CN113252627B - 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113252627B
CN113252627B CN202110512946.6A CN202110512946A CN113252627B CN 113252627 B CN113252627 B CN 113252627B CN 202110512946 A CN202110512946 A CN 202110512946A CN 113252627 B CN113252627 B CN 113252627B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
probe
layer
nanofluorescent
ape1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110512946.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113252627A (zh
Inventor
翟筠秋
梁光忠
黄方淋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN202110512946.6A priority Critical patent/CN113252627B/zh
Publication of CN113252627A publication Critical patent/CN113252627A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113252627B publication Critical patent/CN113252627B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种DNA链层在检测分子活性中的应用、DNA纳米荧光探针及其制备方法与应用，属于分子检测技术领域。该DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链，其可用于检测分子活性。DNA纳米荧光探针包括上述DNA链层。该探针可在体外对溶液中的目标蛋白APE1进行特异性识别和荧光定量分析，还可以快速进入活细胞，对APE1进行原位荧光成像，并对其在细胞中的分布和活性进行示踪。更重要的是，该DNA纳米荧光探针可以区分低表达APE1的正常细胞和高表达APE1的癌变细胞。本申请提供的该探针的制备方法简单。将该探针在应用时，灵敏度高、特异性强、成本低，可为临床肿瘤早筛和术后预后提供重要的分子信息。

Description

一种DNA链层在检测分子活性中的应用、DNA纳米荧光探针及 其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体而言，涉及一种DNA链层在检测分子活性中的应用、DNA纳米荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
DNA损伤会破坏基因中重要信息的完整性和可及性，从而破坏细胞的生理功能。人体脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)是DNA损伤修复过程中非常重要的一种核酸修复酶。一方面，APE1可以识别DNA链中的脱碱基(AP)位点，切割该位点使DNA链断裂，发挥碱基切除修复功能；另一方面，APE1可以直接或间接调节细胞的氧化还原状态，调控多种转录因子的DNA结合活性。
研究表明，细胞中APE1的表达量和分布水平与癌症的发生发展有直接关系。首先，APE1在多种癌症中过表达，如乳腺癌，非小细胞肺癌，肝癌，膀胱癌等。APE1表达量会随着肿瘤恶化程度的加深而增加，并且APE1表达强度越高预后越差，癌细胞抵抗药物的能力增强，且APE1在血清中的含量也会随着人体的病变发生变化。此外，通常正常细胞中APE1只在细胞核内分布，癌细胞内APE1变成核-质共分布或胞质型分布。核内型分布总是与较好的预后特征相关；胞质型和核-质型表达则与不良的预后因素相关，当细胞质出现APE1强表达时可作为恶性生物学行为的标志。因此APE1可作为肿瘤检测的生物标志物以辅助癌症诊断和治疗。细胞内APE1的表达和分布水平是癌症早期诊断的和预后的生物学指标。由此可见，建立准确、灵敏、定量的APE1检测方法对于癌症的临床诊断和治疗具有重要作用，对于探究APE1在肿瘤转化中的关键作用及分子机制具有重要意义。
目前发展了多种测定APE1的技术，诸如酶联免疫吸附法、液相色谱-质谱联用、凝胶电泳法、免疫染色法、电化学分析法和荧光探针法等。除荧光探针法外，其它方法均是直接以APE1为靶物质进行检测，无法直观地反映其活性大小，而实际上APE1的活性大小才是其作为癌症生物标志物反映机体状况的关键。此外，液相色谱-质谱联用的分析方法要求APE1上所有的N元素用N15进行标记，凝胶电泳法、酶联免疫吸附法、免疫组织化学染色法和电化学分析法在检测时需要加入额外的抗体，且步骤繁琐，目前均无法应用于活细胞。
因此，建立准确、灵敏、特异性好的APE1检测工具十分必要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一包括提供一种DNA链层在检测分子活性中的应用。
本发明的目的之二包括提供一种DNA纳米荧光探针，该探针可以在体外对APE1进行定量，该方法准确可靠、灵敏度高、特异性好，还可以在细胞内定位和追踪不同时空分布的APE1。
本发明的目的之三包括提供一种上述DNA纳米荧光探针的制备方法，该方法简单，易操作。
本发明的目的之四包括提供一种上述DNA纳米荧光探针在分子活性测定中的应用。
本发明的目的之五包括提供一种采用上述DNA纳米荧光探针进行分子活性测定的方法。
本发明的目的之六包括提供一种含有上述DNA纳米荧光探针的试剂盒。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种DNA链层在检测分子活性中的应用，该DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链。
在可选地实施方式中，DNA单链的二级结构中至少包含一段由茎部和环部连接成的茎环结构，脱碱基位点位于茎部与环部的连接处。
在可选地实施方式中，DNA链层用于检测APE1分子。
第二方面，本申请提供一种DNA纳米荧光探针，其包括DNA链层。DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链。
在可选地实施方式中，DNA单链的二级结构中至少包含一段由茎部和环部连接成的茎环结构，脱碱基位点位于茎部与环部的连接处。
在可选的实施方式中，脱碱基位点两侧的DNA链上分别标记有荧光基团和猝灭基团。
