乙二醇的溶液I中，混合均匀，得到前驱溶液；将所述前驱溶液调节pH值至9～10，并超声分散后，转入反应釜中，在170～200℃进行水热反应，反应液经过冷却，离心处理，调节pH至中性，即得。
优选的方案，所述溶液II中柠檬酸钠的浓度为0.05～0.3mol/L，磷酸盐的浓度为0.03～0.2mol/L。更优选为柠檬酸钠的浓度为0.1～0.2mol/L，磷酸盐的浓度为 0.06～0.12mol/L)
优选的方案，所述溶液I中钙盐的浓度为0.02～0.2mol/L，聚乙二醇的质量为硝酸钙质量的1～10％。更优选为钙盐的浓度为0.08～0.12mol/L，聚乙二醇的质量为硝酸钙质量的4～6％。
优选的方案，所述钙盐和磷酸盐的摩尔比为1.5～2:1；更优选的摩尔比为 1.6～1.7:1。
较优选的方案，所述的磷酸盐为磷酸二氢铵和/或磷酸氢二钠；更优选为磷酸二氢铵。
较优选的方案，所述的钙盐为硝酸钙和/或氯化钙，更优选为硝酸钙。
优选的方案，所述溶液I的滴加速率为0.1～1mL/min；更优选为0.5～1mL/min。
优选的方案，所述超声分散的时间为0.5～1.5h。
优选的方案，所述水热反应的时间为2～3.5h。
优选的方案，所述离心处理的离心速率为3000～5000r/min。
本发明提供了一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒，其由上述制备方法制得。
本发明提供了一种基于水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA 浓度的方法，该方法包括以下步骤：
1)将含ATP、Mg(NO3)2和含丝氨酸多肽的混合溶液与一系列不同浓度的标准PKA溶液分别反应，得到一系列酶反应液；
2)各酶反应液分别与羟基磷灰石荧光纳米颗粒溶液反应，得到一系列待测标准溶液；
3)各待测标准溶液通过荧光仪器检测，得到一系列相应的荧光值；
4)建立标准PKA溶液浓度与荧光值的标准曲线；
5)未知浓度的待测PKA溶液按照1)、2)和3)步骤进行反应和荧光检测，得到荧光值，并依据标准曲线，得到待测PKA溶液的浓度。
优选的方案，所述含ATP、Mg(NO3)2和含丝氨酸多肽的混合溶液中ATP的浓度为0.2～5μM(更优选为0.2～2)，含丝氨酸多肽的浓度为0.1～2.5μM(更优选为 0.1～1μM)，Mg(NO3)2的浓度为0.5～1.5mM。
优选的方案，ATP与含丝氨酸多肽的浓度比为1～3:1；更优选为2:1。
优选的方案，所述一系列不同浓度的标准PKA溶液浓度分别为1U/L、2U/L、 4U/L、6U/L、20U/L、40U/L和50U/L。
优选的方案，步骤1)中的反应温度为35～38℃，反应时间为0.5～1.5h。
优选的方案，步骤2)中的反应温度为0～5℃，反应时间为20～40min。
本发明还提供了一种基于所述水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA抑制性的方法，该方法包括以下步骤：
1)所述含ATP、Mg(NO3)2、含丝氨酸多肽和PKA的混合溶液与一系列不同浓度的PKA抑制剂溶液分别反应，得到一系列酶反应液；
2)各酶反应液分别与羟基磷灰石荧光纳米颗粒溶液反应，得到一系列待测标准溶液；
3)各待测标准溶液通过荧光仪器检测，得到一系列相应的荧光值；
4)建立标准PKA抑制剂溶液浓度与荧光值的S型曲线；
5)未知浓度的待测PKA抑制剂溶液按照1)、2)和3)步骤进行反应和荧光检测，得到荧光值，并依据S型曲线，得到待测PKA抑制剂溶液的浓度。
优选的方案，所述含ATP、Mg(NO3)2、含丝氨酸多肽和PKA的混合溶液中ATP 的浓度为0.2～5μM(更优选为0.2～2μM)，含丝氨酸多肽浓度为0.1～2.5μM(更优选为0.1～1μM)，Mg(NO3)2浓度为0.5～1.5mM，PKA浓度为1～50U/L；ATP与多肽的浓度比为1～3:1。
优选的方案，ATP与含丝氨酸多肽的浓度比为1～3:1(更优选为2:1)。
优选的方案，所述一系列不同浓度的标准PKA抑制剂溶液的浓度分别为0μM、 0.02μM、0.04μM、0.08μM、0.1μM、0.32μM、0.5μM、0.75μM、1μM、2μM、 3μM、3.5μM和4.5μM。
