CN111549096A - 一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶a活性的方法 - Google Patents

一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶a活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分子检测技术领域，具体公开了一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，包括：1)将已知活性的蛋白激酶A与对应的荧光标记多肽底物进行磷酸化反应，再加入碳纳米颗粒水溶液得到混合体系，检测混合体系的荧光强度并绘制蛋白激酶A活性与荧光强度的标准曲线；2)检测待测蛋白激酶A的荧光强度，根据标准曲线即可定量分析待测蛋白激酶A的活性。同时，本发明方法还可应用于蛋白激酶A抑制剂的筛选。本发明利用带有负电荷的水溶性的羧基碳纳米颗粒与带正电荷的肽段静电结合从而检测蛋白激酶A活性，该检测体系简单便捷、反应灵敏、特异性高且成本低，非常适合大规模推广应用。

Description

一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法。
背景技术
蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，能够调节细胞内大多数蛋白的功能。而蛋白激酶A(PKA)，又称依赖于cAMP的蛋白激酶A，是激发底物磷酸化的酶，PKA的功能是将三磷酸腺苷(ATP)上的磷酸基团转移到底物蛋白特定的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上进行磷酸化，被蛋白激酶磷酸化的蛋白质可以调节靶蛋白的活性。它在细胞内信号转导和细胞功能调节(包括细胞生长、存活分化和代谢)中起着关键作用。PKA的异常表达与许多疾病有关，比如糖尿病、阿尔茨海默病和癌症。因此，研究PKA的活性对相关疾病的诊断和潜在治疗药物的开发具有重要意义。
目前，传统的检测PKA的方法是采用γ-32P标记ATP的放射性测定和利用抗体特异性识别的免疫测定。尽管大多数实验室中常规采用上述方法分析蛋白激酶的活性，但上述方法不但操作繁琐、需要昂贵的试剂或仪器，还存在安全性问题。
为了克服上述问题，基于荧光、发光、电化学或质谱的各种技术已经被广泛地提出并用于PKA的测定，例如，公开号为CN104849448A的专利申请文献公开了一种基于荧光猝灭的蛋白激酶活性分析方法以及公开号为CN106248663A的专利申请文献公开了一种基于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性的方法。但是，其中仍然存在方法复杂或者再现性低的问题。因此需要发展一种更简单、灵敏度更高的检测PKA活性的方法。
碳纳米颗粒(carbon nanoparticles,CNPs)是一种新兴的碳纳米材料，它具有无毒、良好的生物相容性等优点被广泛关注。由于碳纳米颗粒同时具有碳材料性质和纳米尺寸效应，与具有平面结构的染料分子作用较强，并且可以通过电子能量或能量转移等过程引起荧光淬灭，因此，碳纳米颗粒作为纳米淬灭剂用于构建生物分子的传感体系中。目前基于碳纳米颗粒荧光体系的研究，主要集中在碳纳米颗粒与适配体的相互作用上，碳纳米颗粒与肽段相互作用的研究尚未报道。
发明内容
本发明采用微波消解法合成了带有负电荷的水溶性的羧基碳纳米颗粒，其与带正电荷的肽段静电结合从而提供了一种检测蛋白激酶A活性的方法，进一步提高了检测的灵敏度。
本发明公开了一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，包括如下步骤：
(1)将已知活性的蛋白激酶A与去对应的荧光标记多肽底物进行磷酸化反应，再加入碳纳米颗粒水溶液(CNPs)得到混合体系，检测混合体系的荧光强度并绘制蛋白激酶A活性与荧光强度的标准曲线；
(2)检测待测蛋白激酶A的荧光强度，根据标准曲线即可定量分析待测蛋白激酶A的活性。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为Cys-Gly-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu。本发明选择特殊设计的肽(CGGLSARRL)作为蛋白激酶敏感底物，研究表明，在蛋白激酶和ATP同时存在下，该多肽可以在丝氨酸残基上发生磷酸化作用。
具体而言，首先合成了含有核心底物的荧光素标记肽，然后荧光标记的肽与CNPs的通过静电相互作用形成自组装体系。结果，荧光标记肽的荧光被CNPs淬灭。然而，当ATP和PKA同时存在时，底物肽被磷酸化后，含有两个负电荷的磷酸基团被引入肽中，导致肽的净电荷为零。磷酸化肽与CNPs之间的静电相互作用弱于未磷酸化肽与CNPs之间的静电相互作用。因此，CNPs和荧光素之间的荧光共振能量转移被破坏，从而导致荧光增强。基于此，实现PKA活性的检测。