在可选地实施方式中，荧光基团和猝灭基团之间的距离不超过15个碱基，且荧光基团和猝灭基团各自距离脱碱基位点至少3个碱基。
在可选地实施方式中，离脱碱基位点5’端最近的T碱基处用于修饰荧光基团，DNA单链的3’端用于修饰生物素。
在可选地实施方式中，DNA单链的序列长度为30-50nt。
在可选地实施方式中，DNA单链的序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列的从5’方向的第20位为脱碱基位点；由脱碱基位点向靠近5’端的方向，第1个T碱基上标记有荧光基团；由脱碱基位点向靠近3’端的方向，第2个T碱基上标记有猝灭基团。
在可选地实施方式中，荧光基团选自JOE、HEX、VIC、ROX、CY3或CY5，猝灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。
在可选地实施方式中，荧光基团为ROX，猝灭基团为BHQ2。
在可选的实施方式中，DNA纳米荧光探针还包括设置于DNA链层内侧的亲和素层。
在可选的实施方式中，DNA纳米荧光探针还包括设置于DNA链层内侧的包覆层，包覆层的制备原料包括二氧化硅纳米材料、二氧化钛纳米材料、碳纳米材料、氧化石墨烯纳米材料和金属纳米材料中的至少一种。
在可选地实施方式中，二氧化硅纳米材料中二氧化硅的表面修饰有羧基。
在可选地实施方式中，二氧化钛纳米材料中二氧化钛的表面修饰有羧基。
在可选地实施方式中，金属纳米材料中的金属包括金或银。
在可选地实施方式中，包覆层的厚度为7.7-11.5nm。
在可选地实施方式中，DNA纳米荧光探针还包括设置于包覆层内侧的磁核。
在可选的实施方式中，磁核为磁性纳米颗粒。
在可选地实施方式中，磁性纳米颗粒包括铁磁性纳米颗粒。
在可选地实施方式中，磁性纳米颗粒的直径为58-77nm。
在可选地实施方式中，DNA纳米荧光探针的总粒径为66-89nm。
第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项的DNA纳米荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将DNA链层制备DNA纳米荧光探针。
在可选的实施方式中，当DNA纳米荧光探针由内至外依次包括磁核、包覆层、亲和素层以及DNA链层且包覆层为表面修饰有羧基的二氧化硅层或二氧化钛层时，DNA纳米荧光探针的制备方法包括以下步骤：于磁核的表面包覆包覆层，并对位于二氧化硅或二氧化钛的表面的羧基进行活化以得到A溶液。
在可选地实施方式中，活化是先将由二氧化硅层或二氧化钛层包覆的磁核超声分散于水中，随后再加入活化剂进行活化。
在可选地实施方式中，由包覆层包覆的磁核超声分散于水中的终浓度为0.5-2mg/mL。
在可选地实施方式中，超声时间不低于10min。
在可选地实施方式中，活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
在可选地实施方式中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的浓度为0.5-2mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1-5mg/mL。
在可选地实施方式中，活化于15-28℃的条件下振荡10-45min。
在可选的实施方式中，DNA纳米荧光探针的制备方法还包括：于二氧化硅层的表面包覆亲和素层。
在可选地实施方式中，包覆亲和素层包括：将A溶液与亲和素混合，除去未反应的物质，获得B溶液。
在可选地实施方式中，A溶液与亲和素混合是于15-28℃的条件下振荡8-12h。
在可选地实施方式中，亲和素的浓度为0.1-1mg/mL，优选为0.1mg/mL。
在可选地实施方式中，B溶液的浓度为0.5-1mg/mL。
在可选地实施方式中，除去未反应的物质是用无酶水洗涤A溶液与亲和素的混合物。优选地，除去未反应的物质是采用磁分离洗涤的方式进行。
在可选地实施方式中，还包括将洗涤后得到的反应物重新分散以获得B溶液。
在可选地实施方式中，重新分散是以超声分散的形式进行，超声分散时间不低于5min。
在可选的实施方式中，DNA纳米荧光探针的制备方法还包括：于亲和素层的表面包覆DNA链层。
在可选地实施方式中，包覆DNA链层包括：将B溶液与生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链混合，于15-28℃的条件下孵育30-120min。
在可选地实施方式中，在与B溶液混合前，先将DNA单链按以下方式进行升温退火处理：90-95℃下孵育30-90s，70-75℃下孵育30-90s，50-55℃下孵育30-90s，25-37℃下孵育10-30min。
在可选地实施方式中，DNA单链的终浓度为0.1-1μmol/L。
在可选地实施方式中，还包括在15-28℃的条件下孵育30-120min后除去未反应的物质，获得DNA纳米荧光探针。
第四方面，本申请提供如前述实施方式任一项的DNA纳米荧光探针在分子活性测定中的应用。
在可选地实施方式中，DNA纳米荧光探针用于检测活细胞中的APE1分子。
第五方面，本申请提供一种分子活性测定的方法，测定过程中使用如前述实施方式任一项的DNA纳米荧光探针。
第六方面，本申请提供一种试剂盒，试剂盒含有如前述实施方式任一项的DNA纳米荧光探针。
本申请的有益效果包括：
本申请首次提出生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链能够用于检测分子活性。并且，本申请还提出了基于上述DNA单链的DNA纳米荧光探针，可使APE1水解该单链DNA的效率提高20-50倍，达到与双链DNA相同的水解效率。该单链DNA会与靶分子APE1发生特异性的分子识别反应，导致单链DNA上的AP位点被水解，DNA链被一分为二，从而使荧光基团发出荧光信号，实现荧光信号的增强和成像检测。该DNA荧光纳米探针具有设计巧妙、结构简单、性能稳定、对APE1选择性好等诸多优点，可作为活细胞内的荧光成像传感器，实现细胞内APE1的特异性成像检测。
该探针的制备方法较为简单。利用上述荧光探针进行生物体内或细胞内APE1的荧光成像，不但能够方便、快捷地实现细胞内APE1的高灵敏、高清晰地荧光成像，同时还具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内APE1的成像检测领域发挥重要作用，同时也为肿瘤细胞荧光成像的基础研究和应用开发提供新的方法和技术。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请中DNA纳米荧光探针的原理示意图；
图2为本申请实施例2中DNA纳米荧光探针测定不同浓度APE1的荧光强度-时间工作曲线；
图3为本申请实施例3中不同核酸酶对DNA纳米荧光探针选择性的测定结果；