优选的方案，步骤1)中的反应温度为35～38℃，反应时间为0.5～1.5h。
优选的方案，步骤2)中的反应温度为0～5℃，反应时间为20～40min。
本发明的PKA抑制剂为H-89。
本发明的技术方案中检测蛋白质激酶活性的原理根据蛋白激酶PKA可以催化水解三磷酸腺苷ATP生成二磷酸腺苷(ADP)和游离的磷酸根，且磷酸根可以转移到含有丝氨酸的多肽上，使多肽的特定位点发生了磷酸化，磷酸化多肽与 HAP-NPs中的Ca2+结合可以使HAP-NPs发生荧光猝灭，所以通过检测荧光的变化值可以实现的蛋白激酶PKA的定量分析。同样的实验操作条件下，加入蛋白激酶PKA抑制剂H-89，可以抑制蛋白激酶PKA对ATP分子催化水解作用，引起荧光值发生变化，从而可以测定PKA的抑制性。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒具有水溶性好、荧光强度高、低毒性、较好生物相容性，且粒径小而形貌均一的特点，特别适用于用来构建生物分子传感器。水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒可以完全溶于水，且在4℃条件下可以储存1个月以上。
2)本发明的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的制备过程特别简单，反应时间短、效率高，有利于工业化生产。而现有文献中报道的羟基磷灰石的制备需要高温下长达12小时以上，而本发明的技术方案只需进行短时间的水热反应即可合成可以自发荧光的羟基磷灰石。
3)本发明的技术方案中使用羟基磷灰石荧光纳米颗粒作为磷酸化多肽的目标识别探针分子以及信号探针分子，通过磷酸化的多肽可与HAP-NPs上的钙离子结合，导致其荧光猝灭的原理构建灵敏度高、稳定性好的生物传感器。其灵敏度很高，最低检测限为0.5U/LPKA，低于现有文献中报道的其他分析方法，比如基于银纳簇的检测分析PKA(500U/L)，基于量子点的检测分析PKA(9.3U/L)。
附图说明
【图1】为本发明构建的荧光法测定蛋白激酶PKA的活性及抑制性原理图。
【图2】为本发明实施例1中羟基磷灰石的TEM图。
【图3】为本发明实施例1中羟基磷灰石的荧光光谱图。
【图4】和【图5】为本发明实施例2中荧光法测定PKA活性的荧光光谱图。
【图6】为本发明实施例3中不同ATP、含丝氨酸多肽浓度的荧光光谱对比图。不同浓度的ATP(0.2μM，0.5μM，1μM，5μM)和多肽(0.1μM，0.25μM，0.5μM， 1μM，2.5μM)与50U/L PKA反应后的酶反应液，再与HAP-NPs反应的荧光图。
【图7】为本发明实施例4中检测PKA活性的荧光图以及标准曲线，检测范围为 1U/L～50U/L。
【图8】为本发明实施例5中H-89抑制剂检测荧光图。从下到上依次为不同浓度的H-89(0nM，20nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4.5μM)，固定PKA 浓度为50U/mL的酶反应液。内插图为H-89抑制效果图，IC50为0.75μM。
【图9】为本发明实施例6中检测HeLa细胞中PKA活性的曲线图。从左到右为不同浓度的Forskolin(0.075、0.5、5、20、50、100μM)和IBMX(0.15、1、10、 40、100、200μM)。内插图为检测HeLa细胞中PKA活性的荧光图，从上到下 forskolin浓度为0、0.125、5、100μM，IBMX浓度是其两倍。
【图10】为本发明实施例7中选择性柱图。从左到右分别为50U/L PKA，50U/L ADH，50U/L BACE1，50U/L GOx，10nm GSH。
具体实施方式
下面列举实施方式对本发明进行进一步具体描述，但本发明的保护范围不限于以下实例。
荧光仪器型号F-7000(Hitachi，Japan)，荧光参数设置：Ex＝340，Emissionspectra from 360to 600，Scan speed＝1200nm/min，EX Slit＝10，Em Slit＝5，PMTVoltage＝400V。