本发明所述的荧光标记多肽底物为利用FAM、FITC等荧光团标记的肽段。
本发明所述混合体系中碳纳米颗粒的浓度为20-40μg/mL，浓度进一步优选为25-30μg/mL。这是由于实验表明优选浓度的碳纳米颗粒就可以使体系的荧光强度大大降低。
本发明所述碳纳米颗粒通过碳灰与氧化物水溶液混合升温进行微波反应，最后离心分离后制得。所述方法制得的碳纳米颗粒的粒径为20～70nm。
优选地，所述的微波反应的功率为400～600W。
优选地，所述升温的程序为：先升温至90～110℃反应8～12min，再升温至150～170℃反应25～35min。
步骤(1)中，加入碳纳米颗粒水溶液后的反应时间为1～20min。
步骤(1)中，加入ATP溶液进行磷酸化反应，所述ATP溶液的浓度为30～60μmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用带有负电荷的水溶性的羧基碳纳米颗粒与带正电荷的肽段静电结合，从而用于检测蛋白激酶A活性以及用于筛选蛋白激酶A抑制剂。本发明的检测体系简单便捷、反应灵敏、特异性高且成本低，非常适合大规模推广应用。
附图说明
图1为未氧化碳灰(a)和氧化后碳纳米颗粒(b)的水溶性对比照片；
图2为氧化后碳纳米颗粒的TEM图；
图3为氧化后碳纳米颗粒的SEM图；
图4为氧化后碳纳米颗粒的尺寸分布图；
图5为氧化后碳纳米颗粒的红外光谱图；
图6为不同反应体系的荧光光谱图，其中，a和b为添加碳纳米颗粒前后的S-pep，c和d为添加碳纳米颗粒前后的P-pep；
图7为S-pep在不同反应体系中的荧光光谱图；
图8为S-pep在不同浓度碳纳米颗粒作用下的荧光光谱图，右上角为体系荧光强度随碳纳米颗粒浓度变化的曲线图；
图9为体系荧光强度随碳纳米颗粒作用时间变化的曲线图；
图10为体系相对荧光强度(F/F0)随ATP浓度变化的曲线图；
图11中A为荧光强度随PKA活性变化的荧光光谱图，图11中B为相对荧光强度(F/F0)随PKA活性变化的曲线图；
图12为相对荧光强度(F/F0)随PKA活性变化的线性图；
图13为相对荧光强度(F/F0)随PKA抑制剂H-89活性变化的曲线图；
图14为不同种类酶对体系相对荧光强度(F/F0)的影响图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1：制备水溶性碳纳米颗粒
采用微波反应法制备：分别称取10mg干燥的碳灰(蜡烛燃烧所得)置于多个10mL微波反应器中，再加入10mL 30％硝酸，微波反应功率为500W。采用程序升温的反应进行微波反应(100℃反应10min，160℃反应30min)。将反应液倒入10mL离心管内离心，离心分成两层，上层是黄色液体，下层是黑色固体，去掉上层液体后再加入二次水混匀再离心4min(4000r/min)去掉上层液体，如此反复5次(尽可能除去残留的硝酸)既得氧化后碳纳米颗粒。
对制得的氧化后碳纳米颗粒进行如下表征：
图1为未氧化碳灰和氧化后碳纳米颗粒的水溶性对比图，图1a表明蜡烛燃烧所得的碳灰完全不溶于水，图1b则表明氧化后碳纳米颗粒在水中有很好的溶解度。这是由于一方面未氧化的碳纳米颗粒交联在一起较大而不溶于水，另一方面由于蜡烛燃烧得到的碳灰具有疏水性，而其通过硝酸氧化后外表面基团改变，产生了许多的亲水性的基团(主要是羧基和羟基增多)，所以在水中分散效果很好。
对氧化后碳纳米颗粒进行TEM和SEM表征，由图2和图3可知，经硝酸氧化处理后的碳纳米颗粒分散比较均一。进一步对扫描电镜成像图进行计数统计，得到所述氧化后碳纳米颗粒的尺寸分布图如图4所示，表明得到的氧化后碳纳米颗粒的尺寸分布范围为20～70nm，其中大多数尺寸大小为30nm。再测定氧化后碳纳米颗粒的电动电势为-35.4mV，这说明了氧化后碳纳米颗粒上带负电的基团增多，这是由于碳纳米颗粒通过氧化产生了羧基和羟基等负电基团。
通过分析红外光谱确定所述氧化后碳纳米颗粒中的化学基团，如图5所示的红外光谱图显示了氧化后碳纳米颗粒的红外吸收强度，1630cm-1处的红外吸收峰被归结于氧化碳纳米颗粒上-COOH中C＝O的伸缩振动，而3426cm-1处既强又宽的近红外线则归结于氧化碳纳米颗粒上-COOH中-OH的伸缩振动，1109cm-1处的近红外线归结于氧化碳纳米颗粒上-COOH中C-O的伸缩振动，进一步说明了氧化后碳纳米颗粒表面的羧基基团增加。
实施例2:可行性分析
为了验证本发明方法的可行性，检测了不同反应体系的荧光强度，具体的荧光光谱图如图6所示。由图6可知，当体系中没有碳纳米颗粒时，FAM标记的未磷酸化的多肽底物S-pep(由上海生工生物公司提供，多肽的氨基酸序列为CGGLSARRL)和FAM标记的磷酸化的多肽底物P-pep具有很强的荧光强度，且几乎没有差别(如曲线a和c所示)；当体系中存在猝灭剂碳纳米颗粒时，由于S-pep和P-pep所带的电荷不同，碳纳米颗粒对它们的静电作用不同，所以体系的荧光强度差别很大(如曲线b和d所示)。基于此，本发明构建的荧光检测方法从原理上能够实现PKA的荧光检测。