图4为本申请实施例4和5中DNA纳米荧光探针在MCF-7细胞内的共聚焦荧光显微镜观察结果图；
图5为本申请实施例6中DNA纳米荧光探针在正常细胞LO2和癌细胞MCF-7内的共聚焦荧光显微镜观察结果图；
图6为本申请实施例7中不同浓度DNA纳米荧光探针对细胞活力的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的DNA链层在检测分子活性中的应用、DNA纳米荧光探针及其制备方法与应用进行具体说明。
本申请首次提出了DNA链层在检测分子活性中的应用，该DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链。该DNA单链的二级结构中至少包含一段由茎部和环部连接成的茎环结构，脱碱基位点位于茎部与环部的连接处。
目前，对APE1进行定量测定的DNA探针均为双链DNA形成，还未有单链DNA形成的相应探针。值得说明的是，不同数量的DNA链、不同的链长以及DNA链上所具有的碱基情况等均会对检测结果产生直接影响。发明人通过在该领域长期研究，创造性地提出了一种以DNA单链形成的荧光探针，APE1水解该单链DNA的效率提高20-50倍，达到与双链DNA相同的水解效率。
具体地，上述DNA纳米荧光探针包括上述提到的DNA链层。此外，其还可含有磁核、包覆层和亲和素层。可参照地，DNA纳米荧光探针可包括由内到外设置的磁核、包覆层、亲和素层和DNA链层。
其中，磁核为磁性纳米颗粒。在本申请中，其作用包括：第一，快速分离；第二，其作为载体，在磁场的作用下，能够快速进入细胞(具体的，其它的纳米颗粒进入细胞需12h左右，而本申请中具有磁性的纳米颗粒进入细胞仅需30min左右)。
在可选地实施方式中，磁性纳米颗粒包括铁磁性纳米颗粒(如磁性四氧化三铁纳米粒子或γ-三氧化二铁纳米粒子等)、金纳米粒子、NaMF4:Yb/Ln上转换纳米粒子(M为Y或Gd，Ln为Er或Tm)、量子点等纳米粒子。磁性纳米颗粒的直径可设置为58-77nm，该范围下更易进入细胞。
包覆层在本申请中主要用于与亲和素共价连接，其具有较优的生物相容性。在磁核与亲和素层之间设置包覆层一方面有利于防止磁核聚集，另一方面有利于使DNA能够完整地进入细胞且具有较低毒性。
可参考地，包覆层的厚度可以为7.7-11.5nm，如7.7nm、8nm、9nm、10nm、11nm或11.5nm等。该厚度下，一方面更容易修饰亲和素，另一方面，具有更佳的生物相容性，并能改善磁核易聚集的问题，使其得以更好地分散。
本申请中，包覆层的制备原料可包括二氧化硅纳米材料、二氧化钛纳米材料、碳纳米材料、氧化石墨烯纳米材料和金属纳米材料中的至少一种。其中，二氧化硅纳米材料中二氧化硅以及二氧化钛纳米材料中二氧化钛的表面均修饰有羧基，以与亲和素的表面蛋白所含的氨基进行共价连接。金属纳米材料中的金属包括金或银。
亲和素层由亲合素形成，亲合素蛋白(AVD)可特异性结合APE1，亲和素与生物素结合可形成生物分子间牢固的结合体系，有利于抵抗有机溶剂、表面活性剂以及其他环境或条件的影响。
DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点(AP位点)的DNA单链，脱碱基位点两侧的DNA链上分别标记有荧光基团和猝灭基团。当单链DNA与靶分子APE1发生特异性的分子识别反应后，单链DNA上的AP位点被水解，DNA链被一分为二，从而使荧光基团发出荧光信号，实现荧光信号的增强和成像检测。
上述DNA链层生物素化的目的是形成亲和力大、特异性强且极为稳定的生物素-亲和素系统，从而将DNA连接到纳米颗粒上。上述生物素化可直接通过在DNA单链的3’末端修饰生物素实现。
在可选地实施方式中，本申请中DNA单链的序列长度为30-50nt，优选40nt。值得说明的是，DNA单链的序列长度低于30nt或超过60nt后所产生的效果会明显降低，与预期效果相差甚远。
在一些优选地实施方式中，荧光基团和猝灭基团之间的距离不超过15个碱基，距离超过15个碱基后容易导致猝灭基团起不到猝灭效果。较佳地，荧光基团和猝灭基团各自距离脱碱基位点至少3个碱基，若距离少于3个碱基会影响空位的识别。在可选地实施方式中，离脱碱基位点5’端最近的T碱基处用于修饰荧光基团。
在优选地实施方式中，DNA单链的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CGCTAGTACGTCTCGTGAGXCGTTCACTGCGCACGCTCCA-3’，其中，SEQ ID NO.1所示序列的从5’方向的第20位为脱碱基位点，也即上述序列中的X表示脱碱基位点；由脱碱基位点向靠近5’端的方向，第1个T碱基上标记有荧光基团；由脱碱基位点向靠近3’端的方向，第2个T碱基上标记有猝灭基团。
值得说明的是，本申请中经荧光基团和猝灭基团均标记在T碱基上，可获得较高的稳定性，效果更佳，而标记在其它碱基如C碱基会导致荧光基团易降解，且纯度不高。
可参考地，上述荧光基团可以但不仅限于选自JOE、HEX、VIC、ROX、CY3或CY5，猝灭基团可以但不仅限于选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。在可选地实施方式中，荧光基团为ROX，猝灭基团为BHQ2。
可参考地，上述DNA纳米荧光探针的总粒径可以为66-89nm，该粒径下易于快速进入细胞，响应时间短。
承上，本申请提出的基于单链DNA的纳米荧光探针是将含有AP位点的单链DNA与硅包磁纳米颗粒相结合，通过生物素-亲和素系统的高亲和力结合形成DNA纳米荧光探针。DNA纳米荧光探针在没有靶酶APE1时，由于荧光基团和猝灭基团相距不超过15个碱基(例如7个碱基)，荧光被很好地猝灭；而在靶酶APE1存在时，组装在硅包磁纳米颗粒表面的单链DNA会与靶分子APE1发生特异性的分子识别反应，导致单链DNA上的AP位点被水解，DNA链被一分为二，从而使荧光基团发出荧光信号，实现荧光信号的增强和成像检测。其原理可参照图1。
该DNA荧光纳米探针具有设计巧妙、结构简单、性能稳定、对APE1选择性好等诸多优点，可作为活细胞内的荧光成像传感器，实现细胞内APE1的特异性成像检测。
此外，本申请还提供了上述DNA纳米荧光探针的制备方法，可包括以下步骤：将DNA链层制备DNA纳米荧光探针。
当DNA纳米荧光探针由内至外依次包括磁核、包覆层、亲和素层以及DNA链层且包覆层为表面修饰有羧基的二氧化硅层或二氧化钛层时，DNA纳米荧光探针的制备方法包括以下步骤：于磁核的表面包覆包覆层，并对位于二氧化硅层中二氧化硅的表面或二氧化钛层中二氧化钛的表面的羧基进行活化以得到A溶液。
其中，活化是先将由二氧化硅层或二氧化钛层包覆的磁核超声分散于水中，随后再加入活化剂进行活化。
在可选地实施方式中，由二氧化硅壳层或二氧化钛层包覆的磁核超声分散于水中的终浓度可以为0.5-2mg/mL，如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL等。超声时间优选不低于10min，如10min、15min、20min或25min等。