1)本发明的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的具体制备方法：用20mL二次水溶解2mmol硝酸钙、4wt％聚乙二醇2000(PEG2000)(相对硝酸钙的质量)，储存在100mL的锥形瓶中，用氨水将溶液的pH值调为9，标记为溶液II；用15 mL二次水溶解2mmol柠檬酸钠、1.197mmol磷酸氢二铵，储存在50mL锥形瓶中，标记为溶液I；用注射器以0.5mL/min的滴速将溶液I滴入溶液II中，并且在搅拌器上剧烈的搅拌，溶液I和溶液II全部混合以后，再次滴加氨水将pH值调节到10，继续搅拌20min，然后将混合溶液超声1h，得到前驱体溶液；将混浊液倒入水热合成反应釜并置于电热鼓风干燥箱中，调节反应温度为180℃，水热反应3h后取出，自然冷却至室温，在4000r/min的转速下离心10min，用二次水清洗至pH值为中性，得到白色胶状沉淀物，将白色胶状沉淀物再次分散在二次水中，储存在4℃中备用。
2)本发明的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒构建生物传感器过程中对ATP 和含丝氨酸多肽的浓度优化过程：固定ATP与多肽的摩尔浓度比为2:1，配置不同浓度的ATP(0.2、0.5、1、2、5μM)，不同浓度多肽(0.1、0.25、0.5、1、2.5 μM)与50U/L PKA，1mM Mg(NO3)2在37℃水浴1h，取水浴后的酶反应液各50 μL与50μL的HAP-NPs在4℃下混合震荡35min，然后根据以上参数测定荧光值。
3)测定蛋白激酶PKA的活性。分别取PKA浓度为1、2、4、6、20、40、50 U/L和1μM ATP、0.5μM多肽、1mM Mg(NO3)2在37℃的水浴中反应1小时，再与HAP-NPs混合，根据以上参数，测样品的荧光，将荧光变化值大小与酶浓度做标准曲线。
4)测定蛋白激酶PKA抑制剂H-89的活性。取浓度分别为0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.32、0.5、0.75、1、2、3、3.5、4.5μM H-89与50U/L PKA、1μM ATP、 0.5μM多肽、1mMMg(NO3)2在37℃的水浴中反应1小时，加入50μL HAP-NPs，在4℃下振荡35min，然后以相同的试验参数测荧光，测定H-89的半数抑制浓度IC50为0.75μM。
5)应用于HeLa细胞中PKA活性的检测。用含有10％的牛胎儿血清，1％的双抗(5％盘尼西林和5％链霉素)的RPMI 1640培养液培养细胞，并将细胞放置在37℃，含有5％二氧化碳的潮湿的培养箱中。用Forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)和IBMX(磷酸二酯酶抑制剂)刺激细胞前，用不含血清的培养液培养4h，进行饥饿处理。用灭菌的PBS(pH 7.4，10mMNaCl)配置不同浓度的Forskolin (0.075、0.5、5、20、50、100μM)和IBMX(0.15、1、10、40、100、200μM)，其中CForskolin：CIBMX＝1：2，加入到HeLa细胞中刺激30min。作为对照，用400μL 的PBS代替刺激物加到细胞中。将刺激后的细胞分装到15mL无菌离心管中，用超声波细胞破碎仪在0℃进行细胞破碎，破碎时间为40min，间隔为3s，频率为 20kHz。为了将细胞膜、细胞壁等杂质除去，高速离心30min(12000r/min，4℃)，得到纯净的细胞裂解物。
实施例1
将HAP溶液10μL滴入铜网上，将铜网放置一夜晾干，用JEM-2100F透射电子显微镜观察其粒径和形貌。
将HAP稀释为原来的1/2倍，振荡35min，测定荧光。
实施例2
为了验证实验的可行性，分别取二次水、0.5μM未磷酸化多肽、0.5μM商业合成的磷酸化多肽各50μL与HAP-NPs 50μL混合，根据以上条件参数测定荧光，观察其荧光值的变化(如图4所示)，可以看到磷酸化多肽会引起明显的荧光猝灭现象。
为了验证水浴后的酶反应液会引起同样的荧光猝灭效果，分别取二次水、没有加入PKA的酶反应液和加入50U/L的PKA酶反应液各50μL与HAP-NPs 50μL 混合，根据以上条件参数测定荧光，观察其荧光值的变化(如图5所示)，可以看到酶催化后的磷酸化多肽也会引起明显的荧光猝灭现象，说明实验可行。
实施例3