进一步考察S-pep在不同体系中的荧光强度，具体的荧光光谱图如图7所示。由图7可知，碳纳米颗粒可以很好的猝灭S-pep的荧光(如曲线a和b所示)；体系中加入ATP或PKA时，荧光变化很小，几乎不变(如曲线c和d所示)；当ATP和PKA同时存在时，体系荧光显著增强(如曲线e所示)。由此可知，本发明的体系能够很好的实现PKA的荧光检测。
实施例3：实验条件优化
(一)碳纳米颗粒作为淬灭剂的用量：
S-pep在不同浓度碳纳米颗粒下的荧光光谱图如图8所示，由图8可知，当不添加碳纳米颗粒时，体系的荧光强度较强，随着碳纳米颗粒用量的增加，体系的荧光强度迅速降至最低并达到一个平台，当碳纳米颗粒用量达到25μg/mL时，体系的荧光强度降低大概85％，这表明碳纳米颗粒与S-pep之间有相互作用，碳纳米颗粒可以淬灭FAM的荧光，这是由于碳纳米颗粒与FAM之间的电子转移引起的。
(二)碳纳米颗粒的吸附时间：
加入碳纳米颗粒后，体系的荧光强度随时间的变化曲线如图9所示，由图9可知，加入碳纳米颗粒后，体系的荧光强度迅速的降至最低后保持不变，大概需要1分钟的时间。这说明碳纳米颗粒对FAM-pep的吸附作用是一个很快的过程。为了使体系的荧光降至最低并达到一个稳定状态，我们选择加入碳纳米颗粒的反应时间为5分钟。
(三)ATP浓度：
体系的荧光强度随ATP用量的变化曲线如图10所示，由图10可知，随着ATP浓度的增加，体系的相对荧光强度(F/F0，其中F0指未加入ATP时体系的荧光强度，F指加入ATP后体系的荧光强度)逐渐增强后保持不变，因此，我们选择40μmol/L作为最佳ATP浓度。
实施例4：荧光检测PKA活性
(1)制备肽段储备液：称取1mg的FAM-CGGLSARRL(S-pep)粉末于离心管中，溶于1550μL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.5,50mM KCl,10mM MgCl2)中，超声1分钟，得到储备液浓度为0.5mM。然后吸取该溶液20μL，稀释到1mL，得到10μM的肽段储备液，最后将溶液用锡箔纸包住，避光保存。
(2)制备ATP储备液：称取50mg ATP，加入10mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.5,50mM KCl,10mM MgCl2)，超声1分钟，得到10mM ATP储备液，备用。
(3)制备碳纳米颗粒储备液：称取10.0mg实施例1制得的碳纳米颗粒，加入10mLTris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.5,50mM KCl,10mM MgCl2)，超声1分钟，使之形成均匀的黑色透明溶液，得到1mg mL-1的碳纳米颗粒储备液，备用。
(4)检测PKA活性：在2mL的离心管里加入10μL 10μM肽段储备液，再加入353μL ATP储备液，混合均匀后加入不同浓度(0、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL、2.5U/mL、3.0U/mL)的PKA溶液，反应体系于37℃孵育1h，再加入250μL 0.1mg/mL碳纳米颗粒储备液。最后，整个溶液体系用Tris-HCl定容至1mL，全部反应溶液转移到1cm光程的石英样品池，在F-2500型荧光光谱仪上测定PKA在体系中的荧光光谱(λex/em＝490/520nm)，从而得到相对荧光强度F/F0与PKA浓度的线性方程，按照上述步骤测定待测PKA对应的相对荧光强度即可实现PKA活性的定量分析。
不同浓度的PKA对荧光体系的荧光响应如图11所示，由图11A可知，当不添加PKA时，体系具有低的荧光背景，然而当加入PKA后，在同样的条件下，体系的荧光强度随PKA浓度的增大而逐渐增强，这是由于PKA与S-pep反应生成磷酸化肽段，改变了底物的电荷性质，从而使碳纳米颗粒对磷酸化肽段具有弱的吸附作用，引起体系荧光强度的增强。另外，由图11B可知，当PKA的浓度达到2U/mL时，体系的荧光强度基本不变。另外，将只含有S-pep的溶液中加入不同浓度的PKA作为对照实验，结果表明，当体系中没有碳纳米颗粒时，加入PKA前后体系的荧光强度不发生变化，这表明碳纳米颗粒在构建传感体系的过程中起着非常重要的作用。
进一步绘制相对荧光强度F/F0与PKA浓度的线性图，具体见图12，由图12可知，相对荧光强度F/F0与PKA浓度成较好的线性关系，线性方程为F/F0＝0.6329[PKA](U/mL)+1.0387(R2＝0.9913)，线性范围0.4-1.8U/mL。PKA的检测限(3S/m，S是试剂空白的标准偏差，n＝11，m是线性方程中的斜率)为0.04U/mL。由此可知，我们建立的方法具有较好的灵敏度。