在可选地实施方式中，活化剂例如可包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，此外，也可包括其它具有类似作用的活化剂。
在使用时，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的浓度可以为0.5-2mg/mL，如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度可以为1-5mg/mL，如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL等。
在可选地实施方式中，活化可以于15-28℃(可理解为室温)的条件下振荡10-45min，如10min、15min、20min、30min、40min或45min等。
进一步地，于包覆层的表面包覆亲和素层。
在可选地实施方式中，包覆亲和素层包括：将A溶液与亲和素混合，除去未反应的物质，获得B溶液。
在可选地实施方式中，A溶液与亲和素混合可以于15-28℃的条件下振荡8-12h，如8h、10h或12h等。
可参考地，亲和素的浓度可以为0.1-1mg/mL，如0.1mg/mL、0.5mg/mL或1mg/mL等，优选为0.1mg/mL。B溶液的浓度可以为0.5-1mg/mL，如0.5mg/mL、0.8mg/mL或1mg/mL等。
上述过程中，除去未反应的物质可以是用无酶水洗涤A溶液与亲和素的混合物。可参考地，除去未反应的物质是采用磁分离洗涤的方式进行。
随后，还包括将洗涤后得到的反应物重新分散以获得B溶液。重新分散可以是以超声分散的形式进行，超声分散时间优选不低于5min。
进一步地，于亲和素层的表面包覆DNA链层。
在可选地实施方式中，包覆DNA链层包括：将B溶液与生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链混合，于15-28℃的条件下孵育30-120min，如30min、60min、90min或120min等。
较佳地，在与B溶液混合前，先将DNA单链按以下方式进行升温退火处理：90-95℃下孵育30-90s，70-75℃下孵育30-90s，50-55℃下孵育30-90s，25-37℃下孵育10-30min。
在可选地实施方式中，DNA单链的终浓度为0.1-1μmol/L，如0.1μmol/L、0.5μmol/L或1μmol/L等。
进一步地，在15-28℃的条件下孵育30-120min后除去未反应的物质，获得DNA纳米荧光探针。其中，除去未反应的物质也可通过磁分离并洗涤的方式进行。进一步地，可将上述DNA纳米荧光探针重新超声分散在PBS溶液中，若不立即使用，优选置于4℃的条件下保存。
值得说明的是，本申请未公开的制备过程或工艺可参照现有技术，在此不做过多赘述。
此外，本申请还提供了上述DNA纳米荧光探针在分子活性测定中的应用，例如可用于检测活细胞中的APE1分子。可参照地，DNA纳米荧光探针可用于体外APE1酶活性的定量测定以及活细胞内APE1的荧光成像等。
利用本申请提出的荧光传感器进行生物体内或细胞内APE1的荧光成像，不但能够方便、快捷地实现细胞内APE1的高灵敏、高清晰地荧光成像，同时还具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内APE1的成像检测领域发挥重要作用，同时也为肿瘤细胞荧光成像的基础研究和应用开发提供新的方法和技术。
此外，本申请还提供一种分子活性测定的方法，测定过程中使用上述DNA纳米荧光探针。值得说明的是，具体的测定步骤和工艺可参照现有技术，在此不做过多赘述。
进一步地，本申请还提供了一种试剂盒，其含有上述DNA纳米荧光探针，试剂盒的其它成分在此不做过多限定，当然，可参照现有技术中的相应成分进行设置。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种DNA纳米荧光探针，其由内向外依次包括磁核、二氧化硅层、亲和素层和DNA链层。该DNA纳米荧光探针的总粒径为80nm。
其中，磁核为直径为60nm的磁性四氧化三铁纳米颗粒，二氧化硅层的厚度为10nm，其所含的二氧化硅的表面带有羧基。亲和素层由亲合素形成。
DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链，该DNA单链的二级结构中包含一段茎环结构，脱碱基位点位于茎部与环部的连接处。
该DNA单链的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5’-CGCTAGTACGTCTCGTGAGXCGTTCACTGCGCACGCTCCA-3’。
其中，SEQ ID NO.1所示序列的从5’方向的第20位为脱碱基位点，也即X表示脱碱基位点；由脱碱基位点向靠近5’端的方向，第1个T碱基上标记有荧光基团ROX；由脱碱基位点向靠近3’端的方向，第2个T碱基上标记有猝灭基团BHQ2。
该DNA纳米荧光探针的制备方法如下：
1)将羧基修饰的二氧化硅壳层包覆的铁磁性纳米颗粒超声分散在纯水中，分别加入EDC和NHS，室温下震荡反应，作为溶液A。
其中，羧基修饰的二氧化硅壳层包覆的铁磁性纳米颗粒超声分散在纯水中的终浓度为1mg/mL，超声时间为15分钟。EDC的浓度为2mg/mL，NHS的浓度为5mg/mL。EDC和NHS反应时间为30分钟。
2)在溶液A中加入亲和素，室温下震荡反应。磁分离洗涤除去未反应的物质，然后将得到的反应物重新超声分散在纯水中，作为溶液B。
其中，溶液B的浓度为1mg/mL，亲和素的浓度为0.1mg/mL。室温下震荡反应10个小时，超声分散时间为5分钟。
3)在溶液B中加入生物素化的单链DNA，室温下孵育90分钟。磁分离并洗涤，除去未反应的物质，然后将得到的DNA纳米荧光探针重新超声分散在PBS溶液中。
其中，在将生物素化的单链DNA(ssDNA)修饰到纳米颗粒表面上时，先将其进行升温退火(95℃下孵育90s，75℃下孵育90s，50℃下孵育90s，最后在37℃下孵育10min)，然后将ssDNA加入到溶液B中，ss DNA的终浓度为1μM。
将得到的DNA纳米荧光探针置于4℃保存。
实施例2
APE1浓度的测定
在反应缓冲液buffer1.1中，分别加入0.1mg/mL实施例1提供的DNA纳米荧光探针和不同浓度的APE1溶液，立即在实时荧光PCR仪中于37℃对溶液进行实时荧光检测。根据荧光强度随时间的变化曲线得到荧光上升速率，即为该浓度下APE1对纳米探针的水解效率。上述反应均在50μL反应体系中进行，APE1浓度分别为0.2、0.5、1、2、5U/mL，0U/mL作为对照。检测所用仪器为ABI实时荧光PCR仪，检测通道为ROX通道，激发波长为588±10nm，发射波长为608±5nm。