为了达到较好的荧光猝灭效果，进行ATP和多肽浓度的优化，固定CATP：C 多肽＝2:1以及CPKA＝50U/L，水浴反应后，与HAP-NPs在4℃下振荡35min，在相同的荧光参数下进行测定。其中当CATP＝1μM，C多肽＝0.5μM时荧光变化值最大，所以选择这个浓度为最优的浓度。
实施例4
分别配制PKA浓度为1、2、4、6、20、40、50U/L的酶反应液，然后与HAP 在4℃振荡反应35min，以同样的参数测定荧光，做标准曲线，得到R2＝0.9957，线性关系很好。
实施例5
为了研究本方法对PKA抑制剂的效果，固定CPKA＝50U/L，将不同浓度的H-89 抑制剂(0nM，20nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4.5μM)加入到酶反应液中，根据以上参数测定荧光，观察其荧光强度的变化。
实施例6
将此方法应用于HeLa细胞中PKA活性的检测。细胞个数为1.65×105mL-1，在浓度逐渐增大的Forskolin(0.075、0.5、5、20、50、100μM)和IBMX(0.15、 1、10、40、100、200μM)细胞刺激物的作用下，HeLa细胞产生浓度逐渐增多的PKA，将细胞裂解液与1μM ATP，0.5μM多肽反应，观察到HAP-NPs的猝灭程度逐渐变大，说明此方法可以应用于细胞中PKA活性的检测分析。
实施例7
验证此方法的选择性，将50U/L PKA替换为50U/L乙醇脱氢酶(ADH)、50 U/Lβ淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE1)、50U/L葡萄糖氧化酶(GOx)、10nm谷胱甘肽(GSH)，可以看出只有PKA酶反应液有猝灭HAP-NPs的效果，ADH、GOx、 BACE1、GSH对HAP-NPs仅有微弱的荧光增强效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
对比实施例1
用20mL二次水溶解2mmol硝酸钙、4wt％聚乙二醇2000(PEG2000)(相对硝酸钙的质量)，储存在100mL的锥形瓶中，标记为溶液II；用15mL二次水溶解2mmol柠檬酸钠、1.197mmol磷酸氢二铵，储存在50mL锥形瓶中，标记为溶液I；用注射器以0.5mL/min的滴速将溶液I滴入溶液II中，并且在搅拌器上剧烈的搅拌，溶液I和溶液II全部混合以后，滴加氨水将pH值调节到10，继续搅拌20min，然后将混合溶液超声1h，得到前驱体溶液；将混浊液倒入水热合成反应釜并置于电热鼓风干燥箱中，调节反应温度为180℃，水热反应3h后取出，自然冷却至室温，在4000r/min的转速下离心10min，用二次水清洗至pH 值为中性，生成了可用肉眼看到的白色沉淀，说明并没有得到纳米级羟基磷灰石颗粒，无法在后续荧光检测中应用。
对比实施例2
用20mL二次水溶解2mmol硝酸钙、4wt％聚乙二醇2000(PEG2000)(相对硝酸钙的质量)，储存在100mL的锥形瓶中，用氨水将溶液的pH值调为9，标记为溶液II；用15mL二次水溶解2mmol柠檬酸钠、1.197mmol磷酸氢二铵，储存在50mL锥形瓶中，标记为溶液I；用注射器以0.5mL/min的滴速将溶液I 滴入溶液II中，并且在搅拌器上剧烈的搅拌，溶液I和溶液II全部混合以后，再次滴加氨水将pH值调节到10，继续搅拌20min，然后将混合溶液超声1h，得到前驱体溶液；将混浊液倒入水热合成反应釜并置于电热鼓风干燥箱中，调节反应温度为180℃，水热反应5h后取出，自然冷却至室温，在4000r/min的转速下离心10min，用二次水清洗至pH值为中性，得到得到肉眼可以看到的白色沉淀物质。说明并没有得到纳米级羟基磷灰石颗粒，无法在后续荧光检测中应用。

Claims (9)

1.一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于：在搅拌条件下，将含柠檬酸钠和磷酸盐的溶液缓慢滴加到pH为8.5~9.5、且含钙盐和聚乙二醇的溶液I中，混合均匀，得到前驱溶液；将所述前驱溶液调节pH值至9~10，并超声分散后，转入反应釜中，在170~200°C进行水热反应2~3.5h，反应液经过冷却，离心处理，调节pH至中性，即得；