此外，本发明碳纳米颗粒-肽传感体系的构建方法如下：将10μL 10μM的肽段溶液中加入50μL 0.1mg mL-1的碳纳米颗粒溶液，然后用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.5,50mMKCl,10mM MgCl2)缓冲液补加到总体积为1mL。
实施例5：荧光检测PKA抑制剂活性
根据同样的原理，实施例4所述的蛋PKA活性分析方法同样适用于PKA抑制剂活性检测，下面通过PKA有效抑制剂H-89进行验证实验。实验步骤基本与实施例4一致，除了将不同浓度的PKA溶液替换为不同浓度的(0、0.05μmol/L、0.10μmol/L、0.15μmol/L、0.20μmol/L、0.25μmol/L、0.30μmol/L)的H-89，得到了相对荧光强度(F/F0)随H-89活性变化的曲线图如图13所示。
由图13可知，H-89能够有效抑制PKA的活性。在固定PKA浓度的情况下，随着抑制剂H-89浓度的逐渐增加，体系的荧光信号逐渐降低，表明随着抑制剂H-89的增加将会逐渐抑制PKA活性，导致磷酸化的荧光多肽底物逐渐减少，荧光强度逐渐降低。该结果表明本发明方法同样能够应用于蛋白激酶A抑制剂的筛选。
对比例：
为了评价上述荧光体系对PKA荧光响应的选择性，本发明比较了该体系与各种常见酶的反应，进行对比测试的酶具体包括：凝血酶(thrombin)、胰蛋白酶(trypsin)、羧酸酯酶(carboxylesterase)、葡萄糖脱氢酶(glucose oxidase)以及尿素酶(urease)。在上述实施例4所述的含碳纳米颗粒的体系中加入该对比酶溶液，得到的不同种类的酶在本发明体系中的相对荧光强度(F/F0)，结果见图14。
由图14可知，对比酶几乎对体系没有荧光响应，但是PKA对体系却有明显的荧光响应，说明该体系对PKA表现出高的选择性。这是由于PKA与底物特异性反应引起的，而其它的酶均不能与底物发生磷酸化反应。
综上所述，本发明构建了一种基于碳纳米材料的荧光传感体系，可以定量的检测蛋白激酶A，且该体系具有简单、灵敏、特异性高、成本低等优点。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Gly Gly Leu Ser Ala Arg Arg Leu
1 5

Claims (9)

1.一种基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，包括如下步骤：
(1)将已知活性的蛋白激酶A与对应的荧光标记多肽底物进行磷酸化反应，再加入碳纳米颗粒水溶液得到混合体系，检测混合体系的荧光强度并绘制蛋白激酶A活性与荧光强度的标准曲线；
(2)检测待测蛋白激酶A的荧光强度，根据标准曲线即可定量分析待测蛋白激酶A的活性。
2.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为Cys-Gly-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu。
3.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述混合体系中碳纳米颗粒的浓度为20～40μg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述的碳纳米颗粒的粒径为20～70nm。
5.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述碳纳米颗粒通过碳灰与氧化物水溶液混合升温进行微波反应，最后离心分离后制得。
6.根据权利要求5所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述的微波反应的功率为400～600W。
7.根据权利要求5所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，所述升温的程序为：先升温至90～110℃反应8～12min，再升温至150～170℃反应25～35min。
8.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入碳纳米颗粒水溶液后的反应时间为1～20min。
9.根据权利要求1所述的基于碳纳米材料荧光检测蛋白激酶A活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入ATP溶液进行磷酸化反应，所述ATP溶液的浓度为30～60μmol/L。
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