其结果如图2所示，由图2可以看出：DNA纳米荧光探针对APE1响应非常快，1分钟内即可检测到荧光信号，且荧光上升趋势呈现浓度依赖性变化，不加APE1的对照组无荧光响应，只有微弱的背景荧光。此DNA纳米荧光探针可直接对溶液中的APE1活性进行检测，无需其它步骤，而且检测灵敏度较高，0.1mg/mL的DNA纳米荧光探针对APE1的最低检测限即可达到0.2U/mL。
实施例3
DNA纳米荧光探针选择性的研究
在待测核酸酶的反应缓冲液(如表1-2所示)中，加入0.1mg/mL实施例1提供的DNA纳米荧光探针和相应的核酸酶，立即在实时荧光PCR仪中于37℃对溶液进行实时荧光检测。根据荧光强度随时间的变化曲线得到荧光上升速率，即为该核酸酶在反应缓冲液中对DNA纳米荧光探针的水解效率。上述反应均在50μL反应体系中进行，各核酸酶的浓度分别为APE11U/mL、DNase I 1U/mL、Exo I 1U/mL、T5exo 1U/mL、Exo III 1U/mL及Lambdaexo 1U/mL。检测所用仪器为ABI实时荧光PCR仪，检测通道为ROX通道，激发波长为588±10nm，发射波长为608±5nm。实验中所用到的核酸酶及其对应的反应缓冲液成分如表1-1和1-2所示。
表1-1实验涉及到的各种核酸酶的缩写、中文全称
表1-2实验使用的核酸酶反应缓冲液的组成
其结果如图3所示，由图3可以看出：DNA纳米荧光探针对DNaseⅠ溶液(1U/mL)的反应速率仅为APE1溶液(1U/mL)的16％，说明当存在DNaseⅠ时，纳米探针对APE1的选择性非常好。具有3’-5’外切酶活性和AP内切酶活性的ExoⅢ也可以识别并水解DNA上的AP位点，而图3的结果显示纳米探针对ExoⅢ溶液(1U/mL)的反应速率仅为APE1溶液(1U/mL)的15％，表明纳米探针对APE1更加灵敏。对于其它核酸酶，包括ExonucleaseⅠ(ExoⅠ)，LambdaExonuclease(λexo)，T5 Exonuclease(T5 exo)，纳米探针的反应速率更低，甚至ExoⅠ和T5exo检测不到荧光响应。总的来说，在生物样品中常见的酶浓度下，DNA纳米荧光探针对APE1具有很好的选择性，基本不受其它核酸酶的干扰。
实施例4
应用纳米荧光探针研究MCF-7细胞APE1表达水平
将MCF-7细胞以约2×105个细胞/cm2种在20mm有玻底的细胞成像专用培养皿，然后放入培养箱(37摄氏度，5％CO2)中培养让细胞长到70％-80％。将实施例1提供的DNA纳米荧光探针(0.3mg/mL)与无血清DMEM混合并在37摄氏度水浴下预热10分钟。然后用PBS对细胞进行洗涤(3次)，在培养皿中的细胞与含新制备纳米探针的培养基混合放在磁板上磁转染30min，再放于培养箱共孵育分别培养30、60、120及180min。孵育完后，细胞再次用PBS洗涤(3次)，加入700μL稀释好的细胞核染料DAPI进行细胞核染色,室温孵育10min，用PBS洗涤5次，最后加入新鲜培养基进行拍摄。活细胞成像用LSM 800激光扫描共聚焦显微镜的40倍油镜在570/608nm多激光器下观察。
其结果如图4所示，由图4可以看出：随着磁转染结束后孵育时间的增加，MCF-7细胞中的荧光分布的区域增加，荧光强度也增加，且在30分钟时在细胞质中即可观察到微弱的荧光，120分钟时达到最大。这些结果表明，纳米探针可被细胞很快摄取，并被细胞内的APE1识别并水解其上DNA序列中的AP位点，导致细胞内产生荧光。DNA纳米荧光探针在细胞内响应时间短，可通过荧光强度对活细胞中的APE1进行实时原位监测。
实施例5
应用纳米荧光探针研究经药物处理的MCF-7细胞APE1表达水平
将MCF-7细胞以约2×105个细胞/cm2种在20mm有玻底的细胞成像专用培养皿，然后放入培养箱(37摄氏度，5％CO2)中培养让细胞长到80％-90％。然后用PBS洗涤，再往培养皿中分别加入5μM APE1抑制剂7-硝基吲哚-2-羧酸(NCA)和10％，20％APE1激活剂叔丁基过氧化氢(TBHP)与细胞共孵育2小时，再用PBS洗涤3次，加入预热好的含实施例1提供的DNA纳米荧光探针的培养基后放入培养箱中磁转染30min，然后在培养箱中继续孵育2小时。孵育完后，细胞再次用PBS洗涤(3次)，加入700μL稀释好的细胞核染料DAPI进行细胞核染色，室温孵育10min，用PBS洗涤5次，最后加入新鲜培养基进行拍摄。同时设置一组不加药物处理组作为对照组。活细胞成像用LSM 800激光扫描共聚焦显微镜的40倍油镜在570/608nm多激光器下观察。
其结果如图4所示，由图4可以看出：和不经任何物质处理的对照组相比，随着TBHP处理细胞的用量增加，在MCF-7细胞中可以观察到荧光强度呈现剂量依赖性增加。这是由于叔丁基过氧化氢(TBHP)是一种活性氧发生器，会增加DNA损伤，诱导APE1的过表达，因此经TBHP处理的细胞APE1水平会升高，使得对进入至细胞中的纳米探针上的AP位点进行更快速和彻底的水解。而7-硝基吲哚-2-羧酸(NCA)对细胞APE1活性具有很强的抑制作用，包括AP核酸内切酶，3'-磷酸二酯酶，3'-磷酸酶和3'至5'-核酸外切酶活性。如图4所示，在经5μMNCA处理的细胞中几乎观察不到荧光信号。这是由于细胞内的APE1活性被NCA完全抑制了，无法水解AP位点产生荧光信号。这些结果表明观察到的荧光强度与APE1活性动态相关，DNA纳米荧光探针可以监测出细胞内APE1水平的变化。该纳米探针还可用于在活细胞中原位筛选APE1的激动剂和抑制剂。
实施例6
应用纳米荧光探针区分MCF-7细胞和LO2细胞APE1表达水平
将MCF-7细胞以约2×105个细胞/cm2种在20mm有玻底的细胞成像专用培养皿，然后放入培养箱(37摄氏度，5％CO2)中培养让细胞长到80％-90％。
将LO2细胞以约2×105个细胞/cm2种在20mm有玻底的细胞成像专用培养皿，然后放入培养箱(37摄氏度，5％CO2)中培养让细胞长到80％-90％。将实施例1提供的DNA纳米荧光探针(0.3mg/mL)与无血清DMEM混合并在37摄氏度水浴下预热10分钟。然后用PBS对细胞进行洗涤(3次)，在两个培养皿中的细胞分别与含新制备纳米探针的培养基混合放在磁板上磁转染30min，再放于培养箱中共孵育分别培养30、60、120、180min。孵育完后，细胞再次用PBS洗涤(3次)，加入700μL稀释好的细胞核染料DAPI进行细胞核染色,室温孵育10min，用PBS洗涤5次，最后加入新鲜培养基进行拍摄。活细胞成像用LSM 800激光扫描共聚焦显微镜的40倍油镜在570/608nm多激光器下观察。