所述溶液中柠檬酸钠的浓度为0.05~0.3mol/L，磷酸盐的浓度为0.03~0.2mol/L；所述溶液I中钙盐的浓度为0.02~0.2mol/L，聚乙二醇的质量为钙盐质量的1~10%；
所述钙盐和磷酸盐的摩尔比为1.5~2:1。
2.根据权利要求1所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
所述的磷酸盐为磷酸二氢铵和/或磷酸氢二钠；
所述的钙盐为硝酸钙和/或氯化钙。
3.根据权利要求1~2任一项所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
所述溶液 的滴加速率为0.1~1mL/min；
所述超声分散的时间为0.5~1.5h；
所述离心处理的离心速率为3000~5000 r/min。
4.一种水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒，其特征在于：由权利要求1~3任一项制备方法制得。
5.基于权利要求4所述水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将含ATP、Mg(NO3)2和含丝氨酸多肽的混合溶液与一系列不同浓度的标准PKA溶液分别反应，得到一系列酶反应液；
2）各酶反应液分别与羟基磷灰石荧光纳米颗粒溶液反应，得到一系列待测标准溶液；
3）各待测标准溶液通过荧光仪器检测，得到一系列相应的荧光值；
4）建立标准PKA溶液浓度与荧光值的标准曲线；
5）未知浓度的待测PKA溶液按照1）、2）和3）步骤进行反应和荧光检测，得到荧光值，并依据标准曲线，得出待测PKA溶液的浓度。
6.根据权利要求5所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA浓度的方法，其特征在于：
所述含ATP、Mg(NO3)2和含丝氨酸多肽的混合溶液中ATP的浓度为0.2~5 ，含丝氨酸多肽的浓度为0.1~2.5，Mg(NO3)2的浓度为0.5~1.5 mM；ATP与含丝氨酸多肽的浓度比为1~3:1；
所述一系列不同浓度的标准PKA溶液浓度分别为1 U/L、2 U/L、4 U/L、6 U/L、20 U/L、40 U/L和50 U/L；
步骤1）中的反应温度为35~38℃，反应时间为0.5~1.5h。
7.根据权利要求5所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA浓度的方法，其特征在于：步骤2）中的反应温度为0~5℃，反应时间为20~40min。
8.基于权利要求4所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA抑制性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）含ATP、Mg(NO3)2、含丝氨酸多肽和PKA的混合溶液与一系列不同浓度的PKA抑制剂溶液分别反应，得到一系列酶反应液；
2）各酶反应液分别与羟基磷灰石荧光纳米颗粒溶液反应，得到一系列待测标准溶液；
3）各待测标准溶液通过荧光仪器检测，得到一系列相应的荧光值；
4）建立标准PKA抑制剂溶液浓度与荧光值的S型曲线；
5）未知浓度的待测PKA抑制剂溶液按照1）、2）和3）步骤进行反应和荧光检测，得到荧光值，并依据S型曲线，得到待测PKA抑制剂溶液的浓度。
9.根据权利要求8所述的水溶性羟基磷灰石荧光纳米颗粒检测蛋白激酶PKA抑制性的方法，其特征在于：
所述含ATP、Mg(NO3)2、含丝氨酸多肽和PKA的混合溶液中ATP 的浓度为0.2~5 ，含丝氨酸多肽浓度为0.1~2.5，Mg(NO3)2浓度为0.5~1.5 mM，PKA浓度为1~50 U/L；ATP与多肽的浓度比为1~3:1；
所述一系列不同浓度的标准PKA抑制剂溶液的浓度分别为0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.32、0.5、0.75、1、2、3、3.5和4.5；
步骤1）中的反应温度为35~38℃，反应时间为0.5~1.5h；
步骤2）中的反应温度为0~5℃，反应时间为20~40min。
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