其结果如图5所示，由图5可以看出：随着磁转染结束后孵育时间的增加，MCF-7细胞中的荧光分布的区域增加，荧光强度也增加，且在30分钟时在细胞质中即可观察到微弱的荧光，120分钟时达到最大。而在30分钟时在LO2细胞内观察不到荧光信号，同一时间内在LO2细胞内观察到的荧光强度比MCF-7细胞内的弱很多。这是由于相比于正常细胞系(LO2)，APE1在人类癌细胞系(MCF-7)中高表达。这些结果表明，本申请发明的DNA纳米荧光探针可作为高灵敏的诊断探针用以辅助癌症诊断，并可区分表达不同APE1水平的同类型和不同类型的细胞。
实施例7
纳米探针的细胞毒性评价
取一块96孔板，边缘孔用无菌PBS充填，给药孔设置5个复孔，每孔加200μL细胞悬液(每孔5000个细胞)，设置不给药对照组，60、120、180、240、300μg/mL五个纳米探针(纳米探针由实施例1提供)浓度，还设置调零孔(即无细胞，加空白培养基)。将细胞放入培养箱中培养，待贴壁后第二天给药，用空白培养基配成上面的纳米探针浓度，然后放入培养箱中培养24h。然后每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，再放入培养箱培养4h。终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，然后低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD-490nm各孔的吸光度(A值)。根据公式(探针给药组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)计算细胞活力。
其结果如图6所示，由图6可以看出：与空白组相比，添加了60μg/mL的DNA纳米探针的实验组细胞可维持95％的活性，即使纳米探针的浓度增加至300μg/mL，仍有80％细胞保持活性，证明本申请提供的DNA纳米荧光探针的细胞毒性较小，生物相容性好。这些结果表明本申请的DNA纳米荧光探针不会影响细胞活力，它的高生物相容性使其可作为细胞病理学探针用于基于活细胞的癌症诊断。
综上所述，本申请提供的DNA纳米荧光探针可在体外对溶液中的目标蛋白脱碱基核酸内切酶1(APE1)进行特异性识别和荧光定量分析，还可以快速进入活细胞，对APE1进行原位荧光成像，并对其在细胞中的分布和活性进行示踪。更重要的是，该DNA纳米荧光探针可以区分低表达APE1的正常细胞和高表达APE1的癌变细胞。本发明方法灵敏度高、特异性强、成本低，可为临床肿瘤早筛和术后预后提供重要的分子信息。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中医药大学(广州中医药研究院)
<120> 一种DNA链层在检测分子活性中的应用、DNA纳米荧光探针及其制备方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgctagtacg tctcgtgagx cgttcactgc gcacgctcca 40

Claims (28)

1.一种DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述DNA纳米荧光探针包括DNA链层；所述DNA链层为生物素化的含有脱碱基位点的DNA单链；
所述DNA单链的二级结构中至少包含一段由茎部和环部连接成的茎环结构，所述脱碱基位点位于所述茎部与所述环部的连接处；
所述脱碱基位点两侧的DNA链上分别标记有荧光基团和猝灭基团；
所述荧光基团和所述猝灭基团之间的距离不超过15个碱基，且所述荧光基团和所述猝灭基团各自距离所述脱碱基位点至少3个碱基；
离所述脱碱基位点5’端最近的T碱基处用于修饰荧光基团，所述DNA单链的3’端用于修饰生物素；
所述DNA单链的序列长度为30-50nt；
所述DNA单链的序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列的从5’方向的第20位为脱碱基位点；由所述脱碱基位点向靠近5’端的方向，第1个T碱基上标记有荧光基团；由所述脱碱基位点向靠近3’端的方向，第2个T碱基上标记有猝灭基团；
所述DNA纳米荧光探针还包括设置于所述DNA链层内侧的亲和素层；
所述DNA纳米荧光探针还包括设置于所述DNA链层内侧的包覆层，所述包覆层的制备原料包括二氧化硅纳米材料、二氧化钛纳米材料、碳纳米材料、氧化石墨烯纳米材料和金属纳米材料中的至少一种；
所述二氧化硅纳米材料中二氧化硅的表面修饰有羧基；所述二氧化钛纳米材料中二氧化钛的表面修饰有羧基；
所述DNA纳米荧光探针还包括设置于所述包覆层内侧的磁核；所述磁核为磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述荧光基团选自JOE、HEX、VIC、ROX、CY3或CY5，所述猝灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3。
3.根据权利要求2所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述荧光基团为ROX，所述猝灭基团为BHQ2。
4.根据权利要求1所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述金属纳米材料中的金属包括金或银。
5.根据权利要求2所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述包覆层的厚度为7.7-11.5nm。
6.根据权利要求1所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述磁性纳米颗粒包括铁磁性纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的直径为58-77nm。
8.根据权利要求1所述的DNA纳米荧光探针，其特征在于，所述DNA纳米荧光探针的总粒径为66-89nm。
9.如权利要求1所述的DNA纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：于所述磁核的表面包覆所述包覆层，并对位于二氧化硅或二氧化钛的表面的羧基进行活化以得到A溶液；
于所述包覆层的表面包覆所述亲和素层；包覆所述亲和素层包括：将所述A溶液与亲和素混合，除去未反应的物质，获得B溶液；
于所述亲和素层的表面包覆所述DNA链层；包覆所述DNA链层包括：将所述B溶液与生物素化的含有脱碱基位点的所述DNA单链混合，于15-28℃的条件下孵育30-120min；在与所述B溶液混合前，先将所述DNA单链按以下方式进行升温退火处理：90-95℃下孵育30-90s，70-75℃下孵育30-90s，50-55℃下孵育30-90s，25-37℃下孵育10-30min。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，活化是先将由所述二氧化硅层或所述二氧化钛层包覆的磁核超声分散于水中，随后再加入活化剂进行活化。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，由所述包覆层包覆的磁核超声分散于水中的终浓度为0.5-2mg/mL。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，超声时间不低于10min。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的浓度为0.5-2mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1-5mg/mL。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，活化于15-28℃的条件下振荡10-45min。
16.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述A溶液与所述亲和素混合是于15-28℃的条件下振荡8-12h。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述亲和素的浓度为0.1-1mg/mL。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述亲和素的浓度为0.1mg/mL。
19.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述B溶液的浓度为0.5-1mg/mL。
20.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，除去未反应的物质是用无酶水洗涤所述A溶液与所述亲和素的混合物。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，除去未反应的物质是采用磁分离洗涤的方式进行。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，还包括将洗涤后得到的反应物重新分散以获得所述B溶液。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，重新分散是以超声分散的形式进行，超声分散时间不低于5min。
24.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述DNA单链的终浓度为0.1-1μmol/L。
25.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括在15-28℃的条件下孵育30-120min后除去未反应的物质，获得DNA纳米荧光探针。
26.如权利要求1-8任一项所述的DNA纳米荧光探针在检测活细胞中的APE1分子活性中的应用。
27.一种活细胞中的APE1分子活性测定的方法，其特征在于，测定过程中使用如权利要求1-8任一项所述的DNA纳米荧光探针。
28.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1-8任一项所述的DNA纳米荧光探针。
CN202110512946.6A 2021-05-11 2021-05-11 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用 Active CN113252627B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110512946.6A CN113252627B (zh) 2021-05-11 2021-05-11 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110512946.6A CN113252627B (zh) 2021-05-11 2021-05-11 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113252627A CN113252627A (zh) 2021-08-13
CN113252627B true CN113252627B (zh) 2024-02-27

Family

ID=77222757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110512946.6A Active CN113252627B (zh) 2021-05-11 2021-05-11 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113252627B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637470A (zh) * 2021-08-24 2021-11-12 青岛科技大学 一种比率型荧光探针及其制备方法和应用
CN114942334A (zh) * 2022-07-04 2022-08-26 复旦大学 一种可用于肿瘤早期诊断的磁纳米传感器的制备方法及应用
CN117230189B (zh) * 2023-07-19 2024-04-30 大湾区大学(筹) 一种树状dna探针及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220431A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 中国药科大学 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法
CN106497978A (zh) * 2016-09-08 2017-03-15 北京大学 一种磁性复合纳米颗粒及其制备方法和应用
CN109439735A (zh) * 2018-11-06 2019-03-08 江苏集萃分子工程研究院有限公司 一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220431A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 中国药科大学 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法
CN106497978A (zh) * 2016-09-08 2017-03-15 北京大学 一种磁性复合纳米颗粒及其制备方法和应用
CN109439735A (zh) * 2018-11-06 2019-03-08 江苏集萃分子工程研究院有限公司 一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A specific DNA-nanoprobe for tracking the activities of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in living cells;Junqiu Zhai 等;《Nucleic Acids Research》;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113252627A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113252627B (zh) 一种dna链层在检测分子活性中的应用、dna纳米荧光探针及其制备方法与应用
Hutter et al. Gold-nanoparticle-based biosensors for detection of enzyme activity
Fu et al. Electrochemical aptasensor for the detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) based on DNA-templated Ag/Pt bimetallic nanoclusters
Zhuang et al. Construction of AIEgens-based bioprobe with two fluorescent signals for enhanced monitor of extracellular and intracellular telomerase activity
Liu et al. A ratiometric fluorescent strategy for alkaline phosphatase activity assay based on g-C3N4/CoOOH nanohybrid via target-triggered competitive redox reaction
CN109001167B (zh) 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒
Li et al. Electrochemical biosensor for epidermal growth factor receptor detection with peptide ligand
Wu et al. Accelerated DNAzyme-based fluorescent nanoprobe for highly sensitive microRNA detection in live cells
Wang et al. Target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of CRISPR/Cas13a (TITAC-Cas) for detection of alkaline phosphatase
CN109884029B (zh) 银/石墨烯量子点纳米酶、sers检测试剂盒及应用
CN106957908A (zh) miRNA和/或具有核酸适配体的靶标分子的检测方法及检测探针
Zhang et al. Plasmonic biosensor for the highly sensitive detection of microRNA-21 via the chemical etching of gold nanorods under a dark-field microscope
CN110468181A (zh) 一种双重扩增法检测dna或蛋白质的方法
CN111118004A (zh) 一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用
Yu et al. An all-in-one telomerase assay based on CRISPR-Cas12a trans-cleavage while telomere synthesis
Yan et al. A DNA-mediated crosslinking strategy to enhance cellular delivery and sensor performance of protein spherical nucleic acids
CN106932564A (zh) 基于fret用于检测样品中核酸靶标的试剂盒及其应用
Lu et al. Ultrasensitive detection of microRNA-10b through target-triggered catalytic hairpin assembly and upconversion nanoparticles-based luminescence resonance energy transfer
Zhang et al. Detection of HIV-1 ribonuclease H activity in single-cell by using RNA mimics green fluorescent protein based biosensor
Wang et al. Tracing cellular interaction of circRNA-miRNA axis with Cu metal-organic framework supported DNA cascade assembly
CN114107510A (zh) 基于dna三链介导构建多维dna酶矩阵的超灵敏循环核酸检测体系、试剂盒和方法
Lv et al. Aptamer based strategy for cytosensing and evaluation of HER-3 on the surface of MCF-7 cells by using the signal amplification of nucleic acid-functionalized nanocrystals
Tong et al. Fluorometric determination of RNase H via a DNAzyme conjugated to reduced graphene oxide, and its application to screening for inhibitors and activators
CN108265055A (zh) 特异性结合人乳腺癌细胞mcf-7的dna核酸适配体及其应用
Zhang et al. Live-cell imaging of survivin mRNA by using a dual-color surface-cross-linked nanoquencher

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant